癌胚抗原重组痘病毒治疗CEA阳性肿瘤的机制及其CEA基因表达的研究

癌胚抗原重组痘病毒治疗CEA阳性肿瘤的机制及其CEA基因表达的研究 癌胚抗原重组痘病毒治疗CEA阳性肿瘤的 机制及其CEA基因表达的研究 第30卷第2期 2002年6月 广州医学院 ACADEMICJOURNALOFGUANGZHOUMEDICALCOLLEGE Vo1.30NO.2 Jun.2002 ? 论着? 癌胚抗原重组痘病毒治疗CEA阳性肿瘤的 机制及其CEA基因表达的研究 赵青’陶沙.杨洁.罗超权 (广州医学院病理生理学教研室,广州510182; 中山医科大学生物化学教研室,广州510089) 摘要目的:探讨癌胚抗原重组痘病毒 (carcinoembryonicantigenrecombinantvacciniavirus,CEA—rV)治疗CEA 阳性肿瘤的作用部位及其CEA基因表达的情况.方法:采用PCR法探测CEA—rV的作用部位,RT—PCR检测接种 CEA—rV鼠腹腔Mm内CEA的基因表达,免疫组化法检测各组小鼠 腹腔MmCEA的蛋白表达.结果:腹腔接种的 CEA—rV主要感染腹腔Mm;皮下接种的CEA—rV主要感染皮肤局部组织.CEA—rV腹腔接种小鼠,其腹腔Mm有 CEAmRNA表达及CEA蛋白表达.结论:推测无论通过腹腔接种还是通过皮肤局部接种.GEA—rV一般多在注射 局部表达.CEA—rV不仅可以进入M,而且其CEA基因可以有效地表达,并可使M表面分子MHC一?与B7—2 表达增强,然后递呈CEA给Th淋巴细胞,使之分泌足够的IL一2,激活Tc细胞分化为CTL,杀伤肿瘤细胞. 关键词癌胚抗原;重组痘苗病毒;作用部位;基因表达 中图分类号R730.51文献标识码:A文章编号:1008—1836(2002)02—0001—04 1材料与方法 1.1痘苗病毒,细胞与动物 天坛株痘苗病毒761株(W—VV),由北京军事 医学科学院病毒学研究所惠赠;CEA—rV由我室构 建.人成纤维细胞由广州医学院刘云岗博士惠 赠.C57BL小鼠(二级):雌性,6,8周,体重17, 20g,购自中山医科大学实验动物中心. 1.2主要试剂与仪器 PCR试剂(基因公司);DEPC,TRIzol试剂(Gib— co公司),AMV逆转录酶,cDNA合成引物(CLON— TECHLaboratories,Inc.),CEA在一抗,ABC免疫组 化试剂盒(华美生物工程公司).UV3000型分光光 度计(日本岛津),UNO1I型PCR仪(德国Biotron); PYX—DHS型隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进 医疗器械一厂);ZF紫外仪(上海康毕生化仪 器厂);TGL一16G低温冷冻离心机(上海安亭科学 基金项目:广州市科委基金资助项目(No.JB02—98—5—018 一 O1),广东省卫生厅资助课(N0.A1998127), 广州医学院资助课题(No.2000一GK一14)及广州 医学院博士启动基金资助课题. 作者简介:赵青(1964.10一),女,博士. 研究方向:病理生理学. 仪器厂);一80cc超低温冰箱(日本三洋). 2方法 2.1CEA—rV及痘苗病毒天坛株761型(W—VV) 的大量制备,按文献方法进行.. 2.2腹腔接种CEA—rV后其作用部位的探测. 2.2.1组织细胞的准备及DNA提取 CEA—rV腹腔接种48h后,取小鼠胸腺,腹腔 M,脾脏,骨髓等免疫器官组织,常规抽提DNA, 腹腔M细胞的制备,参照文献方法进行. 2.2.2PCR检测CEA基因分别以腹腔M,脾 脏,骨髓DNA为模板,扩增CEA的特异引物序列是 按照引物合成原则自行设计,该序列设计在CEA基 因第十外显子内,该外显子长达1002bp,扩增产物 为485bp,引物序列为: 弓I物A:5一CACCTGTAGTCCCAGTTACT一3. 弓I物B:5一TCCCAAGTCTGGAGCGACCACA一3, 由上海生物工程研究所合成.同时加入G3PDH引 物作内标; 弓I物A:5一ACCACAGTCCATGCCATCAC一3. 弓I物B:3一GGTCGTTCCTGTGACTCGTT一5 常规PCR,PCR循环参数为94cc变性1min,55 cc退火1min,72cc1min共35个循环,最后延伸72 1 广州医学院(JGZMC)2002,30(2) ?10min.取扩增产物10L经1%琼脂糖凝胶电 泳,溴乙淀染色后,紫外核酸检测仪上照相. 2.3皮下接种CEA—rV后其作用部位的探测 2.3.1组织细胞的准备及DNA提取 CEA—rV皮下接种48h后,取小鼠皮肤局部组 织及胸腺,脾脏等免疫器官,抽提DNA. 2.3.2PCR检测CEA基因方法同前,并用人肺 癌细胞株SPCA一1DNA作为阳性对照. 2.4RT—PCR检测CEA—rV腹腔接种小鼠M CEA在mRNA水平的表达. 常规取CEA—rV腹腔接种48h后各组小鼠腹 腔M,按TRIzol试剂#说明#,提取各组小鼠腹腔 M总RNA,参照文献方法进行RT—PCR.CEA 的特异引物及G3PDH引物同前,反应条件:94?变 性1min,55?退火1min,72?1min共35个循环, 最后延伸72?10min. 2.5免疫组化法检测各组小鼠腹腔MCEA在蛋 白水平的表达 即痘病毒接种48h后,用冷Hanks液5mL冲 洗腹腔,收集各组小鼠腹腔M灌洗液,离心,用培 ? 养液调成浓度约为l×10.个M/mL,置于盛有玻 片(1%多聚赖氨酸预处理)的培养皿中培养24h, 按ABC免疫组化试剂盒常规操作技术进行处理, DAB显色,检测MCEA的表达.阳性对照用已知 阳性切片,因阴性对照用PBS替代第一抗体. 3结果 3.1腹腔接种的CEA—rV主要感染腹腔M M2345 3PDH EA 图1腹腔接种CEA—rV其MCEAPCR产物电泳图 Fig?1DetectionofCEAgeneonintraperitonealMof miceinoculatedintraperitOneaIlywithCEA—rV analyzedbyPCR 1.Marker2.BonemarrowceilDNA3.Splenocyte.DNA 4.intraperitonealMDNA5.ThymuscellDNA 2 图1结果表明,只有CEA—rV接种的腹腔M 内有CEA基因存在(1ane4,其扩增产物485bp), 提示CEA—rV可能主要感染了腹腔生M等局部 组织细胞,而未能达到脾脏,胸腺等免疫器官. 3.2皮下接种的CEA—rV主要感染皮肤局部组织 !l226— 5I48— 353(1— 2027一 l375— 947一 g3l一 564— 2I’L)H {} 图2CEA—rV皮下接种局部组织内CEAPCR产物电泳图 Fig.2DetectionofCEAgeneonlocatedtissueinoculated subcutaneouslywithCEA—rVanalyzedbyPCR 1.Marker2.SPCA一1DNAaspositivecontrol 3.1ocaltissueDNA4.SplenocyteDNA5.ThymuscellDNA 图2表明,只有CEA—rV接种鼠的皮肤局部组 织内有CEA基因存在(1ane3),提示CEA—rV可能 主要感染了皮肤局部组织,而未能达到脾脏,胸腺等 免疫器官. 3.3CEA—rV在腹腔M内的基因表达 (3PI) (:EA 图3腹腔接种CEA—rV其腹腔M内CEA mRNART—PCR分析电泳图 Fig.3ExpressionofCEAmRNAonintraperitOneaI Mofmiceinoculatedintraperit0neaIIy withCEA——rVanalyzedbyRT??PCR 1.W—VVMRNA2.Marker3.CEA—rVMRNA 4.CEA—rVMcDNA5.W—VVM.cDNA 6.SPCA一1DNAaspositivecontrol7.HanksMcDNA 如图3所见,CEA—rV进人M后可在M内 表达CEA—mRNA,所以,其RNA经RT—PCR后出 现CEA的特异条带(1ane4),而用w—VV或Hanks 68387445j瓣拼 683807445『胁 第2期赵青,等:癌胚抗原重组痘病毒治疗CEA阳性肿瘤的机制及其CEA基因表达的研究 腹腔接种的M的RNA经RT—PCR后不出现CEA 的特异条带,只有看家基因G3PDH扩增产物出现 (1ane7和lane5,其扩增产物520bp),将抽提的 RNA部分用于反转录,部分直接用作PCR模板,从 M(D Md)— 1ane3和1ane1可以看出,既没有CEA的特异条带, 也没有G3PDH扩增条带,说明所抽提的RNA纯度 高,无DNA污染. 3.4CEA—rVM内CEA蛋白质的分子表达 ?一M(I】 图4免疫组化法检测腹腔接种CEA—rV其M表面CEA蛋白表达情况(DAB染色) Fig.4CEAproteinexpressiononCEA—rVMmanalyzedbyimmunohistoch emistry(DABstaining) 1.HanksMm,negativeresults(10×);2.W—VVM,negativeresults(10×) 3.CEA—rVM,positiveresults(10×);4.CEA—rVM,positiveresults(40×) 图4表明,CEA—rV接种鼠的MCEA表达呈一?,B7—2的表达增强,通过增强APC激活Th细 强阳性,而w—VV或NS接种组MCEA表达呈 阴性. 4讨论 杨洁博士等曾采用免疫组化法比较CEA—rV 接种兔和正常兔的肠,肝,肾和肌肉组织,可见两组 同类组织的染色情况完全相同.提示CEA—rV可 能并不侵入机体非淋巴系统组织.CEA—rV是 否可以入侵机体免疫系统呢?CEA—rV使M的功 能改变,CEA—rV的作用部位何在?为此,我们采用 PCR法探测CEA—rV的作用部位.结果表明,腹腔 接种的CEA—rV主要感染腹腔M,下接种的CEA — rV主要感染皮肤局部组织.推测无论通过腹腔 接种还是通过皮肤局部接种,CEA—rV一般多在注 射局部发挥作用.腹腔接种时是腹腔M充当抗原 提呈细胞,推测皮肤局部接种时可能由局部的郎格 汉斯细胞充当抗原提呈细胞.CEA—rV被局部的这 些APC摄取,表达,并导致局部APC表面分子MHC 胞的双信号而激活Th细胞,激活的Th细胞分泌的 IL一2增加并与成熟的以前体细胞形式存在的 CDT细胞表面的IL一2R结合,刺激该T细胞分 化增殖为具有杀伤活性的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL),然后通过CTL细胞杀伤肿瘤细胞. 上述结果亦提示,临床上只需将CEA—rV进行 简单的皮下接种即可治疗CEA阳性肿瘤.这也可 能是其对机体没有明显毒副作用的原因之一. 我们的结果表明,腹腔接种的CEA—rV主要感 染腹腔M.那么,CEA—rV所携带的CEA基因能 否在mRNA甚至蛋白水平表达呢?为此,我们采用 RT—PCR检测接种CEA—rV鼠内CEA的mRNA表 达,采用免疫组化法检测各组小鼠腹腔MCEA的 蛋白表达.图3,4的结果提示,CEA—rV不仅可以 进入M,而且其CEA基因可以有效地表达.CEA — rV借助该痘病毒的强免疫原性与抗原提呈作用, 增强M.第一信号MHC—Ag及第二信号如B7分子 的表达,进而激活T细胞杀伤CEA刚性肿瘤细胞. 3 广州医学院(JGZMC)2002,30(2) 文献报道,皮下注射,皮肤划痕.,腹腔注 射都可达到相同的治疗效果.本实验室曾采用皮 下注射与腹腔注射等方式,效果相似.本研究表明, CEA—rV可能多在注射局部发挥作用,即CEA—rV 一 旦被注入机体,就被局部的APC迅速摄取.只要 CEA—rV能进入体内,就被体内APC摄取,表达,处 理,加工,然后递呈CEA给T淋巴细胞,激活T细胞 分化为CTL,从而达到杀伤肿瘤细胞的目的. 本研究表明,CEA—rV主要通过进入APC诱导 其功能改变而发挥抗瘤作用.已知,树突状细胞 (DC)是抗原提呈功能最强的一类抗原提呈细胞,推 测CEA—rV可以感染DC并诱导其功能改变而发挥 抗瘤作用.DC主要来源于骨髓细胞,其量少而宝 贵,但我们可以联合应用GM—CSF和IL一2从人脐 带血或外周血CD14的单核细胞中培养出大量的 DC,然后将CEA—rV与DC共培养,便可形成活化 的DC疫苗,将此疫苗再免疫小鼠,就可诱导出CEA 特异的免疫反应而将此DC疫苗与T淋巴细胞体外 共培育,即可得到CEA特异的CTL,再将该CTL回 输给体内将可杀伤CEA阳性肿瘤细胞,具体机制值 得进一步研究. 参考文献 [1]罗超权,杨洁,卢方安,等.CEA重组痘苗病毒对CEA阳 性肿瘤的防治作用[J].中山医科大学,2000,21 (2):81—83. 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(收稿日期2002—03—15) TheGeneExpressionofCEA?-?rVandItsTherapeutic EflfectonCEAPositiveTumors ZHAOQing,TAOSha,YANGJie,LUOChao—quan (1.DepartmentofPathophysiology,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou,510182; 2.DepartmentofBiochemistry,SunYat—SenUniversityofMedicalScience,Guangzhou,510089) Objective:ToexploretheaffectinglocationofCEA—rVonCEApositivetum orandtheCEAgeneexpression. Methods:TheaffectinglocationofCEA—rVwasprobedbyPCR;theCEAm RNAexpressionwasexaminedbyRT — PCRandtheCEAproteinexpressionwasexaminedbyimmunohistochemistry.Results:IntraperitonealCEA—rV infectedmainlylocalM;SubcutaneousCEA—rVinfectedmainlylocaltissue .CEAgenewastranscriptedand CEAproteinwasexpressedonlyintheintraperitonealMfrommiceinoculated rV.Conclusion:It withCEA— rVinfectedmainlylocaltissue,whetherinoculat couldbeinferredthatCEA— edbyintraperitonealorsubcutaneous injection.NotonlycouldCEA—rVinfectMandmakeMexpressmoreMHC —I/andB7—2,butalsoenhance itsCEAproteinexpression.Then,theCEAcouldbepresentedtoThlymphocytesbyMandinduceadequate secretionofIL一2toactivateCTLtokilltheCEApositivetumorcel1. Keywordscarcinoembryonicantigen;recombinantvacciniavirus;affectinglocation;CEAgeneexpression 4