紫癜颗粒对ITP模型小鼠骨髓巨核细胞的影响

紫癜颗粒对ITP模型小鼠骨髓巨核细胞的影响 紫癜颗粒对ITP模型小鼠骨髓巨核细胞的 影响 辽宁中医杂志2007年第34卷第 紫癜颗粒对ITP模型小鼠骨髓巨核细胞的影响 马骥.范颖.陶淑春.孟素萍 (1.辽宁中医药大学,辽宁沈阳110032;2.北京中医药大学东直门医院,北京100700) ? 995? 摘要:目的:观察紫癜颗粒对IrP模型小鼠骨髓巨核细胞分类与数量的影响,探讨骨髓巨核细胞在n.P发病中的 作用及紫癜颗粒治疗n’P的效用机理.:采用瑞氏染色对骨髓巨核细胞进行计数与分类.结果:紫癜颗粒大剂量组 在促进骨髓产板巨核细胞方面优于其他各组(P<0.05).结论:紫癜颗粒具有促进骨髓产板巨核细胞产生,降低不成 熟巨核细胞的作用. 关键词:紫癜颗粒;rrP模型;骨髓巨核细胞’ 中图分类号:11285.5文献标识码:B文章编号:1000—1719 02 【2007)07—0995— 原发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocyto— penicpurpura,简称ITP)是临床上常见的出血性疾病, 以外周血小板减少,骨髓巨核细胞增生伴成熟障碍为 特征.临床上常通过检测骨髓巨核细胞的分类与计数 来进一步明确ITP的诊断,骨髓巨核细胞的分类与计 数的变化在ITP发病中具有重要作用.本实验采用目 前国内常用的免疫造模方法,即采用注射外源性抗体 建立慢性rrP动物模型,了解中药复方紫癜颗粒对慢 性ITP骨髓巨核细胞的调控机理. 1 1.1动物SPF级健康BALB/C小鼠,体重为(20? 2)g,雌雄各半.由北京维通利华实验技术有限公司 提供,动物合格证号:SCXK(京)2002—0003. 1.2药物紫癜颗粒:由人参,黄芪,阿胶,桃仁等组 成.每100克颗粒,含生药量227.27克,由辽宁中医 学院新药制药中心生产.血康口服液:lOmL/只,由大 连金港制药有限公司生产,批号为:国药准字011121 号.醋酸泼尼松片:5mg/片,天津力生制药股份有限 公司.津卫药准字(1998)第001132号.批号: 0202003—_()8. 1.3主要试剂小牛血清白蛋白,由美国sigma公司 生产,批号为:2508—19—2,购于北京同正化学试剂公 司.瑞氏染色液,瑞氏缓冲液,北京天合力恩化学试剂 公司产品. 1.4主要仪器OLYMPUS—CHB型荧光显微镜,日 本OLYMPUS公司提供;ZKPACS—G骨髓细胞系 统,中国中科恒业公司提供. 2方法 2.1造模方法参照文献[1]进行.抗原制备: BALB/c小鼠,乙醚麻醉后,以EDTA—Na2抗凝,从眼 球取血,分离血小板并洗涤用生理盐水稀释.免疫方 法:取以上血小板分别与等量完全福氏佐剂和不完全 福氏佐剂混合成油包水状作好抗原,取含完全福氏佐 剂抗原于0周注射于豚鼠足掌,背及皮下至少4点;取 含不完全福氏佐剂抗原分别于1,2,4周注射豚鼠足 掌,背及腹部皮下,每次至少4点,第5周从豚鼠心脏 取不抗凝血,550×10min离心后取上清,即为豚鼠抗 小鼠血小板血清(GP—APS),贮存于一20c【=冰箱待 用.抗血清的处理:将APS从一20c【=中取出,置56c【= 收稿日期:2007—05—10 基金项目:国家中医药管理局项目(20oo—J—P一22) 作者简介:马骥(1946一),男,辽宁丹东人,教授,博士生导师,主要从事 方剂配伍与效用机理研究. 水浴30min,用等量BALB/c小鼠红细胞吸附至少两 次,用生理盐水稀释成不同浓度APS待用..建立慢 性ITP模型:采用注射豚鼠抗小鼠血小板血清(APS) 方法,于1…357,9,11,13d,按照lO0~L/20g给小鼠 腹腔注射1:4稀释的APS,每2天重复注射1次,以维 持血小板的持续降低.在首次注射APS后6小时,血 小板降低至原水平的47.6%,8小时降低至原水平的 21.5%时,反复注射APS使血小板在7天内维持原水 平的1/3,1/4,即为成功模型. 2.2分组处理将84只BALB/c小鼠按血小板计数 随机分为8组,每组12只.正常组,正常饲养,不予特 殊处理.于第8天以生理盐水灌胃,每次0.4mL/20g 体重,每日1次,共1周.模型组:于造模后第8天以 生理盐水灌胃,每次0.4mL/20g,每日1次,共1周. 正常进食.血康口服液组:于造模后第8天以血康口 服液灌胃,每次0.4mL/20g,每日1次,共1周.醋酸 泼尼松组:于造模后第8天始用醋酸泼尼松灌胃,先将 片剂研细粉,用蒸馏水配成100%的混悬液,按 0.4mg/20g体重给药(相当于成人用药量的9倍),每 日1次,共1周.紫癜颗粒组:于造模后第8天开始用 紫癜颗粒剂灌胃,大剂量组按0.32g/20g体重给药(相 当于成人用药量的18倍),中剂量组按0.16g/20g体 重给药(相当于成人用药量的9倍),小剂量组按0. 08g/20g体重给药(相当于成人用药量的4.5倍),每 日1次,共1周. 2.3观察指标实验结束后处死动物,迅速剥离股骨 (左下肢)和胸骨.?取出胸骨骨髓,用25L小牛血 清混匀,迅速涂片,风干后做瑞氏染色,用光学显微镜 观察:先用10×10倍视野(低倍)找见巨核细胞,然后 换成10×100倍(油镜)视野确认;每张骨髓片以计数 100个巨核细胞数为基准;根据形态特点将巨核细胞 分为4型:原始型巨核细胞,幼稚型巨核细胞,颗粒型 巨核细胞,产板型巨核细胞.?将剥离的股骨用骨髓 冲洗液反复冲洗骨髓细胞,用细胞离心机制备涂片标 本,风干后做瑞氏染色,每张骨髓片以直径6mm的圆 内细胞数目为基准,光镜下观察全片巨核细胞数. 2.4统计方法实验数据用均数?差(?s) 表示,用SPSS软件包进行One—way方差分析和组间 t检验,P<0.05表示有统计学意义. 3结果 3.1紫癜颗粒对ITP模型小鼠骨髓巨核细胞计数的 影响结果见表1.从表1中可以看出,与正常对照 组比较,模型组小鼠骨髓巨核细胞数明显增多;与模型 组比较,血康组,泼尼松组,紫癜颗粒大,中剂量组小鼠 的骨髓巨核细胞数均不同程度地降低,有显着性差异 ? 996 (P<0.05);与血L康组,泼尼松组,紫癜颗粒中剂量组 比较,紫癜颗粒大剂量组小鼠的骨髓巨核细胞数明显 下降,均有显着性差异(P<0.05). 表1紫癜颗粒对ITP模型小鼠骨髓巨核细胞计数的影响(x?) 注:与正常组比较,??P<0.01,?P<0.05;与模型组比较,} }P<0.O1.}P<0.05;与皿康组比较,??P<0.05,AP<0.05; 与泼尼松组比较,??P<0,01,?P<0.05;与颗粒小剂量组比较, 辽宁中医杂志2007年第34卷第7期 ??P<0.O1,?P<0.05. 3.2紫癜颗粒对骨髓巨核细胞分类的影响结果见 表2.从表2中可以看出,与正常组比较,模型组小鼠 的骨髓幼稚巨核细胞和颗粒巨核细胞明显增多,产板 巨核细胞明显降低,有显着或非常显着性差异(P< 0.05,P<0.O1).与模型组比较,血康组,泼尼松组 小鼠的骨髓幼稚巨核细胞和颗粒巨核细胞数明显降 低,产板巨核细胞数明显增高,有显着性差异(P<0. 05);紫癜颗粒大,中,小剂量组小鼠的骨髓幼稚巨核 细胞和颗粒巨核细胞数均呈不同程度地降低,各组均 有显着性差异(P<0.05),紫癜颗粒大,中剂量组小 鼠的骨髓产板巨核细胞数明显增高,有显着性差异(P <0.05).与泼尼松组,紫癜颗粒中,小剂量组比较, 紫癜颗粒大剂量组小鼠的骨髓产板巨核细胞数明显增 高,均有显着性差异(P<0.05). 表2紫癜颗粒对1TP模型效鼠骨髓巨核细胞分类的影响(;?) 注:与正常组比较,?P<O.05;与模型组比较,P<O.05;与血康组比较,AP<O.05;与泼尼松组比较,?P<O.05;与颗粒小剂量组比较,? P<0.05. 4讨论 本实验采用免疫方法造模,该模型的病理组织学 改变与人类ITP相似,且重复性好,为目前国内外常用 模型之一.因此本实验以该ITP模型小鼠为研究对 象,了解骨髓巨核细胞的变化与ITP发病的关系及其 紫癜颗粒的作用环节及机理.有研究表明J,ITP患 者的骨髓巨核细胞质和量及血小板形态有明显的异 常,在幼稚及颗粒巨核细胞阶段,ITP患者骨髓巨核细 胞GP?b,GP?a均明显低于正常对照组,表明ITP患 者骨髓巨核细胞GP?b,GPma的合成减少,使得骨髓 巨核细胞由幼稚到成熟的发育时间延长,可能是自身 抗体作用于骨髓巨核细胞,导致巨核细胞发育受损,阻 碍成熟. 研究结果还显示,模型组巨核细胞数和未成熟巨 核细胞数一致性增高,与对照组比较有显着性差异,提 示当ITP发生时可因血小板下降刺激骨髓巨核细胞前 体细胞增殖,导致巨核细胞前体细胞进入形态学可辨 认阶段的数量增加.在模型组,不成熟的巨核细胞数 明显高于其它各组,但产板型巨核细胞却明显降低,提 示ITP模型小鼠骨髓存在巨核细胞增生及成熟障碍, 符合临床慢性ITP骨髓象的改变.其原因可能是由于 血小板和巨核细胞具有相同的抗原性,血循环中所存 在的抗自身血小板抗体既能破坏血小板又能阻碍巨核 细胞的分化,成熟和释放血小板的功能,在影响巨核细 胞发育成熟的同时,又引起骨髓巨核细胞系形态,数目 的改变,更影响了血小板的生成.可见,由于血小板抗 体的增高,使得血小板破坏过多,继而导致骨髓巨核细 胞代偿性增生并呈成熟障碍”J. 抗血小板抗体对巨核细胞的直接作用是产生巨核 细胞形态学异常,影响巨核细胞质和量改变的重要因 素,而细胞质量的改变也有助于成熟的判断.骨髓巨 核细胞成熟障碍的形态学表现多为骨髓中成熟型巨核 细胞比例减少,过渡型及幼稚型巨核细胞比例增多. 有人认为在数量上确立成熟巨核低于25%作为成熟 障碍标准较为合适.临床研究表明多数rrP患者骨髓 巨核细胞呈增生性改变主要是不成熟的巨核细胞增 多,且随疾病的好转而逐渐恢复至正常值,对ITP病人 进行骨髓巨核细胞计数及分类与判断疾病的疗效是相 关的,是一项较为灵敏的指标. 实验证明,紫癜颗粒的大剂量组在抑制不成熟的 骨髓巨核细胞增生及促进骨髓产板巨核细胞作用方面 明显优于其他各组.其原因可能是通过益气健脾,培 补后天以养先天,祛瘀以生新,促进了骨髓巨核细胞的 发育成熟;或者是通过促进血小板的生成,以及消除血 小板相关抗体,减少血小板的破坏,同时减轻了对骨髓 巨核细胞成熟的抑制.但紫癜颗粒究竟作用在哪个环 节还有待于进一步研究. 参考文献 [1]杨宇飞,周霭祥,麻柔,等.免疫性血小板减少性紫癜动物模型建 立[J].中华血液学杂志,1994,15(4):160—162 [2]富琦,范颖,王家辉,等.免疫性血小板减少性紫癜病证结合动物 模型建立与评价[J].中国中医基础医学杂志,2od4,10(2)30—31 [3]杨宇飞,周霭祥,麻柔,等.免疫性血小板减少性紫癜实验模型研 究进展[J].中国中医基础医学杂志,1995,1(3)43-45 [4]车春兰,钱林生,卞寿庚,等.原发性血小板减少性紫癜骨髓巨核 细胞的形态[J].中华血液学杂志.1986,9(5):265—267 [5]俞智华,陆得炎,陈唤青,等.ITP患者的异常免疫对骨髓巨核祖 细胞的影响[J].南通医学院,1996,(2):178—179 [6]李朝阳,周家琴,马明信.特发性血小板减少性紫癜骨髓巨核细胞 的发育[J].中华血液学杂志,1992,13(2):90—91 [7]王同保,张欣欣,冯剑飞.原发性血小板减少性紫癜骨髓巨核细胞 成熟状态[J].中华儿科杂志,1994,32(2):110 [8]唐雪梅,唐晓兰,何文华,等.特发性血小板减少性紫癜9o例骨髓 与疗效分析[J].四川医学,2002,23(2):177