【doc】硫酸软骨素对鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成抑制作用

【doc】硫酸软骨素对鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成抑制作用 硫酸软骨素对鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成 抑制作用 84中国生化药物杂志ChineseJourna1.fBi.ciemica1Phamaceutics2004年第25卷第2期 硫酸软骨素对鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成抑制作用 金艳,崔慧斐,曹吉超 (山东大学药学院生化与生物技术药物研究所,山东济南250012) 摘要:目的观察硫酸软骨素的血管生成效应.将15g/L硫酸软骨素基液4l加到孵化4d的鸡胚绒 毛尿囊膜血管网上,24h后观察对血管生长的影响.同时设有同浓度的氢化可的松组和肝素组及三蒸水组作为对 照组.结果硫酸软骨素使鸡胚绒毛尿囊膜血管发生大面积褪色,血管密度减低;氢化可的松组血管结构模糊,分 枝发生断裂,颜色变浅,血管密度减少;肝素组血管生长旺盛,血管密度增加;正常对照组血管网清晰,呈叶脉状,放 射状生长.结论硫酸软骨素有显着的抗血管生成活性. 关键词:鸡胚绒毛尿囊膜;硫酸软骨素;抗血管生成效应 中图分类号:Q538,03;R972文献标识码:A文章编号:1005—1678(2oo4)02—0084—02 Anti—angiogeniceffectsofchondroitinsulfateinchickenchorioallantoicmembranemodel JINYan,CUIHui—fei,CAOJi—chao (InstituteofBiochemicalandBiotechnologicalDrug,SchoolofPharmacy,ShandongsUm~ rsity,如m2500l2,China) Abstract:PurposeToassesstheanti—angiogeniceffectofchondroitinsulfate(CS).MethodsChicken chorioallantoicmembrane(CAM)hatchedfor4dayswasusedasexperimentalmode1.Thea nti—angiogenicef- fectofCSwasobserved24hafter4肚 lCSsolution(15g/L)wasaddedontotheCAMvascularnetworkregion. BesidesCSgroup,therewerethreeothergroups,hydrocortisonegroup,tri— distilledwatergroupandheparin groupascontrols.ResultsLargeareaofbloodvesselsinCSgrouphadheavylossofcolor,acco mpaniedbythe decreaseddensityofvessels.Inhydrocortisonegroup,vascularstructureblurredwithbroken branches,mean— while.therewereslightlOSSofcoloranddecreaseddensityofvesse1.Atthistime,thevessels becamedenser andgrewlushlyinheparingroup.Intri— distilledwatergroup,theleaf-likevascularnetwasclearandgrewra— diatively.ConclusionCSwaspotentininhibitingangiogenesis Keywords:anti—angiogenesis;chondroitinsulfate;chickenchorioallantoicmembrane 自Folkman于20世纪70年代提出肿瘤的生长 和转移有赖于血管生成的观点及抑制肿瘤血管生成 的抗肿瘤策略以来,寻找血管生成抑制剂已成为抗 肿瘤的一条重要途径.目前已发现20余种血管生 成抑制因子,有的已用于临床,取得一定的疗效,但 大部分由于毒性大,特异性差而限制了临床应用. 软骨作为无血管生成的特殊组织,很少发生肿瘤,在 抗血管生成方面备受关注.1983年,鲨鱼的软骨即 被引入肿瘤治疗.已知血管生成的中心环节是 血管内皮细胞的迁移及增殖?,该行为多与细胞外 蛋白聚糖有重要关系.硫酸软骨素(chondroitinsul一 收稿Et期:2003—08.28 作者简介:金艳(1972一),女,山东平度人,硕士研究生,主要研究 方向为动物多糖. fate,CS)是由动物软骨分离得到的一种糖胺聚糖, 是细胞外基质的主要成分之一,国内资源丰富,主要 用于治疗偏头痛和链霉素所致听觉障碍等,药理作 用无突出特点.国内用量较少,绝大部分作为低附 加值的生化原料出口,国外大都用作心血管方面的 保健食品.本研究以血管生成的经典模型——鸡 胚绒毛尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane, CAM)为评价体系,观察cs的抗血管生成效应,为更 好地开发利用这一丰富的资源打基础. 1材料 cs(猪气管为原料制备),烟台东诚生化有限公 司;精品肝素(抗凝效价190IU/mg),东营天东生化 有限公司;氢化可的松,新华制药股份有限公司;白 壳种蛋,山东省农业科学院家禽研究所. 2方法与结果 中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2004年第25卷第2 期85 2.1待测药物及载体的制备 各试验药物的浓度均为15g/I..cs,肝素用三 蒸水溶解配制成;氢化可的松先以适量无水乙醇溶 解,再用三蒸水稀释至一定浓度.均用0.22址m微 孔滤膜过滤除菌. 将定性滤纸剪成直径为2mm的圆片,作为加 药载体,高压湿热消毒. 2.2鸡胚孵化 将产后不超过3d的受精种蛋用37cc的甲醛溶 液(1:4000)消毒后置(37?1)cc培养,培养箱内放入 水盘以保持40%,60%相对湿度.鸡蛋气室向上, 长轴与蛋托约呈70.,80..每1天转蛋3次,转蛋 角度以水平位置前俯后仰各45.为宜. 2.3鸡胚的释放及待测药物的加入 采用Folkman平皿法,并稍加改进一. 鸡胚孵育4d后,用照蛋灯照蛋,挑选出发育良 好的鸡胚.将其移至超净台内,用75%酒精消毒后 晾干.用砂轮在蛋壳中央垂直长轴磨切出一道2 cm长的切口,向两侧掰开蛋壳,将鸡胚释入100mm 无菌平皿中.挑选血管网平铺于卵黄上方,无破损 的鸡胚.将鸡胚分为4组:CS组,肝素组,阳性对照 氢化可的松组和空白对照组,每组20枚.用微量进 样器将药液或三蒸水4l加在无菌滤纸载体上,待 吸收后将其小心地放在鸡胚周围血管较细,密度较 小的部位.之后在培养皿内再加入DMEM3rn1., 2.4鸡胚的离体孵育及结果观察 将鸡胚小心移至CO培养箱内,于37cc,2% CO,条件下培养24h后观察,结果见图1. B空白对照组 C肝素组D氢化可的松组 图1CAM的血管生长情况 由图1可见Cs组大范围血管明显褪色,血管密 度减少.空白对照组血管网络清晰,呈叶脉样,放射 状生长,主血管粗壮,长势旺盛.肝素组血管生长旺 盛,血管密度明显增大.氢化可的松组血管结构模 糊,颜色变浅,血管分枝多处断开,密度减少. 3讨论 鸡胚孵化4d时是CAM的血管生成早期,血管 形成以出芽和套叠的方式进行,处于生长高峰,且机 体免疫系统尚未完全建立,因此对各种异物几乎不 发生排斥反应,便于将药物载体置于其面,观察各 种诱导剂和抑制剂对血管生成的影响.CAM法是 国内外研究血管生成效应常用方法之一. 本文发现CS具有显着的抑制血管生成的活性, 其作用强于氢化可的松这一阳性药物.cs抗血管 生成的机制尚不清楚,作为聚阴离子,它与肝素有相 似的结构骨架,是否能与血管生成相关的生长因子, 如VEGF,FGF,内皮抑素等肝素结合蛋白发生作用 有待进一步探讨.已知cs具有类肝素酶抑制活性, 血管新生时,内皮细胞穿越降解的基底膜而迁移是 重要的环节,类肝素酶是降解基底膜的关键因素,该 酶业已成为肿瘤治疗的靶点之一.对类肝素酶的 抑制作用可能是cs抗血管生成的机制之一.对肝 素的抗血管生成活性报道不一,Thorpe发现肝素具 有抑制血管生成的作用,但此后有不少实验室未能 重复该实验结果,本实验的结果是肝素有显着的促 血管生成作用.推测有这几方面的原因,首先,肝素 既可以与促血管生成的生长因子(如VEGF,FGF等) 结合,也可以和抗血管生成因子(如内皮抑素)结合, 从而发挥不同的血管生成效应,甚至不同剂量下作 用相反;再者,肝素有不同的来源,如猪肠黏膜和牛 肺等,且存在结构不均一性. 总之,本研究发现cs具有显着的抗新生血管生 成的作用,对CS的开发应用有重要意义.抗血管生 成制剂不仅可用于抗肿瘤,对一系列血管生成疾病 —— 糖尿病视网膜病变,银屑病,动脉粥样硬化,类 风湿性关节炎等顽疾也同样适用.已知cs无毒副 作用,使用安全,价格低廉,国内资源十分丰富,若能 开发为抗血管生成药物将有着广阔的应用前景. 参考文献: [1]KerbelRsAcancertherapyresistanttoresistance[J].Nature,1997, 390:335—336. E21徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学(第3版)[M].北京:人 民卫生出版社,2002.1823—1824. 『3]张树成,吴志奎,王蕾,等.研究中药血管生成活性和作用的鸡 胚绒毛尿囊膜实验模型的应用[J].中国中医基础医学杂志, 1999.5:16—19. f4]呼群,宁涛,苏秀兰,等.鸡胚绒毛尿囊膜技术的改进[J].北京 大学(医学版),2001,33:383—385(下转第90页) 90中国生化药物朵志ChiseJournal.fBioeiemicalPham1aceutics2004年第25卷第2 期 时J日J/rain 图1GLA乙酯气相色谱图 1.亚油酸;2GLA乙酯;3.油酸 淀出来.结晶学研究发现,尿素分子可形成一种中 问有一柱状管道的六角形笼状结晶,只有大于6个 碳原子的直链化合物可以安置在这种管道里.结晶 用水处理或加热使尿素熔融,则品格破坏,被关闭在 管道内的化合物可自行逸出.此外,分子结构中的 不饱和程度也将改变分子的形状,从而影响形成尿 素复合物的程度,据此可分离不同不饱和程度的多 烯脂肪酸H.尿素包和法适于在较低的温度下操 ,夏 作,一般秋冬季节l0?以下包合效果好,收率高 季不佳. 3.2酯化反应条件筛选 结果见表1.结果显示,80?时酯化反应最完 全,酯化率高,表明温度对酯化反应呈正性作用.反 应时间在90min时酯化反应趋于完成,继续延长反 应时问无显着意义.用3%盐酸即可以满足酯化反 应所需的催化剂用量,继续增加盐酸用量对酯化率 无显着影响.文献报道,用硫酸作催化剂可以破 坏双键,影响不饱和脂肪酸的稳定性,此现象有待进 一 步研究. 随着乙醇用量的增加酯化率增大,乙醇和GLA 最佳比例为3:1.脂肪酸与醇的酯化反应是可逆反 应,通常条件下酯化和水解都不能进行完全,用等摩 尔的脂肪酸和乙醇作用达到平衡时,仅有2/3摩尔 的酯生成.为了提高酯化率,根据质量作用定律,可 用过量的脂肪酸或醇使平衡破坏,以促使反应向着 生成酯的方向进行.另外采用恒沸法除去反应生成 的水也可达到同样的目的.在酯化基本反应系统 中,采用不同比例的乙醇和GLA,酯化率随底物比例 的不同发生变化. 表1实验因素对GLA乙酯酯化率的影响 参考文献: [1]宋宏锐.月见草油与亚麻酸[J].沈阳药学院,1988,5 (1):64.68 [2]周立新,黄凤洪,严兴初,等.a.亚麻酸与7一亚麻酸[J].西部粮 油科技,2000,25(6):46—48. 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