犬血清弓形虫IgG抗体快速诊断金标试纸条的研制

犬血清弓形虫IgG抗体快速诊断金标试纸条的研制 华中农业大学 硕士学位论文犬血清弓形虫IgG抗体快速诊断金标试纸条的研制 姓名:卓国荣 申请学位级别:硕士 专业:临床兽医学 指导教师:丁明星 20080601 犬血清弓形虫,,,抗体快速诊断金标试纸条的研制 摘 要 弓形虫病(,,,,,,,,,,,,,)是由刚地弓形虫(,,,,,,,,,, ,,,,,,)引起的以孕妇(畜)流产、弱胎、畸胎、死胎和儿童(幼畜)生长受阻、死亡等为特征的一种人畜共患病。该病广泛存在于世界各地，弓形虫宿主范围广泛，人和犬为其中间宿主，都存在一定的感染率，据报道人的弓形虫感染与养犬存在一定关系。目前，国内外学者已建立多种检测弓形虫抗原或抗体的方法，如病原学检测、间接血凝检测、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、,,,检测等，但这些方法操作较复杂、费时长且需要一定的仪器设备，在临床推广应用中受到一定的限制。因此，建立一种简易、快速、特异性强的检测方法，专用于犬弓形虫病的血清学诊断与流行病学调查，不仅有助于了解犬感染情况，同时对于阻断弓形虫由犬向人的传播也有重要的意义。 本研究用弓形虫速殖子腹腔感染昆明小鼠分别制备了弓形虫可溶性抗原和代谢分泌抗原，并用制备的代谢分泌抗原免疫健康犬获得了犬弓形虫阳性血清;采集健康犬的血清，用硫酸铵盐析法和葡聚糖,一,,,柱层析法纯化制得犬，,,，以其常规免疫健康家兔，当双向琼脂扩散试验检测效价达到,:,,以后收集兔血清，并经辛酸(硫酸铵盐析提纯制得兔抗犬,,,;用柠檬酸三钠还原法烧制直径为,,,,的胶体金颗粒，以胶体金颗粒标记兔抗犬，,,制作成金标垫，标记的最适,,值为,(,，,,,胶体金的最适标记量为,,,,，将弓形虫可溶性抗原和羊抗兔，,,分别包被于硝酸纤维素膜上做为检测线与质控线制成免疫层析试纸条。当犬血清中的弓形虫，,,抗体与试纸条上的金标抗体(兔抗犬，,,)结合后沿着硝酸纤维素膜移动，在膜上的检测线与质控线处发生特异性抗原抗体反应形成肉眼可见的红色线条。实验表明胶体金试纸条最佳检测条件:弓形虫抗原的点膜浓度为,(,,,,,,，羊抗兔，,,点膜浓度为,(,,,,,,,，胶体金标记兔抗犬，,,作,:,稀释时的检测带清晰且背景较浅。用所研制的试纸条与兰州兽研所生产的弓形虫间接血凝试剂盒比较，同时检测从临床病例中按随机抽样法采集的,,份宠物犬血清，及,份感染犬血清。,,份宠物犬血清中，试纸条法检出,份，间接血凝试剂盒检出,份;,份感染犬血清中，试纸条法检出,份，间接血凝试剂盒也检出,份，且这,份血清为相同血清，这表明两者对感染犬血清检测符合率为,,,,。总检测结果表明:两法总符合率为,,(?希ィǎ梗梗保埃埃渲醒粜院鸵跣苑下史直鹞福罚担ィǎ罚福?停梗福梗ィǎ梗玻梗常结论:本实验研制出的胶体金免疫层析试纸条和，,,试剂盒符合性好，检测犬血清中的弓形虫，,,抗体重复性好、操作简便、快速，只需,,一,,,,,，不需特殊仪器设备、结果客观准确，肉眼可判断，表明该法具有较好的犬血清弓形虫抗体诊断价值。关键词:犬;刚地弓形虫;胶体金;免疫层析法;，,,;间接血凝试验 ? 华中农业大学,,,,届顾,: ,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,, ;,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,(,,, ,,,,,,,;,, ;,,,, ,,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,，,,,,,,,,,, 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弓形虫是细胞内寄生原虫，呈世界性分布，人群感染相当普遍，是一种危害大的人兽共患病。,,,,年全国人体重要寄生虫病现状调查显示弓形虫病血清阳性率为,(,,,。弓形虫属于机会性致病原虫，正常人感染后无明显的临床症状，但对孕妇而言，弓形虫可以穿过胎盘屏障，引起流产、早产、畸胎、死胎或使妊娠并发症增加;同时也会影响胎儿。近年来，随着饲养宠物越来越多，通过宠物犬向人传播弓形虫的机会有所增加，在宠物医疗临床中经常有宠物主人要求检测其宠物弓形虫感染情况，以便主人做好预防工作，因此，建立一种快速、准确、适合,临床现场操作的方法专用于犬弓形虫感染情况检测，具有重要的现实意义和应用价值。,(,文献综述,(,(,弓形虫的发现历史及其病原学,(,(,(,弓形虫与弓形虫病的发现 弓形虫(,,,,,,,,,, ,,,,,,)又称弓形体、弓浆虫，隶属于原生动物门、孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科、弓形虫属，只有一个种:刚地种。根据其毒力、宿主来源及体外培养时间的差异又可分为不同的虫株(,,,,,，,,,,)。,,,,年，法国学者,,;,,,,和,,,;,,,,在北非刚地疏趾鼠(,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,)的脾脏单核细胞内发现该虫，因其滋养体呈弓形，故命名为刚地弓形虫。随后,,,,,,,,,(,,,,)、,,,,,,,和,,,,;,(,,,,)等诸多学者在兔、鼹鼠、犬、鸽、鼷鼠、松鼠、家鼠、貂、鸡等动物体内发现弓形虫。目前，在绝大多数哺乳动物和部分其它动物体内发现该虫。,,,,, (,,,,)在布拉克,名死于脑积水的儿童视网膜内发现病原体，这是人类弓形虫病的首例报告，之后,,,,,,(,,,,)、,,,,和,,,,,(,,,,)先后在病人体内发现弓形虫 (或假包囊)，并由,,,,(,,,,)首次从病人分离出弓形虫。 我国,,,,年首先在福建兔和猫体内发现动物间弓形虫自然感染和传播的情况(于恩庶，,,,,)。此后，相继有其他动物弓形虫病例的报告。,(,(,(,弓形虫的分类 弓形虫在生物学分类上属于:动物界(,,,,,,,,)、原生动物门(,,,,,,,,)、顶复亚，’？(,,,,,,,,, ,,,;,;,,,,,,,)、孢子虫纲(,,,,, ,,,,,,,,,,,,)、球虫亚纲(,,,;,,,,,,;;,,,,)、真球虫目(,,,,, ,,;,;;,,,,)、艾美耳亚目(,,,,,,,, ,,,,,,,,,)、肉孢子虫科(,,,,,, ,,,;,;,,,,,,,)、弓形虫属(,,,,, ,,,,,,,,,,)、刚地种(,,,;,,,,,,,,,)。 华中农业大学,,,,届硕士毕业论文 目前，大多数学者认为发现于世界各地人和各种动物的弓形虫只有,个种，即刚地弓形虫。根据地域、宿主、毒力、生活史及其发育时间的不同，可将其分为强毒株和弱毒株两群;根据从动物体和人体内分离出的弓形虫基因型频率的差异，将弓形虫分为,种基因型:，型常与人体先天性弓形虫病有关，为强毒株;，，型主要引起慢性感染，也是艾滋病患者感染的主要虫株，为强毒株;,，型主要感染动物，是 弱毒株。,(,(,(,弓形虫的形态结构 弓形虫根据其不同发育阶段而有,种不同的形态。即滋养体(,,,,,,,,,,)、包囊 (;,,,)、卵囊(,,;,,,)、裂殖体(,;,,,,,,)、配子体(,,,,,,;,,,)。在终末宿主猫体内为裂殖体、配子体和卵囊，在中间宿主犬和其他动物体内为滋养体和缓殖子。 滋养体又称速殖子(,,;,,,,,,,)，呈弓形、月牙形或香蕉形，一端较尖，一端钝圆，平均大小为?×,，,,,,,。经姬氏或瑞氏染液染色后，在普遍显微镜下可见胞质呈淡蓝色，有少量颗粒:胞核呈深蓝色，位于钝圆一端。速殖子主要存在于急性病例的腹水中，常可见到游离于细胞外的单个虫体，在有核细胞如单核细胞、淋巴细胞内可见到正在进行内双牙增殖(,,,,,,,,;,,)的虫体，有时还可见到在细胞胞质内，许多滋养体簇集形成假包囊(,,,,,,;,,,)。 包囊又称组织包囊(,,,,,, ;,,,)，呈卵圆形，具有一层由虫体分泌而成的嗜银性和富有弹性的坚韧囊壁，囊中的虫体称为缓殖子(,,,,,,,,,,)，可有数十个到数千个不等;包囊的直径,,”,,’,,,,,，可在患者体内长期存在，并随虫体的增殖而逐渐增大至,,,,,,。包囊主要存在于慢性病例的脑、骨?兰 ?募『褪油さ茸橹卵囊只见于终末宿主猫科动物。卵囊刚随猫粪排出时呈圆形或椭圆形，未孢子化，具两层光滑透明囊壁，大小约,,—,,,,—,,‖,。孢子化后，每个卵囊内形成,个孢子囊(,,,,,;,,,)，大小约,彳‖,。每个孢子囊内有,个子孢子(,,,,,,,,,,)，大小约,,,(趴,，互相交错挤在一起，呈新月形，一端较尖，一端较钝，核居中或靠近钝端。 裂殖体是弓形虫的子孢子或缓殖子进入猫小肠上皮细胞内增殖形成的含有多个虫体(裂殖子,,,,,,,,,)的集合体，呈圆形，直径为,,—,,‖,。裂殖体破裂，内部的裂殖子释放出来，游离的裂殖体大小为,,,,,,(,—,(靴,，前端尖，后端钝圆，核呈卵圆形，常位于后端。裂殖子侵入宿主细胞后，不形成裂殖体，而是发育成为大(雌)配子体(,,;,,,,,,,,;,,,)和小(雄)配子体(,,;,,,,,,,,;,,,)，后期分裂形成许多大、小配子结合形成合子(,,,,,,)，由合子形成卵囊。 , 犬,,,,清弓形虫，,,抗体快速诊断金标试纸条的研制,(,(,,,弓形虫的生活史 弓形虫的全部发育过程需要经过,个宿主，猫科动物为终末宿主(也可为中间宿主)，犬和人及其它动物为中间宿主。在中间宿主属无性生殖，为肠外或组织内循环;在终末宿主体内为肠上皮细胞内循环，包括无性及有性生殖两个阶段。 在终末宿主(猫科动物)体内的发育过程为终末宿主吞食成熟的卵囊、包囊或假囊后，囊壁被消化，其中的子孢子或滋养体释放出来，部分可穿入肠壁小血管，在组织细胞中与在中间宿主体内相似，进行内双芽生殖，但更主要的是侵入猫小肠上皮细胞内进行无性生殖和配子生殖。虫体进入细胞后迅速生长，变成椭圆形。继而核反复分裂，至一定数目后即趋向于排列在虫体的边缘，随后胞质亦分裂并与每个核结合形成裂殖体(内含许多裂殖子)。成熟的裂殖体破裂后，裂殖子散出又可侵入另外的上皮细胞，反复进行裂殖生殖。感染后,—,, ,，部分裂殖子侵入上皮细胞并发育为(雌、雄)配子体。继而雌、雄配子接合而受精为合子，合子发育为卵囊随猫粪便排出体外。在外界环境中，在适宜的温度、湿度和充足氧气条件下，,, ,发育为感染性卵囊。 在中间宿主(除猫外其它动物)体内的发育过程为弓形虫的滋养体通过口、鼻、咽、呼吸道粘膜和伤口处侵入动物和人体内。更为普遍的感染途 径是动物或人食入了感染性卵囊污染的饲草、饮水、食物等。弓形虫卵囊中的子孢子主要通过淋巴、血液循环带到全身各处，侵入各种类型的细胞内进行繁殖。在感染的急性阶段，尚可在腹腔渗出液中找到游离的滋养体。当感染进入慢性阶段时，可在细胞内形成包囊，存活数年之久。,(,(,(,弓形虫的流行病学 本病分布于世界各地，人和动物的感染很普遍，造成广泛的流行原因很多，其生活史各阶段都有感染性。 传染源主要是患病动物和带虫动物的血液、肉、内脏、唾液、痰、粪、尿、乳汁、腹腔液、眼分泌物、淋巴结等可能含有弓形虫，猫是本病最重要的传染源，受感染的猫一天可排出,,,,万个卵囊，排囊可持续,,”,’,,,，其间排出卵囊高峰期为,”’,’,,，这些卵囊在外界短期发育便具有感染各种动物(包括猫)的能力。其次被其污染的土壤、牧草、饲料、饮水等也是重要的传染来源。据调查，食用未熟的或生食肉类以及被含有卵囊污染的饲料、饮水、食物或食具均成为人兽感染的重要来源。人、几乎所有的温血动物、某些变温动物及一些节肢动物都对弓形虫具有易感性。 感染方式多样，以经消化道感染为主，另外，速殖子可经破损的皮肤、粘膜感染，胎盘感染为先天性感染的主要原因。昆虫等可机械携带本虫而起到传播作用。病原除 , 乍中农业人学,,,,届顾”卜毕业论文在中间宿主与终末宿主之间循环传递外，更为重要的是可在中间宿主范围内进行水平传播。 易感对象包括人类及各种家畜(如犬、猫、鼠、兔、猪、牛、羊)和野生动物及禽类，均可自然发病(,,,,,,，,,,,)。人类对弓形虫普遍易感，尤其是胎儿、婴幼儿、肿瘤和艾滋病患者等。长期应用免疫抑制剂及免疫缺陷者可使隐性感染复燃而出现症状。 弓形虫在不同的发育阶段对外界理化环境以及消毒剂的抵抗力各不相同，以游离的滋养体为最脆弱，包囊较弱，卵囊最强。生理盐水中的滋养体在不同温度下的存活时间: ,,?,, ,，,?,, ,，,,?,, ,，(,,?,(, ,。在牛奶和奶制品中，,,, ,，但加热到,,?或,,?，经,,或,,,,,可杀死;在,, ,(,”,,(,下,,,一,, ,，,, ,(,下,(, ,，,,,(,—,(,下,, ,,,,对消毒剂(室温)，,,石炭酸溶液, ,,,，,,,,,石炭酸溶液, ,,,,，,,来苏儿溶液, ,,,,，,,盐酸溶液, ,,,，,,,酒精,, ,,,,杀死，另外在日光直射、紫外线或超声波作用下迅速死亡。包囊在不同温度下的存活时间为,?下,, ,， ,,?下,,一,, ,,,,，对消毒剂如乙醇、过氧乙酸敏感。 一般来说，弓形虫病流行没有严格的季节性，但以夏秋发病居多。,(,(,(,弓形虫的致病机制 弓形虫的侵袭作用除与虫体毒力有关外，宿主的免疫状态亦起到重要作用，因此弓形虫病的严重程度取决于寄生虫与宿主相互作用的结果。根据虫株的侵袭力、繁殖速度、包囊形成与否及对宿主的致死率等，刚地弓形虫分为强毒和弱毒株系，目前国际上公认的强毒株代表为,,株;弱毒株代表为,,,,,,,,株，大多数哺乳动物、人及家畜家禽对弓形虫都是易感中间宿主，易感性因品种而有差异，猪是动物中最易感的，常表现急性型和爆发型流行。 速殖子期是弓形虫的主要致病阶段，以其对宿主细胞的侵袭力和在有核细胞内寄生和增殖，使细胞被破坏，速殖子逸出后又侵袭邻近的细胞，引起组织的炎症反应、水肿，单核细胞和少数多核细胞浸润。虫体经血流散播可侵犯多种器官和组织，若宿主产生了免疫力，虫体的繁殖受到抑制并产生包囊，则成为慢性感染。包囊偶尔可以破裂而释放出缓殖子，部分缓殖子可形成新包囊，部分可被宿主细胞所杀灭。缓殖子的死亡可激起强烈的过 敏性反应，形成肉芽肿病变，后期的纤维钙化灶多见于脑和眼部等。 宿主感染弓形虫后，在正常情况下，可产生有效的保护性免疫，多数无明显症状，当宿主有免疫缺陷或免疫功能低下时才引起弓形虫病。 , 犬咖浦弓形虫，,,抗体快速诊断金标试纸条的研制,(,(,弓形虫病的危害,(,(,(,对人的危害 弓形虫病是一种世界范围内的人兽共患病，宿主范围很广泛，人及大多数动物感染率都较高。弓形虫是人类优生的大敌，是当今新生儿致畸的四大病因之一。据国外报道，人群的平均感染率为,,,”,’,,,，在美国弓形虫隐性感染者约占总人口的,,,，每年至少有, ,,,名婴儿先天性感染弓形虫。据统计，我国居民的感染率为,(,,,,,(,,，有,, ,,,名新生儿受到弓形虫的损害(杜重波等，,,,,)。崔君兆(,,,,)在总结,,,,”’,,,,年全国血清流行病调查结果时报道，以，,,对,,个省、市、自治区的,, ,,,人的检测发现，平均阳性率为,(,,,(,(,,,,,,(,,,)，全国化阳性率为,(,,,，国际标准化阳性率为,(,,,。 弓形虫病的临床表现缺乏特异性，主要取决于寄生部位和机体的反应性。 人先天性弓形虫病的主要临床表现为先天性弓形虫脑病。对妊娠的影响尤为严重，被弓形虫感染的孕妇，不论有无临床症状，常可通过胎盘将弓形虫传给胎儿，直接影响胎儿的发育，并严重致畸。妊娠早期感染弓形虫常导致流产;如感染发生在妊娠后期，则常会导致胎儿死亡或早产。有弓形虫感染的胎儿，出生后常有智力低下、先天性畸形，如脑积水、硬腭裂或软腭裂、兔唇、无耳壳、无肛门及两性畸形等。 获得性弓形虫病比先天性弓形虫病临床表现更复杂。获得性弓形虫病首先出现弓形虫血症，虫体经过血流向全身播散。此时并不一定出现急性症状，这有异于其他感染。其后可出现淋巴结肿大，以头部、颈部的淋巴结肿大最为常见。中枢神经系统则常表现为脑炎、脑膜炎、脑膜脑炎和精神异常等。眼部常表现为脉络膜视网膜炎，但也有斜视、眼肌麻痹、虹膜睫状体炎、.