慢病毒感染目的细胞

实验室前期准备工作 细胞房在使用前30min先开机净化 实验人员进出细胞房时，必须关闭前一扇门以后，再开启后一扇门； 实验人员进细胞房前必须穿反身衣，佩戴手套，病毒操作需戴双层手套及双层口罩； 实验人员进细胞房后，需用75%酒精消毒； 慢病毒感染目的细胞 “多聚阳离子Polybrene”可通过中和细胞与病毒颗粒间的静电排斥而促进其帖附，进一步提高病毒感染效率。但Polybrene并非所有细胞都适用，以下Polybrene预处理步骤仅适用于对Polybrene无明显毒理反应的细胞，不加Polybrene的细胞可直接跳过此步骤。Polybrene的工作终浓度为2~10μg/ml，一般常用5μg/ml（以下以5μg/ml为例）特定细胞对Polybrene的适用情况可咨询汉恒生物病毒技术工程师。” 细胞准备： 将状态良好的目的细胞接种到6孔板，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。 感染前，将接种细胞的6孔板从培养箱中取出，吸去细胞原有培养基，加入新鲜的完全培养基，再加入Polybrene。 ① 以6孔板为例，在加入2ml新鲜完全培养基后，加入汉恒生物提供的母液浓度为10mg/ml的Polybrene 1μl；轻轻8字混匀后放入培养箱中孵育30min。 ② 30分钟后，从细胞培养箱中拿出细胞；同时，从冰箱中取出慢病毒，缓慢冰上溶解，将病毒液按不同MOI加入细胞中（操作应尽量放在冰上），轻轻8字混匀，37℃的培养箱中继续培养约12h。 ③ 感染后第二天（约12小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养48h。 ④ 感染后48h，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观察GFP表达效率；对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液筛选稳定转导的细胞株 ⑤慢病毒感染4天后收集细胞，进行WB检测，判断过表达效率