跳骨片水提物对体外大鼠关节软骨细胞活性的影响

跳骨片水提物对体外大鼠关节软骨细胞活性的影响 【摘 要】目的:探讨跳骨片水提物对体外大鼠关节软骨细胞活性的影响。方法:4周龄 SPF级SD大鼠5只，采用机械-?型胶原酶消化法获取膝关节软骨细胞，倒置相差显微镜观 察软骨细胞的形态结构，?型胶原免疫组化染色鉴定软骨细胞。0，25，50，100 μg?mL-1跳骨片水提物对第3代软骨细胞，分别干预24，48，72 h后，MTT法检测细胞活性。结果: ??型胶原免疫组化染色后软骨细胞胞浆呈棕黄色，为阳性;?以0 μg?mL-1跳骨片水提物 1组软骨细胞活性明显高于对照组(P 干预的软骨细胞作为对照组，干预24 h后，50 μg?mL- < 0.05);干预48 h后，25，50 μg?mL-1组明显高于对照组(P < 0.05);干预 本文采集自网络，本站发布的论文均是优质论文，版权和著作权归原作者所有。 72 h后，25，50，100 μg?mL-1组与对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。结论: 跳骨片水提物在25，50，100 μg?mL-1时均可以促进软骨细胞的增殖，具有剂量和时间依赖 性，其中50 μg?mL-1干预24 h后最为明显。 【关键词】 骨关节炎;跳骨片水提物;MTT法;软骨细胞;大鼠 Effects of Aqueous Extract of Tiaogu Tablet(跳骨片)on the Activity of Rats Articular Chondrocytes in Vitro ZHENG Wen-wei，MA Yu-huan，LIN Ping-dong，CHEN Hou-huang，SHAO Xiang，CHEN Da， LI Xi-hai， YE Hong-zhi 【ABSTRACT】Objective:To investigate the effects of aqueous extract of Tiaogu Tablet(跳骨片)on the activity of rats articular chondrocytes in vitro.Methods: week-old SD rats of SPF grade by the Articular cartilage cells were got from five 4-mechanical type?collagenase digestion method and their morphology was observed under inverted microscope.The cartilage cells were identified by the type?collagen immunohistochemical staining. After the third generation of chondrocytes were intervened with 0，25，50，100 μg?mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet respectively after 24，48，72 h，their activity was tested with MTT method.Results: ? Chondrocyte cytoplasm was brown and positive after staining;?The activity of chondrocytes intervened with 50 μg?mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet after 24 h was significantly higher than the control group with 0 μg?mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet(P < 0.05).After intervention for 48 h，the activity of chondrocytes in groups intervened with 25，50 μg?mL-1 of extract was significantly higher than the control group (P < 0.05).After 72 h intervention，the differences between groups intervened respectively with 25，50， 100 μg?mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet and the control group were not statistically significant(P > 0.05). Conclusion:Aqueous extract of Tiaogu Tablet of 25，50，100 μg?mL-1 can promote the proliferation of chondrocytes，depending on dose and time，of which 50 μ g?mL-1makes it obvious after 24-hour intervention. 【Keywords】 osteoarthritis;aqueous extract of Tiaogu Tablet(跳骨片);MTT method; chondrocyte;rats 骨?P节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退变为主的慢性、进行性骨关节疾 病[1-2]。OA始发部位在软骨，以中老年人群最为常见。软骨退变是多因素综合作用的结果，软骨细胞作为软骨中的唯一细胞及软骨破坏过程的靶细胞，其结构的破坏及功能丧失在此过程中起着重要作用[3-4]。因此，采取保护软骨细胞结构及调节软骨细胞功能可能是防治OA重要途径之一。目前治疗OA的方法主要以对症治疗为主，缺乏特效疗法。中医药在治疗OA上具有多靶点、多方向、安全可靠、经济等特点[5]。跳骨片具有活血舒筋、消肿定痛等功效[6]，但目前其在治疗OA方面的研究甚少，因此初步研究跳骨片水提物对体外关节软骨细胞活性的影响，有利于为OA的治疗及跳骨片开发利用提供一定理论依据。 1 实验材料 1.1 实验动物 4周龄雄性SPF级SD大鼠5只，体质量60,80 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号:SCXK(沪)2012-0002。根据《关于善待实验动物的指导性意见》(中华人民共和国科学技术部颁发)处理实验动物。 1.2 实验药物、试剂与仪器 跳骨片(福州屏山制药有限公司);胎牛血清(Gbico公司);MTT、?型胶原酶(Sigma公司);DMEM低糖培养基(HyClone公司);二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司);DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);二氧化碳培养箱[力新仪器(上海)有限公司];超净工作台(苏州净化设备有限公司);酶标仪(美国Bio-tek有限公司)。 2 方 法 2.1 跳骨片水提物的制备 跳骨片去糖衣，称取粉碎后的粉末10.2 g，加入10倍量的蒸馏水浸泡 30 min，100 ?回流提取3次，每次1 h，合并滤液并过滤，滤液浓缩至1 g?mL-1，真空低温烘成浸膏备用。 4周龄SPF级SD大鼠，取双侧后肢膝关节，置于75%的酒精 2.2 软骨细胞的分离和培养 消毒15 min，在超净台内用手术刀片打开关节腔，分离关节面并切下股骨、胫骨的关节软骨，PBS洗3次后切成1 mm3的小块，加入5 mL质量分数为0.2%的?型胶原酶，置于细胞培养箱中消化，每2小时1000 r?min-1离心机离心5 min后收集上清液并离心收集细胞，将细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，接着按一定的密度接种于培养瓶，于细胞培养箱进行培养，重复收集至组织块消化完毕为止，此时的细胞标记为原代(P0)，隔日进行更换培养液。 2.3 软骨细胞的传代培养 将培养瓶置于倒置显微镜进行观察，当细胞生长至瓶底面积80%,90%时，倒掉培养液，加入2 mL PBS洗 3次后吸掉残液，加入0.25%胰蛋白酶500 μL，于37 ?培养箱静置2,3 min左右，倒置显微镜下观察，当细胞间隙变大、形状变圆，立即加入细胞培养液终止消化，反复吹打至均匀后，平均分为2份接种于新的培养瓶中，细胞传至第2代(P2)时用于MTT实验。 2.4 软骨细胞的免疫组化鉴定 将长势良好的P2细胞分为阳性组和阴性对照组，并接种于6孔板中，放入细胞爬片，加入2 mL含10% FBS的DMEM培养48 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次后0.5% Txiton-100处理15 min，PBS洗3次后3% H2O2处理 20 min，PBS洗3次后羊血清封闭60 min， 吸干封闭液，阳性组4 ?下一抗Collagen?(1?200)孵育过夜，而阴性对照组不进行一抗Collagen?孵育。PBS洗3次，二抗室温孵育1 h后PBS洗3次， DAB显色5 min后自来水漂洗，苏木素复染30 s后自来水荡洗，晾干，封片，镜下观察。 2.5 跳骨片水提物溶液的配制 将“2.1”的浸膏置于干燥器至恒重，称取一定量的浸膏，加入PBS配成10 mg?mL-1的母液，并用0.22 μm的滤头过滤，用8%的培养液进行稀释。 2.6 MTT法检测跳骨片水提物对软骨细胞活性的影响 将P2细胞以5×104?mL-1的密度接种于96孔 板，每孔为100 μL，置于培养箱24 h后，吸掉培养液，加入含0，25，50，100 μg?mL-1的跳骨片水提物浓度为8%的FBS培养液，并以含0 μg?mL-1跳骨片水提物干预的软骨细胞 作为对照组，每个浓度设置9个复孔，分别培养24，48，72 h后，弃掉培养液，加入100 μL质量分数为0.1%的MTT溶液，于培养箱内4 h后弃掉MTT，加入150 μL的DMSO，充分振荡10 min，酶标仪490 nm检测波长测定其吸光度，结果取平均值。 2.7 主要观察指标 鉴定体外培养的软骨细胞及观察跳骨片水体物对软骨细胞活性影响。 2.8 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计。组间数据采用One-Way ANOVA方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。 3 结 果 3.1 软骨细胞体外培养的形态观察 P0细胞培养24 h后，大多数软骨细胞开始贴壁，圆形增大，见图1(1);培养72 h后软骨细胞一般呈多角形或三角形，见图1(2)。传代后，第1代(P1)软骨细胞生长以圆形或椭圆形为主，具有细胞密度依赖性，见图1(3)、1(4)。P2软骨细胞胞浆丰富、胞核清晰，增殖速度较快，呈不规则的立体“铺路石”状，见图1(5)、1(6)。第3代(P3)软骨细胞增殖速度相对减慢，出现“老化”现象，细胞开始呈长梭形，见图1(7)、1(8)。 3.2 软骨细胞的免疫组化鉴定 免疫组化结果显示，阳性组软骨细胞的胞浆呈黄棕色，细胞核周围和细胞膜周边均有分布，细胞越密集的地方颜色越深，而阴性对照组未见棕黄色，所分离培养的细胞具有典型的软骨细胞生物学特征。见图2。 3.3 跳骨片水提物对软骨细胞活性的影响 跳骨片水提物在适宜浓度范围内均能促进软骨细胞增殖，但具有剂量和时间依赖性。与对照组比较，25，50，100 μg?mL-1跳骨片水提物在24，48，72 h均能促进软骨细胞增殖，尤其50 μg?mL-1最为明显，其在干预24，48 h时，差异有统计学意义(P < 0.05)，以24 h最为明显。见图3。 论 4 讨 OA属中医学“痹证”“骨痹”范畴[7]。OA病在筋骨，病位于肝肾，肾气不足则骨失充养，肝血不足则筋脉失?B。《类证治裁?痹证论治》曰:“痹久必有痰湿败而血瘀滞经络。”气血凝滞，致使经脉气血运行不畅，肌肉关节失去濡养，易致使关节结构破坏而诱发OA[5]。OA由于经气不畅，络血不行，阳气不达，则邪气肆虐，而生疼痛[8]。故OA与气滞血瘀、肝肾亏虚、风寒湿邪侵袭等因素有关。基于其中医病理特点，可以采取活血化瘀、补益肝肾、消肿定痛法进行治疗。跳骨片是由骨碎补(炒)、仙桃草、血竭、马钱子(制)、黄芪、土鳖虫等 20味中药制成的糖衣片，其中骨碎补、狗脊补肝肾、强筋骨[9-12];马钱子(制)、独活、冰片、羌活、乌药消肿定痛[13];黄芪能够促使血管重生，改善局部循环[14];三七、红花、土鳖虫舒筋活血、祛风散寒。诸药配伍合用，共奏补肝肾强筋骨、活血舒筋、祛风散寒、消肿定痛的功效。 关节软骨由软骨细胞及软骨基质组成，软骨细胞包埋于胶原与蛋白多糖等所形成的致密基质中。?型胶原酶消化法是软骨细胞分离及体外培养的一种常用方法，但是其消化时间较长，对细胞有一定损伤[15]。本实验采用机械-?型胶原酶消化法，将关节软骨切成1 mm3的小块，加入5 mL质量分数为0.2%?型胶原酶消化获取软骨细胞。与胰蛋白酶、?型胶原酶序贯消化法、单纯?型胶原酶消化法相比，此法操作相对简单，所需时间较短，污染几率较小，同时可以获得数量较多的软骨[16]。倒置相差显微镜观察不同时期软骨细胞的形态结构，实验结果明，随着原代培养及传代可以获得较高纯度的软骨细胞。?型胶原蛋白属于软骨细胞外基质的主要成分，常作为软骨细胞鉴定的生物标记物。?型胶原免疫组化染色鉴定及形态观察发现，P3软骨细胞胞浆丰富、胞核清晰，增殖速度较快，纯度高，具有典型软骨生物学特征，故选用此时期的软骨细胞进行传代干预。 软骨退变是OA的主要病理特征，软骨功能与结构的相关性主要取决于软骨细胞和周围基质动态的相互影响。软骨细胞能合成和分泌基质，在软骨形成、修复及代谢过程中起着重要作用[17]。OA中软骨细胞数量随着病情加重而下降，同时加上基质异常钙化及细胞数量变化 跟软骨纤维化的增加频率呈一致性，说明软骨细胞结构是引起OA的一个重要因素[18]。因此，促进软骨细胞增殖可能是防治OA的一个有效途径。本实验通过MTT法分析跳骨片水提物对体外大鼠软骨细胞活性的影响，结果发现，与对照组相比，跳骨片水提物在25，50，100 μg?mL-1时均能增强软骨细胞活性，其中以50 μg?mL-1干预24 h最为明显，说明跳骨片具有促进软骨细胞增殖的功能，提示了其很可能是一种潜力治疗OA的药物。但是由于OA发病机制不明确，加上跳骨片所含化学成分多且复杂，因此有待进一步研究。 5 参考文献 [1] Li X，Chen J，Liang W，et al.Bushen Zhuangjin Decoction promotes chondrocyte proliferation by stimulating cell cycle progression[J].Exp Ther Med，2015，9(3):839-844. 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