氧化低密度脂蛋白在人主动脉平滑肌细胞对肾素前体受体表达的影响

氧化低密度脂蛋白在人主动脉平滑肌细胞对肾素前体受体达的影响 人连巨科,学坝,,学泣论文 关于学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请在以下相应方框内打“?”): ,(保密口，在一年解密后适用本授权书。 ,(不保密口。 作者签名: 日期:加嘭年,月, ,日 导师签名: ,期:砷哆年，月向日 目 录一、摘要……………………………一……………………………………?, (一)中文摘要……………………………………………………………, (二)英文摘要……………………………………………………………,二、正 文………………………………………, ,,, , , ,,，……………………, (一)前言…………………………………………………………………, (一)日,吾…………………………………………………………………。, (二)材料和方 ,(材料及试法…………………………………………………………, 剂……………………………………………………, ,(,主要试 剂……………………………………………………, ,(,标本来源及用液配制………………………………………, ,(, 主要器 材…………………………………………………, ,。实验方 ,,, , , , , ,(,人主法…………………………………………………, 动脉平滑肌细胞的培养……………………………,, ,(,实验分组?………………………………………………??, , ,(,免疫荧光技术……………………………………………,, ,(,实时荧光定量,,,技术…………………………………,, ,(, ,,,,,,, ,,,,技术…………………………………………,, ,(统计学方 法……………………………………………………,, (三)结 果………………………………………………………………,, ,(人主动脉平滑肌细胞的培养…………………………………,, ,(人主动脉平滑肌细胞(,),,免疫荧光染色鉴定……………,, ,(,,—,,,对,,,,,, ？,(,),, ,,,,表达的影响…………,, ,(, ,,—,,,在不同时间点对(,),, ,,,,表达的影响……,, ,(,不同浓度,,(,,,对(,),, ,,,,表达的影响…………,, ,(,,—,,,对,,,,,,中(,)，汛蛋白表达的影响……………,, ,(, ,,—,,,在不同时间点对(,),,蛋白表达的影响………,, ,(,不同浓度,,(,,,对(,),,蛋白表达的影响……………,, (四)讨 论………………………………………………………………,, (五)结论………………………………………………………………,, (六)参考文献…………………………………………………………,,三、综 述…………………………………………………………………,, (一)综述………………………………………………………………,, (二)参考文献…………………………………………………………,,四、附 图………………………………,,, , , , , , ,…………………………, ,五、致谢…………………………………………………………………,,肾素(前体)受体表达的影响氧化低密度脂蛋白在人主动脉平滑肌细胞对指导教师:姜一农教授(摘要硕士生姓名:刘晓云专业名称:内科学前体刺激后，可使,,,,,,磷酸化增强，平滑肌细胞过度增殖，与动脉粥样硬化相途径，激活细胞内信号转导通路，上调促纤维化基因的表达，最终引起血压升高，高血压作为另一个重要危险因素，是一个多层面的与心、脑、肾血管异常和肌细胞的增殖和迁移是动脉粥样硬化病理过程中的重要特征。氧化修饰低密度脂管炎症和高血压的发展中起着关键性作用。肾素(前体)受体〔(,,,),,,,,动脉粥样硬化(,,,,,,,;,,,,,,,，,,)是冠状动脉疾病、脑卒中和周围动脉疾病等血管性疾病的病理基础，其特征是脂质和纤维成分在动脉壁的不断积累，而且主要通过损伤内皮细胞、参与泡沫细胞的形成、调控平滑肌细胞的增殖和引起血功能障碍相关的疾病。肾素血管紧张素系统(,,,,,心肌纤维化和肾小球硬化等靶器官损害。蛋白(,,(,,,)是动脉粥样硬化发生、发展乃至不稳定斑块形成的关键因子，在(,),,〕作为,,,的新成员之一，近几年在心血管疾病和肾脏疾病中的重要性受到,,,,,,，,,,,)在血在慢性炎症性条件下，可以引发斑块破裂和血栓形成的急性临床事件。对其发病广泛的关注。该受体与肾素和肾素前体结合后，可以通过不依赖于传统的,,,,，脉粥样硬化的发生发展中起重要作用，那么,,—,,,在血管平滑肌细胞中对(,),,机制的研究已经持续了数十年，内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因素，平滑我们课题组前期实验证实(,),,存在于人脐静脉内皮细胞(,,,,,,)中，且可以通过引起内皮细胞功能紊乱、炎症因子表达等机制参与动脉粥样硬化的发生和发展。既往有研究证实在血管平滑肌细胞中亦存在(,),,的表达，以肾素或。肾素关。而,,(,,,刺激诱导的平滑肌细胞表型转化、异常增殖和迁移至内膜下，在动小板粘附、聚集等多个方面参与,,的发生发展。动脉粥样硬化中的病理作用已得到公认。,,(,,,作为,,的最重要危险因素之一，,,,,,,,,,,,大连医科大学硕士学位论文,,;,,,,,，,小时后，可显著增加(,)砌之,,,,和蛋白的表达并且达到峰值，,,,，,,,，,,,，具有浓度依赖性的。,,,,和蛋白表达明显改变，是,(不同浓度,,(,,,刺激,,,,,,可使(,),,,,,,和蛋白表达的影响。有一定的时间依赖性。,,,,和蛋白表达增多，并且具,(,,(,,,刺激,,,,,,不同时间可使(,),,结论:,,,，(,,,,,组表达较,,,,,,,组无进一步升高趋势。,(不同浓度,,,,,,刺激,,,,,,，与对照组相比，,,,,,,,,组,,,,,,作用,育,小时后(,),,表达开始升高，,小时达到高峰，随后逐渐下降但仍高于对照组。,,,,和蛋白的表达，在孵,,—,,,刺激,,,,,,，可上调(,),,,(以,,,,,,,,,(,,,,,,中存在(,),,的表达。结果:同浓度,,(,,,对(,),,的,,,,和蛋白表达的影响。,,,,方法检测，观察不每亚组分别干预,小时，同样用,,,,(,,,,,,,,,,作用于,,,,,,，分别设,,，,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,,,,不同亚组，,(根据时间组结果，筛选,,(,,,刺激(,),,表达最强的时间点，用不同浓度,(体外培养,,,,,,。,,—,,,作用不同时间对(,),,,,,,方法检测，确定,,(,,,的刺激时间点并观察,,,和 ,,,,,,,用,,,,(,,,,设培养,，,，,，,，,,和,,小时亚组，正常对照组用完全培养基培养,,小时，,,(,,,作为干预终浓度，作用于,,,,,,不同的时间，分别,,,,,,)中是否存在(,),,表达及,,(,,,刺激后对(,),,在(,),,的表达。,,;,,,？,,)检测,,,,,,中是否存,(应用免疫荧光技术(，,,,,,,,,,,,,;,,;,方法:影响。,,,,及蛋白表达的目的:研究体外培养的人主动脉平滑肌细胞(,,,,,的表达是否存在影响，进而参与动脉粥样硬化的发生和发展呢,目前尚无报道。,(,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,大连医科大学硕士学位论文;,,,,，,肾素(前体)受体动脉粥样硬化,(,,—,,,可能通过上调(,),,表达参与动脉粥样硬化的发生发展。关键词:人主动脉平滑肌细胞大连医科大学硕士学位论文,,,,,,, 大连医科大学硕 ,妫妫澹悖簦?,,士学位论文 ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, (,,,),,,,, ,,; ,,,,,; ,,,,,, ,,,;,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,,:,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,:,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,:，,,,,,,, ,,,,;,,, ,,,,,,;, ,,, ,,,,,,,,,; ,,,,; ,, ;,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,，;,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,;,,,,,,,(,,)，,,, ,,,,,,;, ,, ,,,, ,,,,; ,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,, , ,,;,,,,(,,,, ,,,;,,, ,, ,,,,,, ;,,,,;,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,;;,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,, ,, ;,,,,,; ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,, ,;,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;, ,,, ,;,,, ;,,,,,,,,(,,,,,,,,，,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,, , ,,, ,,,,,,,,,,,;,, ,,;,,, ,,, ,,(，, ,,,,,,,, ,, ,,,,，,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,;,, ;,,,, ,,,, , ,,, ,,,, ,, ,,, ,,(,,, ,,,,,,;,,,, ,;;,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,(,,—,,,),,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,，,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,？,,(，, ,, ,,,,,, ,;,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,,,,, ,, ,,,, ;,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,;,, ;,,,,，,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,( ,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,, ,,, ,, ,,,, ,,;,,, ,,, ,, ,,, ,,,,,;,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,，,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,),,,,, , ,,, ,,,, ,, ,,, ,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,,,,,, ,,;,,,,,〔(,),,〕,, ,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,;,,,,,,;,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,, ,,,, ,,;,,,,, , ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,;,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,, ,, ,,;,,, ,,,,,(,,,, ,,;,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,(,,,),,,,,，,,,,,,,,,, ,,,,， ,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,，,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,(,(,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,，;,,,,,; 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(,),, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,( , ,,(,,, ,,,,,,,,,,(,),, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,, , ,,,, ,,,,,,:,, ,,,,,,,,,,,,,,(,),,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,;,,,,,,,,,(,,—,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;, ,,;,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,;,,;,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,大连医科大学硕士学位论文,氧化低密度脂蛋白在人主动脉平滑肌细胞对肾素(前体)受体表达的影响指导教师:姜一农教授(硕士生姓名:刘晓云专业名称:内科学,,)作为一种慢性炎症性疾病是心血管疾病死亡的根本原因【,】。关于其发病机制，在的临床应用价值。用药物在不同阶段阻断过度活化,,,已被证明能够有效的预素转换酶抑制剂(,,,，)和血管紧张素，，受体拮抗剂(,，也)能够抑制该系统的药物干预成为治疗高血压等疾病的最主要方法。临床上应用比较广泛的血管紧张体内重要的体液调节系统，与高血压，动脉粥样硬化，糖尿病，心力衰竭，慢性肾素一血管紧张素(醛固酮系统(,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,防心血管疾病和肾功能异常。然而，大量实验表明应用,,,，和,,,类药物并未受体结合引起自身内在的信号通路发生变化，造成内皮细胞的损伤，并能刺激细取得理想效果，这可能与,,,不完全阻断有关。近年来发现的肾素前体(,,,,,,,,)，，，可有效逆转和减轻血管重构和预防靶器官损伤，具有重要的理论意义和潜密度脂蛋白(,,(,,,)是最重要的危险因素。,,(,,,具有细胞毒性作用，可与其,,,,,,，,,,)和主要效应分子关键酶血管紧张素转换酶(,,,,,,,,,,,(;,,,,,,,,,激细胞增殖、产生活性氧等方式参与多种疾病的病理生理过程。目前针对,,,的脂异常、高血压、吸烟、糖尿病、肥胖、感染等因素有关。,,,,〔,,指出,,是一种，，)被认为是最主要的效应分子，可通过直接收缩血管、刺,,,,,,)。,,可能与年龄、性别、血吾 血管疾病成为世界各地死亡的主要因素，而动脉粥样硬化(,,,,,,,;,,,,,,,，肾脏疾病等其他多种疾病的发生密切相关。在经典的,,,中，血管紧张素，，,,,,,,，遥粒樱?堑姆? ?埂, 遥希兀 蹋模趟 接攵 鲋嘌 不 颊甙呖槲榷ㄐ砸裁芮邢喙于荆常薄, 髦细胞因子及生长因子，参与平滑肌细胞的调控，通过各种机制参与,,目前多数学者支持损伤(反应学说(,,,,,,,,慢性炎症性疾病，氧化应激和炎症共同参与,,的发生发展。目前认为氧化修饰低心先后经历了脂质浸润学说、血小板聚集和血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说等，，，，,,,(,,,,,,,,,,,,,,大连医科大学硕士学位论文月,,,,,(,』(—,一,,,,,,，,,,,,,)磷酸化增吲川，上调促纤维化基因(,,,,,,)中，并可通过损伤内皮细胞、上调炎症因子的表达等机制参与动脉粥,,,,,,，,,,,)【,,，使细胞外信号调节激酶目前已有研究证实，(,),,存在于肾系膜细胞，血管平滑肌细胞，肾脏，心脏，通过非蛋白水解途径激活肾素前体发挥生物学活性，能够增加肾素或肾素前体酶有单一跨膜结构。肾素和肾素前体与(,),,结合后，可不裂解肾素前体的前片段，肾素(前体)受体是肾素和肾素前体的共同受体，是由,,,个氨基酸组成，具是否存在影响并参与了动脉粥样硬化的发生和发展呢,目前尚无报道。本试验将大脑等细胞组织中。 我们课题组前期实验证实(,),,存在于人脐静脉内皮细胞,,,,(和蛋白表达的影响。为模型，观察,,(,,,刺激对(,),,;,,,,，,,,,,,)抑制物(,(,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,，,,,,,,)，纤溶酶原激活物,,,,,,,,,,,，,,，。,)，纤维连结蛋白和胶原蛋白,,，,,以体外培养的人主动脉平滑肌细胞(,,,,,硬化的发生发展中起重要作用，那么,,(,,,在血管平滑肌细胞中对(,),,的表达样硬化的发生。而,,(,,,刺激可以诱导平滑肌细胞异常增殖和迁移，在动脉粥样以及肾素(前体)受体〔(,,,),,,,,等，在心血管疾病和肾脏疾病中的重要性近年来倍受关注。活蛋白激酶(,,,,,,,(,;,,,,,,,定因素【,,，成为,,,研究的新热点。,,;,,,,,，(,),,〕被认为是疾病发病的一个主要决活性,(,倍，在不同细胞间可以触发一系列细胞事件【,】。大量研究证实，(,),,被激活后，可以不依赖于传统的,,,，，途径，活化细胞内信号转导通路促分裂原激表达，如转化生长因子(,(,,,,,,,,,,,,(,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,(,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,大连医科大学硕士学位论文, 大连医科大学硕士学位论文 材料和方法 一、材料及试剂 (一)主要试剂: 表,(主要试剂 (,,)标本来源及用液配制 入主动脉平滑肌细胞(,,,, ,,,,,; ,,,,,, ,,,;,, ,,,,,， ,,;,,,,,,,公司。 ,,,,,,)购自美国,,,,,,,, ,,,, ,,,配制:,,,, ,(,,，,,, ,(,,，,,,,,,,?,,,, ,(,,,，,,,,,, ,(,,，加水至,,,, ,,，调,,值至,(,。 (三)主要器材: , 大连医科大学硕士学位论文 表,(主要器材主要器材 厂家,,,培养箱 ,,,,,日本台式高速冷冻离心机 ,,,,,,,,, ,,, ,,德国紫外,可见光分光光度计 ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,荧光定量,,,仪 ,,;,,德国蛋白质电泳仪 北京六一仪器厂湿转膜仪 北京六一仪器厂细胞培养皿(,;,)、培养瓶 ,,,,,,公司倒置显微镜 ,,，,,德国荧光显微镜 ,,，,,德国恒温水浴箱 上海森信实验仪器有限公司酶标仪 ,,,,,,,,,,,公司,光胶片 富士公司 二、实验方法 ,(人主动脉平滑肌细胞的培养 ,(,人主动脉平滑肌细胞的体外培养:人主动脉平滑肌细胞(,,,,,,)培养按照,,,,,,说明书培养于,,,;,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,(,,,,,)中，培养条件为,,。,，,,,,,。 ,(,细胞的传代培养: ,(,(,细胞长至,,,(,,,时，弃培养液，以,,,液洗涤,次。 ,(,(,加入,(,,,,胰蛋白酶消化液,,,，室温消化,,,,，倒置相差显微镜下观察，当大部分细胞回缩变圆接近脱壁时，加入,,,胰蛋白酶中和液以终止消化。 ,(,(,用玻璃滴管吹打细胞，收集细胞悬液至离心管中离心，,,,,,,,,,,,,。 ,(,(,弃上清，加入,,,;,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,培养液轻轻吹打细胞团，制成细胞悬液。 ,(,(,细胞计数，按细胞密度，以,:,”,,,的比例分装接种至新培养瓶中，放入培养箱中继续培养，待细胞铺满瓶底时，以同法传代。 ,(,细胞形态学观察 倒置相差显微镜观察平滑肌细胞为长梭形，呈单层排列，细胞汇合后呈典型 ,, 大连医科大学硕士学位论文的“峰谷”样生长。高倍镜 下可见单个清晰的细胞核。 ,(干预实验 ,(,采用培养的第,,,代,,,,,,，将细胞以,,,,,,的浓度种入六孔板，每孔,,,细胞悬液。贴壁培养至细胞密度为,, ,(,,时换无血清培养液同步化,,,。 ,(,实验分组: 先以,,,,,,,, ,,—,,,作为干预终浓度作用于,,,,,,，分别设立培养,，,，,，,，,,和,,小时亚组，正常对照组用完全培养基培养,,小时;再根据时间组结果，筛选,,(,,,干扰(,),,作用最强的时间点，按不同,,(,,,终浓度分为,,，,,，,,,，,,,，,,,，,,,,,,,,亚组，每亚组分别干预,小时，正常对照组用完全培养基培养,小时。 ,(,(,时间依赖组 以〕,,,,,,, ,,(,,,分别作用细胞不同时间，收集细胞，提取总,,,，用实时定量,,,方法检测(,),, ,,,,,,表达，应用,,,,,, ,,,,检,(,),，,蛋白的表达。 分组如下: ,(空白组 ,(,小时组 ,(,,，时组 ,(,,’时组 ,(,,’时组 ,(,,,’时组 ,(,,,，时组 ,(,(,浓度依赖组 以不同浓度的,,(,,,分别作用于细胞，于,小时收集细胞，用实时定量,,,方法检测(,),, ,,,,的表达，应用,,,,,,, ,,,,检,(,),,蛋白的表达。 分组如下: ,(空白组 ,(,,,,,,,组 ,(,,,,,,,组 ,(, ,,,,,,,组 大连医科大学硕士学位论文 ,(, ,,,,,,,组 ,(,,,,,,,,组 ,(,,,,,,,,组 ,(,(,实验 ,,,,,,;,,,,,, ,, ,,,,,,, , ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, , ,,, ,,,,,,,, ,,(,,, ,,—,,, ,,(,,, ,,(,,, ,,—,,, ,,(,,, ,,，,,，,,，,,，,,,，,,, ， 、 ， ， 、 ,,,,(,,,, ,,,检测 ,,,,,,, ,,,,检测 (,),, ,,,,表达 (,),,蛋白表达 , , , ? 图,(实验流程图 ,(,收集细胞，应用实时荧光定量,,,检钡,,(,),, ,,,,表达;应用,,,,,,,,,,,检测(,)，汛蛋白表达水平。 以上实验重复,次。 ,(免疫荧光技术检测,,,,,,中(,),,的表达。 ,(,配制以下溶液: ,),,多聚甲醛:,,多聚甲醛溶于,,(,,,, ,,,？,，,,”,水浴中过夜，完全溶 解后定容至,,,,,，,。,保存; ,),(,,,,,,,,,一,,,:,,,,,,,(,,, ,,(,,,),,入,,(,,, ,,,中完全溶解，配制 成,,,的储备液，用前稀释成所需浓度; ,),,,,,:,,,配制，,,牛血清白蛋白溶于,,,,, ,,,中; ,)一抗稀释液:,(,,,,,，,,,配制，现配现用; ,),,,;,,, ,,,,,核染料。 ,, 大连医科大学硕士学位论文 ,(,操作步骤: ,)将细胞以,×,,,,,,,的密度接种于,,孔板中，设定,个阴性对照组，多个 复孔，待细胞融合至,,,左右开始进行染色; ,)弃培养上清，用预热的,,,洗涤,,,,,,，去除杂质和细胞碎片; ,)每孔加入，,, ,,多聚甲醛固定细胞,,,,,; ,)弃固定液，,,,洗涤,,,,,,; ,),(,,,,,,,,,一,,,(,,,配制)破膜处理,,,,,; ,),,,洗涤,,,,,,; ,),,,,,室温封闭,,(或,,,,,抗来源正常的血清封闭,,); ,)弃封闭液，,,,洗涤,,,,,,; ,)一抗孵育，,,,过夜(加一抗前,,,要尽量吸干); ,,)弃一抗，,,,洗涤,,,,,,，边洗边摇: ,,)加入二抗，,,?水 浴,,,,,; ,,)弃二抗，,,,洗涤,,,,,,; , ,)加入,,,;,,, ,,,,,核染料室温孵育,,,,; ,,)弃染液，,,,洗涤,,,,,,; ,,)加入,,,倒置荧光显微镜拍照。 (第,,(,,步避光操作) ,(实时荧光定量,,,技术(,,,,,,,,, ？,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,;,,,,简称,,,,(,,,, ,,,) ,(,细胞,,,抽提 ,(,(, ,,,,,,,,,,,密度的细胞用,,,洗两遍后，加入,,, ,,,,,,，加样枪反复吹打以使细胞完全裂解。 ,(,(,室温放置,,,,,,,，样品转移至,(,,,的离心管中。 ,(,(,加入,(,,,氯仿,每,,, ,,,,,,，剧烈震荡,,,,一,,,,;，室温放置,一,,,,,,。 ,(,(, ,,,,,,,,,,,,, ,”,离心,,,,,。 ,(,(,溶液分层，吸取上清置于,(,,,的,,,,,(,,,,离心管中，加入,(,,,异丙醇,每,,, ,,,,,,(或与上清等体积的异丙醇)，颠倒混匀。 ,(,(,室温放置,,,,,，,,,,,,,,,,,,, ,”,离心,,,,,。离心后可于管底看到 .