强酸环境下对乳酸菌生长的影响

强酸环境下对乳酸菌生长的影响 強酸環境下對乳酸菌生長的影響 1. 強酸環境,MRS-Cysteine medium含HCl,使pH值為2,這樣的酸強度是 體內胃酸的強度,檢定優酪乳中的乳酸菌是否能抵抗這樣的環境而 在此種培養基中生長。起初的培養基想法如下,欲配200ml的培 養基,在約100ml的水中溶解0.1gCysteine及14gMRS及33ml 的1N濃度的HCl,再加水至200ml,放入滅菌釜中加熱滅菌,之 後略冷卻倒入培養皿中等待凝固。 2. 從此方法中產生的問題, a. 在高溫高壓滅菌過後,在仍是高熱而呈液態的培養液中發現白色沉澱,猜測這可能是氯離子與MRS成份中的某個離子產生的沉澱,也有可能是因HCl而無法溶解的agar。將培養液倒入培養皿中時必須避免就沉澱倒入,在此就要使用熱過濾法將沉澱去除。 b. 經過高溫滅菌後,會散失一些水氣而改變pH值,甚至可能會有一些化學反應使之改變,而在高溫的環境下又不能使用pH 測定儀,所以姑且使用了廣用試紙來測試大概的酸鹼度,從比色法看出pH值大雖為2,話雖如此這樣的酸鹼值是很難定量的。 c. 將培養基倒入培養皿後,本來是要等待它凝固的,不過沒想到這樣的培養基沒辦法凝固,猜測可能是太強的酸使得agar失去效用,無法凝固,而這樣的假設在後來的測試中得到解答,在標準比例的agar溶液(100ml水中加入2g 的agar)中加入0.01M的HCl,煮沸後冷卻,但是不會凝固,大可証明熱的強酸使agar無法凝固。 3. 許多問題的產生造成培養基配製失敗,而後來假設強酸會破壞agar是在混合後給予高熱而產生的,故可能可以就先配好MRS成份及Cysteine,在高溫高壓滅菌之後略作冷卻再加入之前同樣比例的HCl,再加入水加至所需量,這樣agar可能就不會受影響。 4. 也有另外的實驗方法檢測樣本中的菌是否可抵抗強酸,直接在樣本中加入強酸,在37度培養箱中放置30min,再進行平板培養以檢測菌液中的菌數,而這樣雖然無法知道乳酸菌是否能在這樣的環境中進行繁殖,不過這樣可能更接近乳酸菌在胃酸中的狀況。實際的操作如下, a. 在4個微量離心管中分別加入1ml的sample,標示30min、1hour及?,將四管進行離心(10000rpm,5min)。 b. 離心後,倒去上清液,在標有30min及1hour的管中加入0.5ml濃度為0.01N的HCl,而在標有?的管中加入0.5ml的PB,震盪混合均勻,都放入37度培養箱中。 c. 經過30min後,將標有30min及?的微量離心管拿出來,進行菌液稀釋及平板塗菌的工作。經過1hour後,將標有1hour的微量離心管拿出,同樣進行菌液稀釋及平板塗菌。使用的培養基是MRS-Cysteine medium。 d. 塗菌完成後,把這些培養基都放入厭氧缸中培養兩天,以觀察菌落。 5. 上述操作中(姑且稱為強酸處理法),發現一些問題,可能會是影響實驗結果的因素,記錄如下, a. 在高速離心後,發現沉澱並不是那麼的明顯,甚至感覺沉澱部分比上清液多,倒去的上清液中還略呈白色,對此情形有兩項猜測,一為內含菌相當多,使得離心不足使之完全沉澱。二為這些白色部分多為樣本中含有的蛋白質。 b. 承a.,總之這樣的結果使得倒去的上清液液無法定量,如果是上述猜測一的情況,這樣倒去上清液甚至會失去一些菌,想到的解決方法為離心時間加長或是轉速加快,不過可能會因此使細菌破裂。另外的方法為吸去上清液吸去一定量(0.5ml),這樣至少維持了總體積的定量。 c. 加入HCl或是PB時是加入0.5ml,不過若是在之前倒去上清液沒有定量,此步驟之後也無法做定量的工作。所以若是如同上述吸去等量的上清液,加入HCl或是PB後是維持了總體積的定量。 d. 標示有?的sample是沒有經過酸處理的,是加入了PB之後在37度下放置了30min,當時有兩管標有?的sample,分別放置了30min及1hour,因為不是經過強酸處理,所以假設兩管的情形是相同的,這麼說的話可能甚至不在37度下放置的情況也是一樣的,如果是有差別的,那必須兩管樣本都要進行平板塗菌來觀察。 e. 在強酸處理後,曾經想過是否該高速離心並將酸液去除改成PB,但是並沒有那麼做,原因為後來要做的是菌液的稀釋,強酸也會被稀釋,而且再行離 心並倒去上清液可能會造成細菌的流失,所以我選擇直接進行稀釋。不過如 果不這麼做而會影響到塗菌培養的話,那就要另行討論了。 6. 承3.,經過測試,如果是先將MRS加熱溶解,冷卻至約50度左右,再加入 所需要的HCl和Cysteine,是可以凝固的,也就是說agar不會失去作用。如 此一來,便可以製作當初想要的“酸性培養基”用來檢驗乳酸菌是否能在這樣的 環境下繁殖。 觀察記錄, 菌落數記錄, Pia4, 90.7.16~90.7.30 菌種 不作強酸處理 強酸處理30min 強酸處理60min 菌落數 菌液濃度 菌落數 菌液濃度 菌落數 菌液濃度 日期 換算實際菌數(個/ml) 換算實際菌數(個/ml) 換算實際菌數(個/ml) -4-490.7.25 301 10 M 10 -5-5-5~ 92 10 156 10 97 10 -6-6-690.7.27 11 10 0 10 3 10 -7-70 10 2 10 6669.2*10 3.01*10 9.7*10 -5-5-590.7.27 9 10 9 10 3 10 -6-6-6~ 1 10 2 10 1 10 -7-7-790.7.30 0 10 0 10 0 10 555 9*10 9*10 3*10 Pia5, 90.7.16~90.7.30 菌種 不作強酸處理 強酸處理30min 強酸處理60min 菌落數 菌液濃度 菌落數 菌液濃度 菌落數 菌液濃度 日期 換算實際菌數(個/ml) 換算實際菌數(個/ml) 換算實際菌數(個/ml) -4-490.7.25 M 10 M 10 -5-5-5~ M 10 M 10 M 10 -6-6-690.7.27 160 10 324 10 188 10 -7-70 10 69 10 8881.6*10 3.24*10 1.88*10 -5-5-590.7.27 M 10 M 10 M 10 -6-6-6~ 285 10 M 10 117 10 -7-7-790.7.30 30 10 40 10 27 10 8882.85*10 4.0*10 1.17*10 Pia3, 90.7.16~90.7.30 菌種 不作強酸處理 強酸處理30min 強酸處理60min 菌落數 菌液濃度 菌落數 菌液濃度 菌落數 菌液濃度 日期 換算實際菌數(個/ml) 換算實際菌數(個/ml) 換算實際菌數(個/ml) -5-5-590.7.27 2 10 1 10 0 10 -6-6-6~ 1 10 0 10 0 10 -7-7-790.7.30 0 10 0 10 0 10 552*10 1*10 0 討論心得, 1. 使用的樣本是之前培養過的統一AB優酪乳內的乳酸菌,故直接使用之前認 定的菌種編號(Pia4、Pia5),然而在這次的強酸處理實驗中,並沒有出現 Pia3的菌落,可能為之前的同樣假設,Pia3是本來就在瓶中存在的菌種, 不過是要在開瓶之後一段時間才會大量生長,如果這個假設成立,那麼雖 然在第一次的實驗(90.7.25)中沒有出現,第二次之後的實驗可能就會出現 此菌落。 2. 承3.,另外的假設為Pia3這種菌是害怕強酸的,因此在強酸處理後就死亡 了。然而即使如此,在沒有經過強酸處理的培養應該會有菌落產生。所以 如果在第二次的實驗結果中,若是沒有經過強酸處理的培養中有產生菌 落,那麼第一項假設可能就成立。若是仍然沒有菌落產生,那麼可能之前 實驗所產生的Pia3菌落是雜菌汙染。 3. 承2.,若是如此,這樣又會產生一種問題,這樣的雜菌汙染為何只會產生 在統一AB優酪乳的樣本培養內,可能它是需要一另外兩種菌生長的輔助 才能生長,不過在之前的四區畫線培養中,Pia3是可以分離培養的。所以 這樣的結果是不在預期之內的。 4. 由7/27收菌的結果中來看,在強酸處理後,菌的數量看不出有明顯的變化, 而菌落型態上也沒有明顯的改變,不過在細菌體本身的變化可能是要從顯 微鏡中才能看出來。