鼻粘膜内分泌表达大分子蛋白沿“鼻－脑”通路入脑的研究

鼻粘膜内分泌达大分子蛋白沿“鼻－脑”通路入脑的研究 BatchDoc-Word文档批量处理工具 鼻粘膜内分泌表达大分子蛋白沿“鼻, 脑”通路入脑的研究 12吴昊，杨宇 (1. 吉林大学第一医院肾病科，长春 130012; 2. 吉林大学第一医院神经内科，长春 130012) 摘要:目的:利用分 ”通路长期稳定导入 脑内的。方法:子生物学技术寻求将大分子蛋白类药物沿“鼻,脑 昆明小鼠 8 只，随机分为两组，每组 4 只。分别滴鼻给予小鼠已构建成 功的 PSSHG/NT4-GFP- Ant 穿膜肽重组腺相关病毒和对照组 PSSHG/GFP 重组腺相关病毒，每次 每只鼻孔滴入 10ul 病 毒液，每日一次，连续滴鼻 5 天。10 日后处死小鼠，脑组织冰冻切片， 共聚焦显微镜观测脑 组织内绿色荧光表达情况。结果:滴鼻 PSSHG/NT4-GFP-Ant 重组腺相关 病毒小鼠组可在鼻粘膜、嗅球、海马观测到绿色荧光表达，其余脑组织内未见荧光表达。而 对照组 PSSHG/GFP 重组腺相关病毒小鼠组鼻粘膜上可见绿色荧光表达，嗅球、海马、其他脑 组织未见荧光表达。结论:两种重组腺相关病毒均能感染鼻粘膜细胞，并在鼻粘膜处表达目 的蛋白;用腺相关病毒介导体内分泌表达的单纯大分子蛋白不能沿鼻,脑途径入脑;用腺相 关病毒介导体内分泌表达经穿膜肽修饰的大分子的蛋白可沿鼻,脑途径入脑。 关键词:滴鼻给药;鼻,脑通路;冰冻切片;共聚焦显微镜 中图分类号:Q784 The delivery of macromolecular proteins to the brain via“nose-brain” pathway by expressive“NT4-GFP-Ant” recombinant gene in vivo 12Wu Hao, Yang Yu (1. Department of Nephrology Medical, First Hospital, Jilin University, ChangChun 130012; 2. Department of Neurology Medical First Hospital, Jilin University, ChangChun 130012) Abstract: Objective To find a suitabale way to deliver macromoleculal biological proteins into the brain via nose-brain pathway. Methods The kunming rats were divided into two groups. One group were given pSSHG/ NT4-GFP-Ant AAV at a dose of 10ul per day of each nostril by intranasal administration. The other group were given pSSHG/ GFP AAV in the same way. The rats were killed after ten days and made in frozen slides, and then were detected by laser confocal microscope. Results The fluorescence can be observed at the membrana mucosa nasi, olfactory bulb and hippocampus in the group which was given pSSHG/NT4-GFP-Ant by intranasal administration. By contrast, the fluorescence can be observed only at the membrana mucosa nasi in the group which was given pSSHG/ GFP. Conclutions The annimal experiment confirmed that macromolecular protein modified by cell penetrating peptides can be deliverde into brain via “nose-brain” pathway. Keywords:nose-brainpathway;intranasaladministration;Recombinantadeno-associatedvirus(rAAV); laser confocal microscope 近年来，有研究发现鼻脑之间可能存在着潜在的快捷通路，因此在治疗中枢神经系统疾 病方面，鼻脑通路将成为一种最有潜力的新型给药途径。这种给药方式可避免经血液循环入 [1,2]脑而引起的外周副作用，有着脑内药物浓度高的优点 。研究认为小分子物质(小于10KD ) [3-5]可以通过弥散方式沿鼻黏膜途径进脑。然而大分子物质能否沿此路径入脑仍有待证实。 基金项目:国家自然科学基金(30872721);国家自然科学青年基金(30801211);高等学校博士学科点 专项科研基金新教师基金(200801831073) 作者简介:吴昊(1979-)，女，主治医师，. E-mail: docwuhao@sina.com BatchDoc-Word文档批量处理工具 BatchDoc-Word文档批量处理工具 作者先期已成功构建 PSSHG/ NT4- GFP- Ant 重组腺相关病毒及 PSSHG/ GFP 重组腺相关病毒，拟通过滴鼻给药途径，对比观察鼻粘膜重组腺相关病毒介导表达的经穿膜肽修饰的大分 子报告蛋白和单纯报告蛋白能否沿“鼻,脑通路”通过血脑屏障入脑。从而为进一步探索将 大分子治疗蛋白通过滴鼻给药途径入脑组织进行基因治疗奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 昆明小鼠 8 只(3 月龄，第四军医大动物试验中心提供)、PSSHG/NT4-GFP-Ant 重组 腺相关病毒(已构建成功)、PSSHG/GFP 重组腺相关病毒(西安华广生物工程有限公司赠 送)、液氮、冰冻切片机、共聚焦显微镜。 1.2 方法 1.2.1 昆明小鼠随机分 2 组， PSSHG/NT4-GFP-Ant 重组病毒组和 PSSHG/GFP 重组病 毒组，各组 4 只。 分别滴鼻给予小鼠 PSSHG/NT4-GFP-Ant 重组腺相关病毒液和 PSSHG/GFP 重组 1.2.2 腺相关病毒液，每次每只鼻孔滴鼻 10ul，每日一次，连续滴鼻 5 天。 1.2.3 10 日后处死小鼠，鼻粘膜和脑组织冰冻切片，包括嗅球、海马、其余脑组织切片。 1.2.4 共聚焦显微镜观测各组小鼠脑组织内绿色荧光情况的表达情况。 1.2.5HE 染色，于光镜下观察。 2 结果 2.1 共聚焦显微镜下观察两组小鼠冰冻切片 滴鼻 PSSHG/NT4-GFP-Ant 重组腺相关病毒液组小鼠鼻粘膜、嗅球、海马均见荧光表达， 而其他脑组织未见荧光。对照组滴鼻 PSSHG/ GFP 重组腺相关病毒组小鼠仅鼻粘膜见荧光表 达，嗅球、海马及其他脑组织未见荧光。(见表 1,1)。 表 1-1 两组小鼠脑内各部位荧光表达情况 鼻粘膜嗅球海马其他脑组织 PSSHG/NT4-GFP-Ant4/44/43/4O/4 荧光强荧光较强荧光弱无荧光重组腺相关病毒组 PSSHG/GFP 4/4 0/4 0/4 0/4 重组腺相关病毒组荧光强 无荧光 无荧光 无荧光 (注:X/4 分母表示 4 只鼠，分子表示有多少只鼠有荧光) 2.2 共聚焦显微镜下各组织冰冻切片荧光表达见图 1-1、图 2-1、图 3-1 HE 染色可见各组织形态特点见图 2-3、图 2-4、图 3-3、图 3-4。 2.2.1 鼻粘膜 BatchDoc-Word文档批量处理工具 BatchDoc-Word文档批量处理工具 图 1-1:鼻粘膜组织切片荧光(200×) 图 1-2:鼻粘膜组织切片(200×) 2.1.2 嗅球 图 2-1:嗅球组织切片荧光(200×) 图 2-2:嗅球组织切片(200×) 图 2-3:嗅球切片 HE 染色 (200×) 图 2-4:嗅球切片 HE 染色(100×) BatchDoc-Word文档批量处理工具