实验二 经口急性毒性LD50测定

实验二 经口急性毒性LD50测定 实验二 经口急性毒性LD50测定 一、试验目的 1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量 2. 掌握小鼠灌胃技术 3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法 二、试验原理 选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。 三、和试剂 1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半 2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、天平、台秤、外科手术剪、镊子 3. 受试物:(敌百虫或克佰威) 4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液 四、实验内容 1. 实验动物称重、编号和随机分组 2. 染毒剂量设计及试剂配制 3. 小鼠灌胃染毒技术 4. 毒性反应的观察及LD50计算 五、试验方法 (一)预实验 1. 探索剂量范围 先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。以次类推，找出Dmin。 2. 剂量分组 一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。在确定组数后，按下列公式计算r。 1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制 配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如 0.5ml/20g)。剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。 (二)正式试验 1. 动物的分组 1.1 区分性别 辨别小鼠性别，并将雌雄动物分开放入不同笼具中。 1.2 称重 称量并记录每只小鼠的体重，要求小鼠体重在20?2g范围内。 1.3 编号 小鼠称重后，立即以染色法编号。用苦味酸酒精饱和溶液(黄色)标记个位数号码，品红(红色)标记十位数号码。一般以头部为1号，按顺时针依次右前肢为2号，右腰为3号，右后肢为4号，尾根部为5号，右后肢为6号，左腰为7号，左前肢为8号，后背为9号，10号为在头部染红色标记，11号在右前肢染红色和黄色标记各一，依次类推。 1.4 分组 从随机数字表上抄录30个随机数字，分别除以6(因为要将动物分成6组)，写下余数。如果被除数小于除数，商数为0，那么被除数即为余数;如果被除数为0，余数亦为0。然后按余数分组:余数为1，即将动物归入第一组;余数为2，归入第二组;以此类推，余数为0，归入第六组。请分别将动物的分组情况填入实验报告的表1和表2中。 如各组动物数不等，则需调整。调整时，仍从随机数字表中抄录若干随机数字，然后用待调整组动物数去除该随机数字，以决定将哪一只动物调整至其他组。如随机数字分别为83、89。而待调整组动物数为8，先用8去除83，得余数为3，于是将该组的第3只动物调至其他组。再用7(因待调整组还剩7头动物)去除89，得余数为5，于是将该组的第5只动物调整至其他组，余类推。 计算各组动物的平均体重，同一次实验中动物体重变异不应超过平均体重的20%。 2. 剂量设置 本次实验采用改良寇氏法，分5个染毒剂量组，由教师指导同学进行染毒剂量设计。 3. 受试物的配制 3.1 量取受试物:固体化学物采用称量法，液体化学物可用称量法或吸量法。 3.1.1 称量法:准确称取一定量的受试物，放入烧杯中，加溶剂溶解或稀释，倒入刻度容器(如容量瓶)内，混匀，再加溶剂定容。计算受试物浓度(mg/m1)，备用。 3.1.2 吸量法:依设计剂量计算出应吸取液态受试物的容积，加入容量瓶中，用溶剂加至刻度。计算公式为:X=A?V/d?1000 式中:X——应吸取受试物的容积(m1) A——设计要求的受试物浓度(mg/m1) V——容量瓶容积(m1) d——受试化学物比重 3.2 受试物的配制 3.2.1 等容量稀释法:按实验最大剂量组所需受试物溶液的浓度及体积，计算所需受试物量，配制最高剂量组试液;再按组距，逐组稀释，分别配出各剂量组所用的受试物药液。 3.2.2 等浓度稀释法:将受试物配成一种浓度的溶液，各剂量组的动物将给予不同体积的受试物。 等容量稀释法和等浓度稀释法计算举例如下: 若最大剂量组为760mg/kg(7.6mg/10g)，灌胃量为0.1ml/10g，则受试物浓度应为7.6mg/ 0.1ml，即76mg/1ml。欲配置50ml该溶液，需受试物量为7.6mg/0.1ml×50ml=3800mg。其 余试剂的配制依此类推，详见表1。 表1 两种稀释法配制受试物计算结果举例 等容量稀释法 等浓度稀释法剂量(mg/kg) 浓度(mg/ml) 灌胃量(ml/10g) 浓度(mg/mL) 灌胃量(ml/10g) 760 76 0.1 76 0.1 380 38 0.1 76 0.2 190 19 0.1 76 0.4 95 9.5 0.1 76 0.8 49.5 4.95 0.1 76 1.6 4. 灌胃染毒及毒效观察 4.1 要求 灌胃染毒应在动物空腹时进行，一般在染毒前禁食4小时。因为胃内充满食物会增加注入阻力，并影响毒物的吸收。 4.2 灌胃量 本实验各剂量组采用等容量灌胃法，灌胃量为0.1ml/10g。若小鼠体重为18g，则灌胃量为0.18ml。 4.3 灌胃操作 左手抓住小鼠耳后、颈部的皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌将其尾根部压紧，将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持灌胃针，吸取所需受试物溶液后，将针头由小鼠口腔插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可将灌胃针插入胃部。如遇动物挣扎抵抗，应停止进针或将针拔出，千万不可强行插入，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。小鼠的进针深度一般为2.5-4cm。为验明是否已正确地插入胃部，可轻轻抽回注射器，如无气泡抽出，表明以插入胃中;如有大量气泡，则提示误入气管，应抽出重插。确定将灌胃针插入胃部后，将受试物溶液注入小鼠胃部并抽出灌胃针，完成灌胃操作。一般小 -1ml。 鼠的灌胃容量为0.2 4.4 毒效应观察 染毒后注意观察并记录动物毒性体征和死亡情况。高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应立刻密切注视。观察内容包括:?动物的死亡时间，各组动物的死亡数;?中毒症状，各组动物出现症状时间、表现等。持续观察，直到动物不再因药物作用而死亡为止。观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非试验因素引起的死亡。最后将死亡情况及各种数据填入实验报告中。 5. 计算LD50 按改良寇氏法公式进行计算。 -1LD=log[Xm-i(?P-0.5)] (公式1) 50 Xm:最大剂量组剂量对数值 i:相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数(相邻两组对数剂量的差值) P:各组动物死亡率，用小数表示(如果死亡率为80%应写成0.80) ?P:各组动物死亡率之总和 n:每组动物数 2 (公式2) S,i，(P,P)/(n,1),,X50 S:logLD的标准误 x5050 X=logLD 5050 -1LD的95%可信限=log(X?1.96S) (公式3) 5050x50 LD的平均可信限=LD?(LD的95%可信限的上限-下限)/2 (公式4) 505050