中性粒细胞碱性磷酸酶

中性粒细胞碱性磷酸酶 ( N-ALP NAP) 碱性磷酸酶包括一组在PH中性以上能够从很多醇和酚的单磷酸酯释放出碱的同功酶。 一(正常分布: 人体血液与造血细胞的碱性磷酸酶活性，主要存在于中性粒细胞系统的成熟阶段中，其他成分如嗜酸、嗜碱、淋巴、单核以及巨核细胞，血小板，浆细胞等均为阴性反应，网状内皮细胞和巨嗜细胞的反应为强阳性。 二(生理变化: 1(年龄变化:新生儿ALP极高，随后下降，成人较儿童期减低，老年期(>6)最低。 2(性别差异:无差别，但也有报道女>男。 3(季节变化:夏季为高。 4(应激状态下的变化:紧张、恐惧、休克、激烈运动等。 5(妊娠期的变化:妊娠2~3个月时。NAP轻度高。以后逐月趋于显著。 6(与激素的关系:肾上腺皮质激素，雌激素和ACTH都有使NAP活性升高，有人认为 ACTH的作用是通过肾上腺皮质而发生的。 三(临床意义: 1(重度增高: 类白血病反应:NAP活性极度增高与CML鉴别。 感染:细菌感染的NAP改变比较明显，其中，NAP活性高度增高者见于各种急性化 脓性感染(如败血症、大叶性肺炎、化脓性脑膜炎等)。 2(中度增高: 感染:见于支气管肺炎、肾盂肾炎。 贫血:AA。 非AL性骨髓增生性疾患:PV、骨髓纤维化、CML合并骨髓硬化症、持发性ITP、 AL:ALL。 恶性淋巴瘤:何杰金氏淋巴瘤。 3(轻度增高: 感染:上呼吸道感染、肺结核等。网状细胞增高，遗传性低NAP症。 AL:MM、神经母细胞瘤。 贫血:溶血性贫血。 4(降低: 贫血:镰形细胞贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿。 AL:CML显著减低 感染:病毒性感染、特别是病毒性肺炎。 5(正常或无规律:急粒的NAP活性可减低也可正常。并发感染时可有中度升高。当治疗 后充分缓解时，有些NAP活性可恢复正常。单核细胞改变缺乏的规律性，绿色瘤和 M6与急粒相似。 网状细胞肉瘤多数病例增高，少数在正常范围内。 淋巴肉瘤可增高，可正常。MDS可增高、正常和减低。 主要鉴别: 1(CML—类白 2(PNH—AA 3(ALL—ANLL 4(PV—反应性PV 5(细菌升高—病毒(特别是肺炎) 四(染色方法: 碱性磷酸酶是一种能分解磷酸酯的水解酶，方法不同，原理不同。国际化委员会提 出。推荐的方法应该是快速，简便，容易重复，并有很宽的技术范围。 方法:(1)钙—钴法 (2)未取代萘酚法:底物а—磷酸萘酚钠。 (3)取代萘酚法:国际标准委员会推荐两种方法: A( 1963年Kaplow 等:萘AS-BI磷酸盐 B( 1963年Tomonaga等:萘AS-MX磷酸盐 国际标准化委员会认为а—萘磷酸盐产生的反应产物。生色团不好，并且是水溶性的，因此使用这种基质的方法是不满意的，只有考虑应用那些萘磷酸的代用品。适当耦联物的选择是基于从技术观点看耦联物的特性，及它们是否容易获得，这两个方面。萘AS-BI磷酸盐，结果快。萘AS-MX磷酸盐，因为它耗费时间，除日本外其它国家很少了解，但它对白细胞中酶染色的质量是比较好的。其它细胞化学反应的技术因素，如固定pH范围，温浴时间，温浴介质的缓冲作用等也应予以考虑。国外大都应用萘酚AS-BI磷酸。 上海儿研所对三种白细胞碱性磷酸酶染色方法的评价，认为(1)钙钴法平均阳性指数最低仅2.12。虽有人主张延长孵育时间以提高阳性率和阳性指数，但由于孵育时间长，易使阳性产物扩散;且钙—钴法的基质液的配制较麻烦，影响其结果的因素很多。(2)未取代萘酚法虽然反应时间缩短，阳性指数正常值相对较为稳定，但基质液不能长期保存，每次需临时配制孵育液。(3)取代萘酚法较其它方法有以下特点，酶活性显示较充分，正常值68%以上可以显示LAP活性，阳性指数均值较其它方法高，反应酶的钝化与丢失较少，阳性产物色泽鲜明，溶解度低，不扩散，因而定位精确，有利于评定ALP活性强度的分级，例三者平均值。 一 NAP三种试验方法比较 钙—钴法 未取代萘酚法 取代萘酚法 组 别 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数 X?SD X?SD (平均)(平均)范围 X 范围 X+SD 范围 X 范围 范围 X 范围 (平均)(平均)(平均)(平均) 高阳性指数组 35-81 68 66-254 210?13.5 40-76 70 45.8-154 101?17 85-100 93 347-540 450.3?5 (N=24) 正常阳性指数组 20-39 34 41-82 62?18 17-40.5 26 18-69.8 49.5?20 68-99 84.1 164-380 240.2?56.2 (N=60) 低阳性指数组 10-40 29 12-84 57?20 6-55 40 6-70 40?28 40-80 61 24-396 186?38 (N=22) 染色方法介绍: 一 钙-钴法: (一)原理:磷酸酶能水解各种磷酸有机盐，并释放出磷酸，组化方法是利用被释放出来 2+ 磷酸与Ca结合，成为磷酸钙而沉淀下来，再与硝酸钴与硫化铵作用。生成黑色的 硫化钴。 (二)试剂 1(孵育液:3% β-甘油磷酸钠 10ml 2% 巴比妥钠 30ml 2% Ca(NO) 20ml 2% mgsO 2ml 324 混匀，以0.5NaoH调pH至9.3-9.4置5’后即可。 2(2%巴比妥钠 3(1%硫化铵 4(0.5%伊红 5(0.5%美兰 (三)步骤: DW1g DW冲 干 干 冲 B 95%乙醇 孵育液 2%硝酸钴 1%硫化铵5’ 0.5%伊红 0.5%美兰 镜检 固定10’ 37?6h 干 5’ 干 冲 冲 干 (四)正常值: 阳性率 阳性指数 B 53.7% 81.9?6.4 BM 49.2% 84.7?9.8 此方法阳性率低，时间长，稳定性差，影响因素多，现基本不在采用。 二 偶氮染料法:萘AS-MX磷酸盐 (一)原理:底物在pH 9.5被WBC中酶水解产生磷酸和芳基萘胺，芳香萘胺再与偶氮偶联， 形成不溶性染料。 (二)试剂: 萘酚AS-MX磷酸钠盐(sigma) 固兰RR 冰醋酸 α-氨基-2-甲基1,3丙二醇 N,N-二甲基甲酰胺 甲醛 甲醇 藏红花红O a(固定剂:取10ml甲醛和0.01ml冰醋酸，加入到90ml甲醇中充分混匀，保存在冰箱、 冰盒中备用。 b(贮存缓冲液(0.2M PH 8.6丙二醇) 取2.1gα-氨基-2-甲基1,3丙二醇溶于4ml N,N-二甲基甲酰胺中，再向此溶液中， 加入76ml贮存缓冲液和120ml DW，混匀放4?冰箱，备用。 C(作用液:贮存底物溶液 20ml 固兰RR 20mg 充分混匀，用前迅速过滤。 d(复染液:0.5% 藏红花红O。 (三)步骤: 水冲 水冲 B 固定剂 作用液 复染液 5’’ 干 2h 干 (四)结果:酶活性呈现为不连续的分散的兰色颗粒，在人中性粒细胞胞浆中，细胞浆染 成浅红色，很少的淋巴细胞可呈现很弱的反应，其它细胞无反应。 (五)分级标准: (-)无燃料颗粒。 (+)5个燃料颗粒以内。 (++)5个以上到30个可以清楚计数的颗粒。 (+++)30个以上呈不同均匀分布的颗粒。 (++++)30个颗粒以上分布不均匀，颗粒之间可以清楚辨别。 (+++++)中性粒细胞胞浆内充满于颗粒，且颗粒之间不可清楚辨别。 (六)正常值:阳性率>68% 阳性指数164-380 上海儿研所80年进行观察: (一)不同重氮盐的显示效果。从分解速度，产物色泽和无解来说以坚牢兰RR所得结果最 好。 重氮盐名称 抑 制 分 解 色 泽 沉淀类型 坚牢紫B + + 综 红 颗 粒 坚牢兰BS ++ -,+ 综 黑 明显扩散 坚牢兰B ++ + 蓝 黑 清度扩散 坚牢兰RR + -,+ 浓 蓝 颗 粒 (二)不同孵育时间对LAP活性的影响从表3中可见孵育2-4h反应最充分，所以选用2h。 (三)不同浓度坚牢兰盐RR对显示结果的影响。表4 坚牢兰盐RR浓度 例 数 阳 性 指 数 (mg/ml) 范 围 均 值 3 8 53-87 71.4 2 8 160-180 172.1 1 8 181-246 205.4 0.5 8 161-270 221.0 0.25 8 141-189 170.1 浓度在0.5-1mg/ml时，LAP活性显示最充分，沉淀物也不扩散。 (四)不同浓度萘酚AS-MX对结果的影响。表5 阳 性 指 数 例号 10mg 7mg 5mg 4mg 2mg 1 154 222 210 220 54 2 52 62 60 50 19 3 333 438 466 443 72 4 380 455 442 450 140 5 58 44 60 52 33 6 162 180 197 193 102 7 206 200 221 166 104 8 170 174 216 222 74 9 114 136 145 166 90 10 188 177 172 92 76 100 94 30 11 86 79 随底物不断增高，阳性率在>4mg以上并无明显变化。 七(注意事项 1(重氮盐和底物保存4?冰箱，避免与皮肤接触或吸入。 2(一般用B比BM片好，在细胞分布比较均匀的部位进行计数，三日内计数，否则防入低 温冰箱(可放半年左右)。 3(各地区应有各地区的正常值。 三