日本血吸虫虫卵抗原对实验性脑脊髓炎的干预研究

日本血吸虫虫卵抗原对实验性脑脊髓炎的干预研究 日本血吸虫虫卵抗原对实验性脑脊髓炎的 干预研究 中国神经精神疾病杂志2006年第32卷第4期 脱髓鞘改变j.Veronica等"进一步研究发现,饥饿可以降低 EAE动物血清leptin水平,减轻疾病的严重程度和下调致病性 Thl细胞反应,使用0b-R阻抗剂可以阻止leptin与CIMTh细胞 上分布的ob-R结合,从而抑制T细胞活化.在SLE,IDDM等动 物模型中,也发现饥饿,减少能量摄取或增加不饱和脂肪酸摄取 均能阻止疾病的发生发展.本研究发现,leptin与MS患者EDSS 评分相关性(P<0.01).但此结果与Kokona等的报道略有不 同,在Kokoma等的研究中未发现血清leptin水平与EDSS评分相 关.研究结果的差异可能与种族,地理分布及遗传异质性等有 关,有待进一步探讨.全体女性患者Leprin水平高于男性(P< 0.01),是否为女性易患MS的一个因素,尚需进一步研究. 本研究还发现经过糖皮质激素治疗后,血清leptin水平明显 降低(P<0.O1),且完全缓解组降低更加显着(P<0.O1),提示 leptin水平的降低可能是激素的一个作用机制.leptin水平似乎 能够判定MS患者对激素治疗的敏感性和治疗效果.有报道降 低血清leptin已经成功预防和治疗EAE动物,通过药物抑制ob 基因表达,能够降低体内leptin水平,减缓自身免疫疾病进程…, 这些报道更加鼓励我们对二者进行研究,以期进一步了解MS的 发病机制,为其治疗寻找新的途径. 参考文献 1ChitnisT,KhourySJ.Roleofcostimulatorypathwaysimthepathogene— sisofmultiplesclerosisandecperimentalautoimmuneencephalomyeli— tis.HAllergyClinlmmuno1.2003,112(5):837. 2PoserCM,PatyDW,ScheinbergL,eta1.Newdiagnosticcriteriafor multiplesclerosis:guidelinesforresearchprotocols.Annneurol,1983, 13(3):227. 341 3KurzkeJF.Ratingneurologicalimpairmentinmultiplesclerosis:allex— panddisabilitystatus(EDSS).Neurology,1983,33(6):1444. 4ZhangY,ProcncaTk,MaffeiM,dta1.Positionalcloingofthemouse obesegeneanditshumanhomologue.Nature,1994,372(6505):425. 5Zarkesh—EsfahaniH.PockleyG,MetcalfeRA.eta1.High—doselepti— nactivateshumanleukocytesviareceptorexpressiononmonocytes.1m— manol,2001,167(8):4593. 6MatareseG,SannaV,DiGiacomoA,eta1.Leptinpotentiatesexperi— mentalautoimmuneencephalomyelitisinSJLfemalemiceandconfers susceptibilitytomales.EurJlmmunol,2001,31(5):1324. 7KokonaCh,panagiotisP,EuthymiaG,eta1.1eptinanditssolublere- ceptorinplRsmaofpatientssufferingfromremitting—relapsingmultiple sclerosis.JoumalofAutoimmunijty,2004,23(2):169. 8LordGM.MatareseG.HowardJK,eta1.1eptinmodulatetheT—cellim— maneresponseandreverse$starvation-induces Nature,1998,394(6696):897. 9PetersonJW.BoL.MorkS,eta1.Vcam-1一positivemicrogliatargetoli— goolendrocytesattheborderofmultiplesclerosislesios.JNeuropathol ExpNeurol,2002,61(6):539. 10VeronicaS,AntonioD,AntonioL,eta1.1eptinsurgeprecedesonsetof autoimmuneencephalomyelitisandcorrelateswithdevelopmentof pathogenicTcellresponses.JClinInvest,2003,111(2):241. 11HarrisSG,PadillaJ.KoumasL,eta1.Prostaglandinsasmodulatorsof immunity.Trendslmmunol,2002,23(3):144. (收稿日期:2006—02—26) (责任编辑:丰岩清) ? 论着? 日本血吸虫虫卵抗原对实验性脑脊髓炎的干预研究? 倪健强'董万利蒋建华张金涛尹岭 【摘要】目的利用日本血吸虫虫卵抗原(SEA)来干预实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型,试图探讨寄生虫感染与 EAE的关系.方法利用血吸虫虫卵抗原干预EAE小鼠,观察行为学和病理改变.同时取不同抗原刺激的淋巴结细胞培养,ELISA 法测定上清IL一4,IFN一.y的含量.结果用SEA不同时问段干预EAE,发现可以减轻EAE的发病程度,但在延缓和阻止发病方面 作用不明显,并在行为学和病理学上得到证实.而用SEA和PIJP.体外刺激联合免疫后小鼠的淋巴结细胞,发现SEA刺激后可 以升高IL一4,降低IFN—y,而PIJP刺激则相反.在单用PIJP免疫和联合免疫相比较中,发现PIJP.体外再刺激后联合 免疫组细胞分泌IFN一.y降低,IL一4升高.结论SEA可以减轻EAE的发病程度.细胞因子在寄生虫感染影响EAE的发病中起了 重要的作用,调节Thl/Th2平衡,纠正体内Thl偏移是寄生虫抗原能够调节EAE发病的原因之一. 【关键词】实验性自身免疫性脑脊髓炎抗原日本血吸虫细胞因子干预 【中图分类号】R74_4.5l【文献标识码】A 江苏省卫生厅医学科技发展基金资助重大课题(编号 H200302) 苏州大学附一院神经内科(苏州215006) 解放军总医院神经信息中心 日本血吸虫虫卵抗原(schistosomaJapaneseeggAntigen. SEA)是一种大分子寄生虫抗原,可以诱导Th0细胞分化成成熟 的Tld细胞,分泌IL一4升高,IFN一^y降低,引起体内Thl/Th2平 342 衡偏移….中枢神经系统自身免疫疾病多发性硬化(multiple scelerosiSTMS)被认为也与Thl/Th2失衡有关.研究运用日本 血吸虫虫卵抗原干预实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis,EAE)的发生,从发生机制上探讨 其对MS的潜在意义. 1材料与方法 1.1实验动物及模型制备全部选用8,12周龄的雌性sJL/ J小鼠(由美国Jackson实验室提供).将100IxLPLP.水溶液 (含PIJP150)与100IxL福氏免疫佐剂(含结核杆菌 H37Ra40Olag)混合,充分乳化制成抗原配剂.第1天给予sJL/J 小鼠上腹部皮下注射0.2mL的抗原配剂,第1天和第3天给予 尾静脉注射0,6×10/mL百日咳杆菌. 1.2方法 1,2,1SEA干预将小鼠分为3组,每组20只.第1组为EAE 对照组;第2组为SEA预处理组,即在诱导EAE前1个月内进行 SEA(购自江苏省血吸虫防治研究所)的基础免疫,即制备前1个 月分别予以腹部皮下注射SEAIO0L(含SEAIO0g)+CFA50 L的混合物(第1周),SEA50IxL(含SEA50lag)加IFA50 的混合物(第3周),SEA50(含SEA50lag)加IFA50的混 合物(第4周),共计3次;第3组为EAE实验组,在诱发EAE的同 时进行SEA的注射,予以每鼠腹部皮下注射SEAIO0IxL(含SEA 100lag)加CFA50L的混合物. 1.2.2神经功能评分免疫当日及免疫后所有动物,每日进 行神经功能评分并称重:0,不发病;1,尾部张力降低或轻度步态 笨拙;2,尾部无张力,和/或中度步态异常,和/或姿态维持缺乏; 3,肢体力弱;4,肢体瘫痪;5,濒死状态. 1.2.3组织病理学检查观察终点取诱发后第28天.依次 予以左心室灌注生理盐水100mL和含4%多聚甲醛的缓冲液 100mL,而后取脑和脊髓固定在0.1kg/L福尔马林缓冲液中,石 蜡包埋连续切片,片厚5um,37?烤干,间隔进行HE.和Luxol FastBlue(LFB)染色. 1.2.4SEA干预后细胞因子的检测分为2组,1组为对照组, 仅予以PLPm.一种抗原的免疫,即后足垫注射100LPLP. 水溶液(含PIJP.150)与100IxL完全福氏佐剂的混合物 (每足0.1mL);另1组为实验组,同时予以两种抗原的免疫,即 另在后足垫上注射100IxLSEA水溶液(含SEA100I,Lg)与CFA 100IxL的混合物.在第8天颈椎脱臼处死后无菌取出肿大的腹 股沟淋巴结,200目网筛内研磨得淋巴结细胞.用含10%(体积 分数)胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素的RP. MI1640培养液调制细胞浓度为2×10/mL,接种于24孔培养板 中,每孔为500IxL,然后根据不同的组别进行不同的抗原刺激. 对照组小鼠淋巴结细胞按3个组别进行抗原刺激:?阴性对照组: 每孔再加人5OORPMI1640基础液;?阳性对照组:每孔加人 ConA(0.5雌_/L)10IxL,另每孔再加人490LRPMI1640基础液; ~PEP..刺激组:每孔加人PLP..(0.5雌_/L)10L,另每孔 ChinJNervMentDisVo1.32,No.4Jul 再加入490uLRPMII640基础液.实验组小鼠淋巴结细胞另加一 个实验组:SEA刺激组:每孔加人SEA(0.5峙/ixL)40L,另每孔 再加人460ixLRPMI1640基础液.每组均设复孔,置5%CO孵箱 中,37~C孵育48h后,无菌条件下提取细胞上清,使用ELISA试剂 盒测定IL一4,IFN一含量. 1.3统计学分析数据分析使用统计软件SPSS11.5.所得数 据用均数?标准差(哥?s)来表示,组间差异的显着性分析用均 数的t检验.所得数据间差别以P值表示,检验水准d=0.05,均 为双侧检验. 2结果 2.1SEA对EAE行为学和组织学影响 2.1.1行为学3组小鼠60只,有56只在免疫后8,12天内发 病,平均发病时间为(9?1.7)天,发病动物主要表现为不活泼, 进食少,体重减轻,皮毛不光滑,多见尾巴下垂无力和双后肢瘫, 少数出现四肢瘫或单肢瘫.行为学评分发现,3组小鼠在发病时 间(达到1分的时间)上1,3组无差别(P=0,979),2组迟于1组 (P=0.021),同样达到发病高峰的时间上1,3组无差别(P= 0.973),2组仍迟于1组(P=0.001)在发病严重程度上,第1组 小鼠(EAE对照组)较2,3组严重(P=0.012,P=0.0O2),而2,3 组之间发病高峰值无差别(P=0.998).(见图1) 2.1.2在体重方面,与正常对照相比较[28天内正常等龄雌性 同种小鼠增加(5.75?0.46)g],3组小鼠体重增加均降低,其中 第1组28天内体重增加(1.2?2.06)g(P=0.000),第2组增加 (3.25?1.83)g(P=0.001),第3组增加(3.83?0.41)g(P= 0.013).就增幅而言,第1组体重较2,3组增幅降低明显(P= 0.010,P:0.ooo),而2,3组增幅相差不大(P=0.772).见图2. 4.0 3.5 3.0 2.5 鑫2.0 1.5 1.0 05 0 2468l01214l6l82022242628 天数 _?-EAE对照组+SEA预处理组+SEA+PLP同时免疫组 图1日本血吸虫虫卵抗原干预对EAE小鼠行为学评分的影响 2.1.3病理组织检查HE.染色切片检查发现可有明显的炎性 细胞浸润,袖套现象以及卫星现象,从累及部位而言,大脑,小脑, 脑干,脊髓均可有累及,以白质为主.LFB染色示局部区域可见 脱髓鞘现象.不论从病灶数和严重程度方面观察,SEA处理组 (2,3组)较对照组(第1组)减轻,符合其行为学观测结果.(见 图3,7) 青神疾病杂志2006年第32卷第4期 干预EAE后对细胞因子的影响 对PLP,免疫的小鼠淋巴结细胞分泌IL一4的影 由图8可见,用PLP,刺激经PLP和SEA同时免疫 j胞产生IL一4高于仅用PLP.免疫后淋巴结细胞 P=0.002).针对两种抗原联合免疫后得到的淋巴结 再次激发产生IL一4含量高于PLP,激发组(P= l47l0l3l6l9222528 天数 卜EAE对照组+SEA预处理组 卜SEA+PLP同时免疫组+正常对照组 日本血吸虫虫卵抗原干预对EAE小鼠体重的影响 A对PLP..免疫的小鼠淋巴结细胞分泌IFN一^y的 与IL一4分泌的情况不同,用PLP..刺激经联合 结细胞产生IFN一^y低于单用PLP..免疫后小鼠 产生的IFN一^y(P=0.O03).而在针对两种抗原联合 1的淋巴结细胞,SEA再激发后IFN一^y含量低于 .发后的量(P=0.008). 学研究发现,寄生虫进入人体后,由于是细胞外大 引起以体液免疫为主的免疫反应.目前对其干扰人体 不确切,是否可以干预自身免疫病的发病成为共同关 343 心的课题.本研究使用日本血吸虫虫卵抗原(SEA),在体内诱发 类似血吸虫慢性感染的免疫环境,对多发性硬化(MS)的动物模 型进行了有效的干预.通过行为学的观察,发现EAE易感的小 鼠在注射SEA后,在发病,缓解,复发各时间点病情较对照组减 轻,同时各种症状出现的时间也得到了推迟.从病理组织学上 看,SEA干预后的EAE小鼠无论从炎性灶还是从脱髓鞘方面都 比对照组减轻.研究还进行了SEA注射时间的对比,将SEA干 预组分为预先注射SEA(更接近慢性寄生虫感染状态)和发病前 注射SEA两组,发现两组都能减轻EAE的发作程度,但预先使用 SEA一段时间对推迟发病有好处.另一方面,实验用SEA和PLP 两种不同性能的抗原同时免疫小鼠,在其发生免疫反应后(第8 天)提取其肿大的淋巴结细胞,检测代表Thl/Th2反应强度的细 胞因子IFN一^y和IL一4的分泌情况.研究发现,利用SEA干预 后,PLP免疫小鼠体内免疫系统发生了变化,IL一4相应地升高, 而IFN一^y降低,Thl反应较原先减轻了.结果证实SEA减轻 EAE发病程度的主要原因在于通过其致Th2作用,使Thl/Th2平 衡偏移减轻,最终减轻实验性脑脊髓炎小鼠体内的Thl反应. 研究在EAE制备前1个月内给予SEA的基础免疫后,EAE 的发病程度减轻,发病时间得到推迟,之后进行的细胞因子测定 证实Th2反应增强,而Thl反应减弱.过去的研究认为,MS是一 种以细胞免疫为主的自身免疫性疾病,特别是在其发病和复发 阶段,Thl为主的细胞免疫起到的是一个启动和助推的作用, 抑制Thl反应理论上可以阻止MS的发病,但本研究中SEA只能 减轻发病程度,延缓发病,并不能阻止发病.研究中还将SEA在 EAE制备的同时进行注射,发现也能减轻EAE的发病程度,但是 不能改变发病时间.研究者认为结果与SEA注射时间有关,预 期免疫后影响了EAE发病初期的Thl启动反应,延迟了发病时 间和到达高峰的时间;而同时免疫后虽然两者也有相互干扰,但 启动时间相同,干扰只能减轻各自的反应程度,无法改变发病时 程.因此可见,SEA干预可以减轻和减缓EAE的发病程度,预处 理的效果更明显,证实SEA模拟的这种长期慢性寄生虫感染的 免疫环境不利于EAE的诱发,提示这种环境可能抑制MS的发生 和减轻复发的程度.诱发同时予SEA也可减轻EAE的发病程 EAE组:血管袖套形成(HEx200)图4EAE组:脊髓白质脱髓鞘(LFB×loo)图5EAE 组:淋巴细胞浸润(HEx200) 图6SEA处理组:淋巴细胞浸润(HEx200)图7SEA处理组:脊髓白质轻度脱髓鞘 (LFB×loo) 30 25 2O l5 10 5 0PLP免疫组PLP+SEA免疫组 口空白囫ConA目PLP再刺激圈SEA再刺激 图8SEA对PIJP,免疫小鼠淋巴结细胞分泌IL一4的影响 ChinJNervMentDisVo1.32,No.4Jul2OO6 参考文献 1VellaAT.PearceEJ.CD4+Th2ResponseinducedbySchistosoma mansoniEggsDevelopsRapidly,ThroughanEarly,Transient,ThO— likestage.JImmunol,1992,148(7):2283. 2KarpusWJ,RansohoffRM.Chemokineregulationofexperimentalan? toimmuneencephalomylitis:temporalandspaticalexpressionpatterns governdiseasepathogenesis.JImmunol,1998,161(6):2667. 3张金涛,金香兰,朱克,等.髓鞘蛋白脂质蛋白多肽不同抗原决 定簇对实验性自身免疫性脑脊髓炎模型神经功能评分及形态学 改变的影响.中国临床康复2oo5,9(5):70. 4KonoBD,UrbanJL,Ho~athSJ,eta1.TwominordeterminantsofMBP induceEAEinSJI/Lmice.JExpMed,1988,168(1):213. 5赵红如,董万利,王涛,等.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的 磁共振研究.中国神经精神疾病杂志2005,31(5):351. 6PearceEJ,CasparP,GrzychJE,eta1.DownregulationofThlcyto— kineproductionaccompaniesinductionofTh2responsesbyaparasite helminth,schistomamansoni.JExpMed1991,173(1):159. 7周红雨,董为伟.多发性硬化治疗的现状与前景.中国神经精神疾 病杂志,1996,22(3):57. 8KalmanB.AlderH.LublinF.D.CharacteristicsoftheTlymphocytes involvedinexperimentalallergicencephal0myelitis.JNeuroimmuno1. 1995,61(1):107. (收稿日期:2005—09—15) (责任编辑:丰岩清) ? 论着? 以脑卒中症状首发的原发真性红细胞增多症的特点 孟然周晋吉训明李丽敏杨宝峰 【摘要】目的分析以脑卒中为首发症状的原发性真性红细胞增多症(PV)的临床特点.方法将22例以脑卒中首发的原发 性PV患者的临床表现,CT/MRI和实验室检查特点分别与l2例单纯原发PV和30例动脉硬化性脑梗死对比,并对其治疗反应和预 后跟踪评价.结果?单纯PV组平均发病年龄为(34?8.5)岁,肝脾肿大发生率为66.7%(8/12),以脑血管病首发的Pv组的平均 发病年龄为(55?16.5)岁,肝脾肿大发生比例为4/22.?PV继发脑梗死常规治疗中脑梗死复发比例为9/19,单纯动脉硬化脑梗死 组为1/30.?PV继发脑梗死中多发腔隙性脑梗死发生比例为12/19,有4/19合并了颅外其他部位梗死.结论?以脑血管病首 发的PV年龄较大,肝脾肿大可不明显.?PV继发的脑梗死以腔隙性脑梗死最多见.?对治疗中反复发作的脑梗死应排查PV,红 细胞比容应列为常规检查.?PV继发的脑梗死抗血栓常规治疗同时必须对PV治疗,血液稀释的同时放血. 【关键词l原发真性红细胞增多症脑梗死脑出血 【中图分类号】R743.3【文献标识码】A ' 国家科技部十五攻关项目(编号:2004BA714B06一1) 通信作者(E-mail:Jinzhouh85@163.corn) 首都医科大学宣武医院神经内科(北京100053) 一 哈尔滨医科大学第一临床医学院 原发性真性红细胞增多症(polycythemiavel'~l,pc)是一种克 隆性红细胞增多为主的慢性骨髓高增殖低凋亡疾病,人群中的 发病率为5/100万.男性发病率稍高于女性,发病范围l59o 岁,中老年多见,50—60岁高发.临床表现以红细胞增多为主的 两系或三系增多,及由此引起的高粘滞血症,起病缓慢,原发病 ????????? 98765432l