【doc】神经损伤相关基因tropic1808在大鼠腓肠肌组织中的
达及其克隆
神经损伤相关基因tropic1808在大鼠腓肠肌
组织中的表达及其克隆
中国交通医学杂志20O5年箍19卷第4期
chinMedJofCommunications.2005.V9JNo.4?315- ?
论着与基础研究?
神经损伤相关基因tropic1808在
大鼠腓肠肌组织中的表达及其克隆.
刘梅姚健张晖姚登兵顾晓松
(南通大学,江苏省神经再生重点实验室,江苏226001)
摘要目的:探讨t~pic1808基因在sD大鼠腓肠肌组织中的表达及其基因序列情况.
方法:采用Westernhlot方法
在成年SD大鼠腓肠肌组织中可见阳性反应蛋白条带.进而根据登录基因
一
系列引物从腓肠肌组织总RNA逆转录
第一链中扩增ta:~elS08基因,经SJuthem验证.RT—PCR产物经巢式PCR扩增出
一个特异条带,并对该片段测序分
析.结果:与tmpiclS08基因100%同源.结论:在成年SD大鼠腓肠肌组织中存在
tmpicl808基因,但其表达丰度较低.
关键词SD大鼠腓肠肌tropiel808基因克隆中图分类号Q785(;/786
GeneExpressionandCloneofTropicl808fromGastrocnemiusmuscleoftheSDRat
LiuMei.YaoJian,ZhangHui,YaoDengbing,GuXiaosong (NantongUniversity,TheJiangsukeylaboratoryofNeuroregeneration.Jiangsu226001)
AbstractObjective:Toinvestigatetheexpressionoftropiel808geneanditsmRNAsequencei
nCmstrocm~niusmuscle
oftheSDrats.Methods:ThepositivebandsofproteinwereobservedbyusingWesternBlotana
lysis.Thenaseriesofprim?
ersweredesignedtoobtaintheRT—
PCRproductsoftropiel808fromGastrocnemiusmuscleandtheamplifiedfra~ents
wereconfirmedwithSouthernBlot.Result:Theproductofnest—PCRW85sequencedandsearchedinGenBankanditWSS foundthatthecDNAfragment吣completelyhomogeneoustothesequenceoftropiel808reported.Conclusions:Thestudy
doaaonstratedthattropiel808genedoesexistinGastrocnemiusmu~leoftheSDratswithlowe
rexpression.
KeywordsSDRatGastrocnemiusmuscleTropiel808Geneclone
Tropic1808基因是在克隆与神经损伤相关基因时
从SD大鼠神经组织文库中获得的一个eDNA序列,
蛐nl【登录号AF078811【lJ.我们以往的实验研究发
现原核表达系统的该基因产物与离体培养的背根神经节
联合培养有明显促进神经突起生长的作用L2J,并具有保
护受损神经元减少神经元凋亡的生物学作用;免疫组
织化学表明在周围神经损伤后tropic1808基因表达显着
分布于损伤近侧和远侧端的施万细胞[4】,原位杂交研究
表明TropielS08基因在损伤坐骨神经组织的表达显着
高予正常坐骨神经组织,主要表达在其远侧端增殖的施
万细胞b】.提示该基因可能在促神经生长和神经损伤后
修复过程中起作用.为探知tropiel808基因是否在坐骨
神经支配的腓肠肌组织中表达,本实验采用Westernblot
方法,以tropiel808单抗进行免疫印迹反应.有阳性反应
蛋白条带出现.进而根据登录的tropiel808基因eDNA
序列设计了一系列引物,采用RT—PCR法.从SD大鼠
腓肠肌组织总RNA逆转录PCR产物中经巢式PCR扩
增出tropiel808基因CDS区片段,克隆入T载体,并经
序列测定
.
1材料和方法
1.1动物与试剂健康成年SD大鼠由南通大学实验
动物中心提供.Tropic1808基因重组蛋白单克隆抗体. 由南通大学江苏省神经再生重点实验室制备[2;NC膜, 半干电转移装置购自Pharmaeia公司;碱性磷酸酶(AP) 标记的羊抗小鼠IgG,Trizol试剂购自GibeoBRL公司; Aerylamide,Bisaerylamide,s,SDS购自上海西巴斯生物 技术公司;SDS低分子量
蛋白购自上海丽珠东风生 物技术有限公司.第一链eDNA合成试剂(OmniscriptTM RTKit)购自Qiagen公司,pGEM~一TEasyVectorSys— tems,标记Kit(prime—a—gene),X—gal,IPTG购自Pro— mega公司.TaqDNA聚合酶,EcoRI等常用试剂购自上 ?[基金项目]国家自然科学基金(3O27O427),南通市社会发展科技计划(s2015)
?
316?19卷第42005.Vl01.19.No.4 海试剂公司,尼龙膜购自宝灵曼公司,杂交液(Ex pressHybHybridizationSolution)购自Clonthch公司,[a 一
北P]darP(10~ciM)购自北京亚辉公司,凝胶回收Kit 购自Qiagen公司.其它普通试剂,均为分析纯.
1.2引物合成根据登录的tropielS08基因序列设计引 物:1808一up:5'gcgattaatgttggtc~gtg3',在185--205位点; 1808一down:5'ttcaggatcagacgcggcat3',在1564,1583位 点;在trod808eDNA上扩增片段长度分别为1399bp. 18o8nest—up:5'曙嘲ttaa',在544,564位点;
1808nest—c~vng5'acgatagcagcaatgteatca3',在1366,1387 位点,在tropielS08eDNA上扩增片段长度分别为844bp. 由上海生工生物技术工程有限公司合成.
1.3总蛋白提取及电泳分离成年SD大鼠腓肠肌组 织称重,按1:10加入含有100mmol/Lriffs—Ca缓冲液
(pH6.8),1.0mmo1]LPMSF,6%SDS,2%13一巯基乙醇的 SDS匀浆缓冲液,冰浴匀浆20min,4E离心取上清,总蛋 白用Bradford法定量.加入等体积2XSDS电泳上样缓 冲液.沸水浴5min,离心取上清为样品,每泳道蛋白量 10t~g.分离胶浓度10%,辅以2SDS低分子量标准蛋 白为标准参照.
1.4转膜及免疫印迹反应半干转移法将SDS—PAGE 后的电泳样品转移至NC膜.转膜后将sDS低分子量标 准蛋白泳道裁下,考马斯亮蓝染色,其它泳道的NC膜留 做免疫印迹反应.3%脱脂奶粉包被;一抗tropic1808基 因重组蛋白单克隆抗体,为本实验室细胞工程研究室制 备【zJ.二抗碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗小鼠IgG; BCIP显色液室温避光显色,待出现特异性反应条带即入 0.01mol/LPBS中终止反应.
1.5总RNA制备及逆转录PCR反应正常SD大鼠腓 肠肌组织75mg,Trizol试剂lml提取总RNA.甲醛变性 胶电泳检测其完整性.采用紫外分光光度计,测定 0印及OI32fIo值,计算RNA含量.逆转录反应按Kit操 作步骤进行:总RNA2,10~mol/LOligo(dT)l2?1l, 随机六聚体引物1l,10×逆转录缓冲液2,5mmol/L dNTPmix2d,逆转录酶lt,l(4U),RNase-freeH20补至 20,37?1h.取eDNA2VI以tropic1808上下游引物进 行P(扩增.反应在PTC一150型PCR扩增仪(MJ公 司)上进行,执行程序:94?60s,52?40s,72?60s,循环 32次.1%琼脂糖凝胶电泳检测.
1.6RT—PCR产物的Southern验证将RT—PCR产 物纯化乙醇沉淀溶于较小体积的TE中,辅以tropic1808
质粒为阳性对照,NGF质粒(pEGM—TVector构建)为 阴性对照,以及标准分子量DNA在1%琼脂糖凝胶上进
行电泳分离.毛细管法转移DNA至尼龙膜上,转移液 20XSSC.将尼龙膜依次经变性液,中和液和2XSSC.置 两张滤纸之间.80?2h.
以tropiel808质粒为模板,tropiel808巢式上下游引 物进行PCR扩增,产物经乙醇纯化沉淀溶于灭菌双蒸水 中使终浓度为25ng//A,按标记Kit要求进行探针制备. 将变性处理的尼龙膜放入5ml预杂交液中60?预 杂交30min,加入经热变性的探针,杂交4h.按杂交液说 明严格洗膜:洗膜液(2XSSd0.05%SDS)室温洗2次 (每次30rain),洗膜液(0.1×SSd0.1%SDS)60?洗2 次(每次30min),2XSSC中漂洗,用保鲜膜包裹,覆上x 光片,用Monitor探知放射强度,置暗夹中曝光,曝光至 合适时间洗片.
1.7巢式PCR扩增将1.6中RT—PCR扩增产物以 TE作100倍稀释,稀释PCR产物2t,1为模板,1808nest —up/1808nest—down为引物进行巢式PCR扩增.执行 程序:94E45s,55?40s,72?45s,循环32次.1%琼脂 糖凝胶电泳检测.
1.8PCR产物的克隆测序凝胶回收Kit回收巢式 PCR产物,电泳检测回收效果并用定量标准分子量DNA 定量.取回收产物3(约100ng)与T载体连接,按Kit 说明操作.4E连接l2,16h.热震惊方法将连接产物转 化大肠杆菌DH5a感受态,涂于含X—gallIPTG/Amp的 1l5%琼脂平皿上.37?倒置培养l2,16h.挑取白斑 置LB(Amp+)培养基中扩增,小量碱法抽提质粒DNA. EcoRI酶切鉴定,将酶切片段长度符合插入片段长度的 质粒送联合基因测序部测序.送C~fl3ank检索. 2结果
2.1Westernblot结果采用tropic1808基因重组蛋白
单抗与腓肠肌总蛋白进行Westernblot反应,分别在 45kDa和29kDa处出现明显阳性反应蛋白条带(图1). IM
"*-66AkDa
+3.0kDa
.I31.0=I
0.1kDa
图l成年SD大鼠腓肠肌组织W~stemblot结果 M:低分子量标准蛋白;1:成年SD大鼠腓肠肌组织总蛋白
生国交通医堂杂志第卷第期JofCommunications.2005,Vo1.19.No.4
2.2总姐的检测甲醛变性胶电泳,28S和18S条 带清晰可见,5S条带隐约可见,提示RNA未降解. ‰/0D为1.915,说明RNA纯度满意.
2.3RT—PCR及Southern杂交结果以第一链eDNA 为模板,以tropicl808上下游引物进行PCR扩增.1%琼 1234M
*-2000bp
一1OOObp
?一750bp
?
317?
脂糖凝胶电泳检测未见特异扩增带(图2).Southern杂 交可见RT—PCR产物泳道有一特异杂交信号,位于标 准分子量DNA1000bp与2000bp之间,与预计扩增片段 长度相符;阳性对照有强阳性信号;阴性对照未见杂交信 号(图3).
】234M
图2RT—PCR结果图3Southern杂交结果
1:NGF质粒(3.3kb)阴性对照;2:tropicl808质粒(5.6kb)阳性对照;3:RT—PCR产
物;4:RT—PCR产物(重复上样泳道);M:标准分 子量DNA(DL一2000)
2.4巢式PCR结果巢式PCR扩增出一特异条带,位 _j:标准分子量DNA750bp与1000bp之间(图4). 2000bp
1000bp—}
750bp—}
500bp—
Ml2
圈4巢式PCR结果
M:标准分子量DNA(DL-2000); 1:巢式PCR扩增片段;2:P阴性对照
2.5PCR产物克隆与序列测定所得重组质粒经ABI PRISM310型激光荧光自动测序仪(PERKNINELMER 公司,美国)测序,巢式PCR扩增片段产物序列通过 BLAST相似性检测,与GenBank登录的tropicl808基因 100%同源.见图5.
圉5巢式PCR扩增产物测序结果
3讨论
Tropie1808基因ORF区828bp,编码275个氨基酸, 分子量约30kDa….原核表达该基因产物与离体培养的 背根神经节联合培养有明显促进神经突起生长的作 用川;tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体亲和层析 大鼠损伤坐骨神经组织中有tropic1808基因特异表达的 蛋白HJ.原位杂交显示Tropic1808基因主要表达于损伤 坐骨神经组织远侧端增殖的施万细胞J,推测该基因可 能在促神经生长和神经损伤后修复过程中有作用.为了 探知tropicl808基因是否在坐骨神经支配的腓肠肌组织
中表达及其可能存在作用的基础,我们采用tropic1808 基因重组蛋白单抗与腓肠肌总蛋白进行Westernblot反 应,有明显杂交信号(如图1所示),分别在45kDa和 29kDa大小处出现明显阳性反应蛋白条带,推测在SD大 鼠腓肠肌组织中有与tropicl808基因同源的基因存在, 亦可能存在不同的剪接本或可能存在与相关蛋白的交叉 反应.因此我们按照登录的tropicl808基因设计了一系 列引物,采用RT—PCR法,检测在SD大鼠腓肠肌中是 否有troplc1808基因的存在,以期进一步研究tropicl808 表达的组织特异性.
实验中我们发现RT—PCR产物直接电泳检测未见 扩增条带,曾推测由于引物设计所参照的登录基因为鼠 脑文库来源基因是否设计引物有失配的可能,或是该基 因在腓肠肌组织mRNA丰度较低.采用Southerrl杂交 的方法进行验证,结果发现一条特异的杂交信号,故认为 tropic1808基因mRNA在腓肠肌组织中丰度较低.在EB
?
318?生国交通医堂杂志2Q笙筮i窆鲞筮期hjI垫盟s.2!! 染色灵敏度尚不可见,放射性同位素可检测RT—P(,R 特异扩增产物的存在.在此情况下,我们采用巢式引物 进行扩增.巢式PCR法对于表达丰度低的基因的克隆是 一
种切实可行的手段[6哪】.通过巢式PCR扩增.我们获 得了特异的扩增条带,并对该片段进行了克隆和测序分 析,据联合基因公司序列分析结果经检索分析与已登录 的tropicl808基因100%同源.此实验结果为进一步研 究tropic1808基因在坐骨神经支配的腓肠肌组织中的表 达提供了依据.
参考文献
1.GuXisosong,ThomasPK,TmX1gling,eta1.Molecular cloningofTropic1808protein,anovdfactorinducedbyn~d've injury.JAnat1999;194:604—605
2.崔学芝.顾晓松,张沛云.等.Tropicl808基因的原核表达和
表达产物的生物活性.中国生物化学与分子生物学杂志
2001;17(5):569—573
3.王晓冬,陈罡,张沛云.Tropicl808基因重组蛋白对损伤
坐骨神经脊髓细胞凋亡的影响.科学技术与工程2003;3
(2):133—136
4.陈雪,张沛云.王晓冬,等.周围神经损伤后TropiclS08基因
表达蛋白的免疫组织化学研究.解剖2004;35(3);234
?—
239
5.丁斐.徐炜岚,顾晓松.Tropicl808基因在大鼠损伤神经组
织中的表达.中国组织化学与细胞化学杂志2004;13(1):
24—26
6.ChengJinHu.DaoUYang.Adetectingmethodforperipheral venoLk~lAFPmRNAinhepatocellularcarcinoma.ChinaNatlJ NewGastroenterol1997;3(3):198—199
7.JinXiaoplng,PengJibin,HuangFang,eta1.AmRNAmolecule encodingtruncatedexcitatoryaminoacidcarrier1(EAAC1) protein(EAAC2)istrm~ibedfromanindependentpromoter butnotanalternativesplicingevent.CellR~search2002:12(3 —
4):257—262
8.JiangW,YangCQ,LiuWB,eta1.Blockageofamforming growthfactorbetareceptorspreventsprogressionofpigBrum—
inducedratliverfibrosis.W0r】dJGastroenterol2004;10(11):
1634—1638
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i《浙江创伤外科》杂志2006年征订启事i
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l《浙江创伤外科》杂志是经国家科技部,国家新闻出版总署批准,浙江省教育厅主管,温州医i
5学院主办,浙江大学脑医学研究所,温州医学院附属第一,第二医院和浙江省台州医院协办.本5
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2《浙江创伤外科》杂志为双月刊,国内外公开发行,cN33—1253/R,IssN1009—7147,采用l
5铜版纸印刷,包装精美,定价每期8.o0元,全年48元.双月底出刊.{ ;本刊宗旨:面向临床,服务临床;面向基层,服务基层.栏目设专家讲座,论着,临床研究,诊;
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