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【doc】 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属蛋白酶1/2mRNA表达的影响

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【doc】 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属蛋白酶1/2mRNA表达的影响【doc】 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属蛋白酶1/2mRNA表达的影响 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属 蛋白酶1,2mRNA表达的影响 ? 238? ? 论着? 中国中西医结合急救杂志2005主旦箜鲞笙塑』!尘!!!』!!!!:!: 益气活血化痰法 金属蛋白酶1/2 中药对泡沫细胞基质 mRNA表达的影响 张志毅,梅轶芳,赵彦萍,曹洪欣 (1.哈尔滨医科大学附属第一医院,黑龙江哈尔滨150001;2.中国中医研究院,北京100700) 【摘要】目的:探讨益气活血化痰法中药对动脉粥样硬化影...
【doc】 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属蛋白酶1/2mRNA表达的影响
【doc】 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属蛋白酶1/2mRNA达的影响 益气活血化痰法中药对泡沫细胞基质金属 蛋白酶1,2mRNA表达的影响 ? 238? ? 论着? 中国中西医结合急救杂志2005主旦箜鲞笙塑』!尘!!!』!!!!:!: 益气活血化痰法 金属蛋白酶1/2 中药对泡沫细胞基质 mRNA表达的影响 张志毅,梅轶芳,赵彦萍,曹洪欣 (1.哈尔滨医科大学附属第一医院,黑龙江哈尔滨150001;2.中国中医研究院,北京100700) 【摘要】目的:探讨益气活血化痰法中药对动脉粥样硬化影响的机制.方法:将体外培养的小鼠泡沫细胞 分为空白对照组,益气组,活血组,化痰组,益气活血组,益气化痰组,活血化痰组,益气活血化痰组8个实验组. 提取RNA,用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)法分析各组基质金 属蛋白酶组织抑制剂一1(TIMP一1)和 TIMP一2mRNA表达水平,评价益气活血化痰法中药对巨噬细胞源性泡沫细胞表达和分泌TIMPs的影响. 结果:与空白对照组相比,益气活血,益气化痰,活血化痰及益气活血化痰4组均可明显促进泡沫细胞TIMP一1 mRNA表达(P均<o.05),而益气组,活血组,化痰组与空白对照组比较差异无显着性(P均>0.05).与空白对 照组比较,益气组,活血组,化痰组可促进泡沫细胞TIMP一2mRNA表达(P均<0.05),益气活血组,益气化 痰组,活血化痰组,益气活血化痰组可明显促进泡沫细胞TIMP一2mRNA表达(P均<0.001).结论:益气活 血化痰法中药可促进泡沫细胞TIMP一1和TIMP一2mRNA表达,从而减少动脉粥样硬化的发生和发展,并 且可能起到稳定动脉粥样硬化不稳定斑块,减少和预防冠心病,脑梗死等心脑血管疾病发生的作用. 【关键词】益气活血化痰法;中药复方;基质金属蛋白酶组织抑制剂;泡沫细胞 中图分类号:R285.5;R242文献标识码:A文章编号:1008—9691(2005)04—0238—04 InfluenceoftraditionalChinesemedicinemethodofpromotingcirculationof Qiandbloodanddispersing phlegm(益气活血化 痰)ontissueinhibitorofmetalloproteinasemRNAexpressioninfoamcellsZHANG Zhi—yi,MEIYi一 ping,CAOHong—xin..j.RheumatologyDepartment,theFi/ng,ZHAOYan— rst lliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbinl50001,Heilongjiang.Chinat2.ChineseInstitute ofTraditionalChineseMedicine,Beijingj00700,China [Abstract]Objective:ToinvestigatethemechanismoftraditionalChinesemedicine(TCM)ontissue inhibitorofmetalloproteinase(TIMP)mRNAgeneexpressioninfoamcel1.Methods:Cuhuredfoamcells weredividedintoeightgroups:controlgroup,promotingcirculationofQigroup(PCQgroup,益气组), promotingcirculationofthebloodgroup(PCBgroup,活血 组),dispersingphlegmgroup(DPgroup,化痰 组),promotingcirculationofQiandthebloodgroup(PCQBgroup,益气活血 组),promotingcirculationofQi anddispersingphlegmgroup(PCQDPgroup,益气化痰 组),promotingcirculationofthebloodanddispersing phlegmgroup(PCBDPgroup,活血化痰 组),promotingcirculationofQiandthebloodanddispersingphlegm (PCQBDPgroup,益气活血化痰组).Thesemi—quantificationofTIMP一 1andTIMP一2mRNAinfoamcell polymerasechainreaction(RT—P wascarriedoutbyreversetranscription— CR).TheinfluenceofTCM methodofpromotingcirculationofQiandthebloodanddispersingphlegmonTIMPmRNAgeneexpression andsecretionbyfoamcellsofphagocyticsourcewasestimated.Results:Comparedtothecontrolgroup, TIMP一 1mRNAlevelsinfoamcellssignificantlyincreasedinPCQB,PCQDP,PCBDPandPCQBDPgroups (allP<0.05),butthechangesofTIMP一 1inPCQ,PCB,DPgroupswerenotsignificant(allP>0.05). TIMP一 2mRNAlevelsobviouslyincreasedinPCQ,PCBandDPgroups(allP<O.05),andthechangeswere moresignificantinPCQB,PCQDP,PCBDPandPCQBDPgroups(allP<0.O01).Conclusion:TCMmethod ofpromotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegmcoulddecreasetheincidenceanddevelopmentof atherosclerosisbypromotingthegeneexpressionofTIMP一1andTIMP一 2.anditplaysanimportantrolein stabilizingtheunstablespotofatherosclerosis,preventinganddecreasingtheincidenceofcardiocerebral vasculardiseasesuchascoronaryheartdiseaseandcerebralinfarction. [Keywords]methodofpromotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegm;traditionalChinese medicinerecipe;tissueinhibitorofmetalloproteinase;foamcell CLCnumber:R285.5;R242Documentcode:AArticleID:1008—9691(200 5)04—0238—04 作者简介:张志毅(1965一),男(汉族),山东省临朐县人,教授,主任医师 (Email:zhangzhiyi@medmail.com.cn). 中国中西医结合急救杂志2005年7月箍12第 4—ChinJTCM—WMCrit—Care,July200—5,Vo1.12,No.4一 临床研究表明,益气活血化痰法对于冠心病心 绞痛有良好的疗效,但是其作用机制仍不十分清 楚.近年来许多研究表明,基质金属蛋白酶(MMPs) 表达增多与炎症疾病明显相关?,其中巨噬细胞以 及巨噬细胞源性泡沫细胞表达和分泌的MMPs及 其组织抑制物(TIMPs)在动脉粥样硬化斑块破裂 中起着十分重要的作用n.丹参可减少氧化型低密 度脂蛋白(oxLDI)诱导MMP一2和MMP一9的表 达巧.关于益气活血化痰法中药对巨噬细胞源性泡 沫细胞表达和分泌TIMPs的影响,国内外尚未见报 道.首次采用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)方 法观察益气活血化痰法中药对泡沫细胞TIMP一1 及TIMP一2的mRNA表达影响. 1材料与方法 1.1主要试剂和仪器:RPMIl640培养粉(美国 GIBCO公司),TRIZOIReagent(美国生物技术联 合公司),RT—PCR试剂盒(美国CIONTECH实 验室联合公司),明胶和琼脂糖(美国Sigma公司); 引物合成由上海博亚生物公司完成.体积分数为 5的COz孵育箱,低温高速离心机,相差显微镜,生 物超净台和PCR仪. 1.2巨噬细胞培养及鉴定:取8,12周Balb/c型 雌性小鼠,脊髓离断法处死,以质量分数为0.85 的盐水冲洗小鼠腹腔,回收腹腔灌洗液,离心,重悬, 以每孔5×l0个巨噬细胞接种到6孔培养板中,加 入无血清RPMIl640培养液,谷氨酰胺4mmol/L, 青霉素100kU/L和链霉素100mg/L.贴壁2h后 以无血清培养液轻轻吹打,将没有贴壁的细胞除去, 再加入RPMI1640培养液.谷氨酰胺4mmol/L,青 霉素lOOkU/L和链霉素l00mg/I,每24h换液 1次,用相差显微镜观察细胞情况. 1.3oxLDI制备:一次性密度梯度超速离心法分 离人血清低密度脂蛋白(LDL),IDI提取液用磷酸 盐缓冲液(PBS)透析后,Lowry法测蛋白含量,以 PBS稀释LDL至1g/L,加入CuSO至终浓度为 lo>mol/I,37C,孵育24h,4C于PBS中充分透 析去Cu抖,用预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳观察电泳 迁移率来鉴定脂蛋白氧化程度.微孔滤膜过滤除菌, Lowry法测蛋白含量,定量后4C保存备用. 1.4泡沫细胞的培养:巨噬细胞培养瓶内加入无血 清RPMI1640培养液,谷氨酰胺4mmol/L,青霉素 lOOkU/L,链霉素l00mg/I及oxIDLl00mg/L, 每24h换液1次,如果细胞生长良好,且在相差显 微镜下可以看到沿细胞膜排列透明的小脂滴,表明 ? 239? 泡沫细胞已经形成. 1.5实验分组:空白对照组,益气组(白参,黄芪 等),活血组(赤芍,川芎等),化痰组(半夏,栝楼,薤 白等),益气活血组(白参,黄芪,赤芍,川芎等),益气 化痰组(白参,黄芪,半夏,栝楼,薤白等),活血化痰 组(赤芍,川芎,半夏,栝楼,薤白等),益气活血化痰 组(白参,薤白,半夏,桂枝,赤芍,川I芎等).各组所用 中药按0.3#l/ml培养液配制,含生药300mg/I. 1.6RT—PCR分析:采用常规分子生物学技术, 将泡沫细胞消化,离心后接种于细胞培养瓶中,待细 胞生长至亚融合状态时,分为上述8个实验组,培养 24h,提取各组RNA(按TRIZOI试剂盒内说明进 行操作),电泳鉴定RNA的质量,紫外分光光度计 定量.取RNA2g,采用RT—PCR进行cDNA合 成(严格按照逆转录试剂盒说明步骤进行操作)及逆 转录产品扩增.用8一肌动蛋白(8一actin)作为内参 照进行PCR半定量分析.参照文献C6D设计引物,引 物序列为:l9一actin上游:5f_AAGCAGGAGTAT— GACGAGGAGTCCG一3;下游:5一GCCTTCAT— ACATCTCAAGTTGG一3;产物长度为3l4bp. TIMP—l上游:5一CTGGCATCCTCTTGTTGC— TA一3;下游:5GGGATCTCCAGGTGCACA— A一3;产物长度为580bp.TIMP一2上游:5AG— ACGTAGTGATCAGGGCCA一3;下游:5GTA— CCACGCGCAAGAACCAT一3;产物长度为 490bp.反应体系为5o1:各组cDNA产物21, 2.5U/tdTaq酶0.25l,10×反应缓冲液5l, dNTP4l,一actin上,下游引物各1l,TIMP一1 (或TIMP一2)上,下游引物各1l,无菌双蒸水 351.反应条件为:94C变性30S,58C退火30S, 72C延fe45S,35个循环.每一PcR重复3次. 1.7统计学处理:采用SPSS12.0软件进行分析, 数据处理用均数?差(z4-s)表示,采用方差分 析进行检验.P<O.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1中药对泡沫细胞TIMP—lmRNA表达的影 响(图1):与空白对照组相比,益气活血,益气化痰, 活血化痰及益气志2o生!旦箜鲞箜塑!尘!!!!:!: A 770bp 750bp612bp 6l2bp 2345678 组别 注:A为电泳结果,1,9分别为空白对照组,益气组,活血组,化痰 组,益气活血组,益气化痰组,活血化痰组,益气活血化痰组, Marker;B为各组TIMP一1mRNA表达相对含量分析,1,8分别 代表空白对照组,益气组,活血组,化痰组,益气活血组,益气化痰 组,活血化痰组,益气活血化痰组;与空白对照组比较:P<0.05 图1益气活血化痰法中药对泡沫细胞TIMP一1mRNA表达的影响 Figure1EffectsoftraditionalChinesemedicinemethodof promotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegm onthemRNAexpressionofTIMP一1secretedfromfoamcell 3讨论 MMPs可来源于多种细胞,在细胞外基质破坏 与降解过程中作用重要.作为金属蛋白酶天然的抑 制因子,TIMP一1可抑制MMP一9的作用,而 TIMP一2则起到抑制MMP一2的作用.研究表 明,MMPs及其抑制剂的平衡与心脑血管疾病的发 生密切相关,并且可预测心脑血管疾病的发生?.现 代药理研究证明,益气活血化痰法中药所用的白参, 薤白,川芎,半夏和栝楼等均有明显的扩张冠状动脉 (冠脉),增加冠脉血流量,改善缺氧,使损伤心肌得 以恢复,增加心肌顺应性的作用,临床上可缓解心绞 痛,同时可清除自由基,减少氧自由基对细胞膜脂质 的过氧化作用,明显降低心肌耗氧量和氧利用率,改 善心肌氧代谢,调节脂质代谢,抗动脉粥样硬化 (AS),改善患者心排血量,心脏射血分数,每搏指 数,具有正性肌力作用;而栝楼不但有抗氧化及心肌 保护作用,尚可协助当归起到抗心律失常的作用.. 本实验结果表明,益气活血化痰法中药可显着 促进泡沫细胞TIMP一1和TIMP一2mRNA表达, 明显优于对照组;尤其对TIMP一2mRNA表达,其 2?5 2?0 曼 1.5 n l0 苫 0?5 0 A 23456789 TIMP2 (490bp) B—acti11 (314bp) 2345678 组别 注:A为电泳结果,1,9分别为Marker,益气活血化痰组,益气活血 组,益气化痰组,活血化痰组,益气组,活血组,化痰组,空白对照组; B为各组TIMP一2mRNA表达相对含量分析.1,8分别代表益气活 血化痰组,益气活血组,益气化痰组,活血化痰组,益气组,活血组,化 痰组,空白对照组;与空白对照组比较:P<O.05,一P<0.001 图2益气活血化痰法中药对泡沫细胞TIMP一2mRNA表达的影响 Figure2EffectsoftraditionalChinesemedicinemethodof promotingcirculationofQiandbloodanddispersingphlegm onthemRNAexpressionofTIMP一2secretedfromfoamcell 作用优于益气组,化痰组,活血组.说明益气活血化 痰法中药可能在抗As脂质斑块形成及破裂中起一 定作用. 总之,本实验结果揭示:益气活血化痰法中药可 增加泡沫细胞TIMP一1和TIMP一2mRNA表达, 减少AS发生,且可能起到稳定AS不稳定斑块,减 少冠心病,脑梗死等心脑血管疾病的发生和预防作 用.然而,体外细胞培养的方法虽然能模拟体内环 境,单独探讨益气活血化痰法中药对泡沫细胞的作 用,但毕竟与人体内环境有差别,不能完全代替体内 实验,所以还需进一步进行动物在体实验及大规模 临床观察. 参考文献: [1]刘绍屏.益气活血化痰汤治疗冠心病心绞痛4o例(J3.实用中医 药杂志,2003,19:69. (23李七一.益气活血化痰法治疗冠心病心绞痛临床研究(J3.江苏中 医药,2003,24:12—14. [33陈伟英,阳晓,梁鸣,等.狼疮肾炎患者肾组织基质金属蛋白酶一2 和 9的表达及其意义[J].中国危重病急救医学,2002,14:411—413. (43高波,李忠诚.基质金属蛋白酶一3血浆水平及其启动子基因5A/ 6A多态性与冠心病关系的研究(J3.中国危重病急救医学,2004, 539. 16:536— [5]刘虹彬,温进坤,韩梅.丹参对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶和 O864 ,i? :二0l】 ,-08 ll0 ,一[1一 6420 000 — 中国中西医结合急救杂志2005年7月第12卷第4期Chin』!cMW—M—Crit!』!!:!:?241? 骨桥蛋白基因表达及细胞增殖的影响[J3.中国中西医结合杂志, 2002,22:764—766. <61OgawaK.FunabaM,MathewsLS,eta1.ActivinAstimulates typeNcollagenase(matrixmetalloproteinase一2)productionin mouseperitonealmacrophages[J].JImmuno1.2000,165:2997— 3003. [71LambertE,DasseE,HayeB.eta1.ThetissueinhibitorsofmetaI- loproteases(TIMPs).TIMP一1forMMP一9andTIMP一2 forMMP一2actsasnaturalinhibitors,counteractinthese metalloproteases[J].OncolHematol,2004,49:187—198. [8]SmeglinA,FrishmanWH.Elastinolyticmatrixmetal— loproteinasesandtheirinhibitorsastherapeutictargetsin atheroscleroticplaqueinstability[J].CardiolRev.2004.12:141— 15O. [9]胡熙明,张文康.中华本草精选本[M3.上海:上海科学技术出版 社,1999.1345. (收稿日期:2004—12—22修回日期:2005—05—15) (本文编辑:李银平) 大黄救治急性有机磷药物中毒疗效观察 李雪苓 (安徽中医学院第一附属医院,安徽合肥230031) 【关键词】中毒,有机磷农药;大黄;治疗 中图分类号:R278文献标识码:B文章编号:1008—9691(2005)04—0241一O1 重症急性有机磷农药中毒(A0PP) 病死率高.我院急诊科用大黄救治口服 中毒者效果显着,报告如下. 1临床资料 1.1病例:68例A0PP患者均符合陈 灏珠主编的《实用内科学》诊断标准,随 机分为治疗组36例,对照组32例.治 疗组男5例,女31例;年龄19,54岁, 平均4O岁;轻度中毒6例,中度中毒 12例,重度中毒18例;敌敌畏中毒5例, 乐果中毒22例,对硫磷中毒6例,甲胺 磷中毒3例;病程0.5,5.6h,平均 3.8h.对照组男3例,女29例;年龄 22,54岁,平均39岁;轻度中毒5例, 中度中毒12例,重度中毒15例;敌敌畏 中毒4例,乐果中毒19例,对硫磷中毒 4例,甲胺磷中毒1例,敌百虫中毒2例, 内吸磷中毒2例;病程0.3,6.0h,平均 3.5h.两组患者年龄,性别,病程,病情 程度方面差异无显着性(P均>0.05), 具有可比性. 1.2治疗方法:两组患者均采用常规综 合抢救措施,洗胃至洗出液色清且无药 味为止,在阿托品,解磷定静脉注射的同 时给予降颅压,利尿,纠正水和电解质紊 乱等对症处理.对照组洗胃后经胃管注 入质量分数为2O的硫酸镁250ml导 泻;治疗组给予大黄液200ml口服,以 后每日服1次,不能口服者用鼻饲,直至 作者简介:李雪苓(1963一),女(汉族). 安徽省合肥市人,硕士研究生,副主任医师. ? 经验交流? 表1两组患者ChE活性恢复,意识转清及首次排便时间比较(土) 注:与对照组比较:’P<0.05,一P<0.01 表2两组患者阿托品的使用及住院天数比较(?) 注:与对照组比较:’P<0.05 患者各项检查恢复正常. 1.3观察项目:观察两组患者胆碱酯酶 (ChE)活性恢复情况,昏迷患者意识转 清时间,两组阿托品使用量及住院天数. 以患者临床症状,体征消失,全血ChE 活性稳定在正常的7O%以上为治愈. 1.4统计学方法:计量资料用t检验, 计数资料用x检验. 2结果 2.1两组ChE活性恢复情况,意识转 清,首次排便时间见表1. 2.2两组阿托品化时间,阿托品化用 量,阿托品总用量及住院天数见表2. 2.3两组临床治愈率比较:治疗组治愈 35例(97.2),死亡1例;对照组治愈 27例(84.4),死亡5例(X一3.47, P<0.05). 3讨论 临床采用大黄导泻治疗AOPP能 提高患者抢救成功率,收到满意效果.大 黄具有清热解毒,通腑泻浊,攻积导滞, 泻下之功效,配合常规综合救治AOPP, 患者首次排便时间缩短,对ChE活性的 恢复,昏迷患者意识转清,减少阿托品用 量,缩短住院时间方面均有较好的效果. 提示口服大黄能有效促进胃肠蠕动,清 除肠道内细菌及毒素,改变中毒的自然 演变过程,提高治愈率. 现代医学研究证明,大黄能活血化 瘀,改善微循环,清除肠道内细菌及毒 素,同时增加肠蠕动,泻下通便,促进新 陈代谢,对肠黏膜有显着的保护作用,这 是大黄治疗有机磷农药中毒的基础”?. 参考文献: [1]王其新,段鲁勤,马辉.等.大黄对有机磷农 药中毒并发胃肠功能衰竭的研究[J].中国 中西医结合急救杂志,2000,7:24—25. [2]朱义用,景炳文,娄永华.大黄对肠源性感 染致早期肺损伤防治作用的机制探讨 [J].中国中西医结合急救杂志,2004,11: 53—56. (收稿日期:2005一O6—06) (本文编辑:李银平)
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