为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!
首页 > DNA提取方法(一)

DNA提取方法(一)

2019-01-11 8页 doc 22KB 295阅读

用户头像

is_594886

暂无简介

举报
DNA提取方法(一)各种DNA提取方法 一,基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有: 硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤: 1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次...
DNA提取方法(一)
各种DNA提取方法 一,基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有: 硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤: 1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液, (10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀,50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚,氯仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀,冰浴,10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。二,外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法: 试验步骤: 1、取人肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min。 4、2500rpm离心10min,弃上清。 5、加入10ml 溶血液,摇匀,冰浴15min。 6、3000rpm离心10min,弃上清。 7、倒置离心管,去掉残液。 8、得白细胞,-80℃冻存。 试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶。 三,氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA: 试验试剂: Ligsisbuffer: 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0. 1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml;最后加灭菌去离子水至1000ml,高压灭菌。ACD抗凝剂:__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g 葡萄糖5.15g;最后加灭菌去离子水至350ml,高压灭菌。 提取缓冲液(Extractionbuffer): 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8 .0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml;最后加灭去离子水至100ml, 高压灭菌 试验步骤: 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分颠混至清亮。以4000rpm,离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分匀浆。以6000rpm,离心5min。 3、彻底弃去上清,加入extractionbuffer500μl(裂解细胞),混匀置于37℃,水溶1h。 4、加入8μl 的蛋白酶K,颠混,37℃过夜(或55℃,3h,但是37℃效果要好些)。 5、每管加入450μl 饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min,以5500rpm,离心15min。 6、取上清,每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。 7、取上清,每管加入500μl 氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。 8、取上清,每管加50μl 的3M的NaAC+,适量无水乙醇(预冷)至满,摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm,离心20min。去上清,加入70%乙醇500μl,以12000rpm,离心5min,去上清,50-60℃干燥。 10、加入50μl 灭菌去离子水,转弹,混匀。 四,NaI提取法提取外周血白细胞基因组: 实验步骤: 1、取外周抗凝血(全血)100ul 于eppendorf管中,12000rpm 离心12min。 2、弃上清,加双蒸水200ul 溶解,摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul,摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇(24:1)400ul,边加边摇,摇匀20s,12000rpm 离心12min。 5、取上层液350ul,加入另一新eppendorf管中,加0.6倍体积异丙醇,摇匀20s,室温放置15min,静置后的反应体系15000rpm 离心12min,使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇,加70%乙醇1ml(不振动),以15000rpm离心12min。 7、弃乙醇,敞开eppendorf管盖,烘干(37℃恒温箱)后,加1xTE 溶液30ul,溶解DNA>12h以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。 五,常用的外周血白细胞基因提取方法: 试验原理: 苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q______酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,核蛋白变性降解,使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水,不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时,蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏,变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相),DNA存于上层水相中,蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍 体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl 存在下沉淀DNA,回收DNA 用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐,真空干燥,用TE缓冲液溶解DNA备用。 试验步骤: 1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml 离心管中,加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS),混匀,3500rpm离心15min 倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀,37℃水浴温育1h。 2、将上述DNA提取液混悬白细胞,37℃水浴温育1h后,加入 1mg/ml 蛋白酶K0.2ml 至终浓度为100-200ug/ml 上下转动混匀,液体变粘稠。50℃水浴保温3h,裂解细胞,消化蛋白。保温过程中,应不时上下转动几次,混匀反应液。 3、反应液冷却至室温后,加入等体积的饱和酚溶液,温和地上下转动离心管5-10min,直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm 离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇(24﹕1),上下转动混匀,5000rpm离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中。重复一次。 4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇,室温下慢慢摇动离心管,即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA,转入另一1.5ml 离心管中,加70%乙醇0.2ml,以5000rpm离心5min。洗涤DNA,弃上清,去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇,但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul 溶解DNA置于摇床平台缓慢摇动,DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。 六,真核细胞DNA的制备 一般真核细胞基因组DNA 有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则: 1、防止和抑制DNase对DNA的降解。 2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。试剂准备: 1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。 2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。 3、裂解缓冲液:250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4、20%SDS 5、2mg/ml 蛋白酶K 6、Tris饱和酚(pH8.0)、酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1)、氯仿 7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤: 材料处理: 1、新鲜或冰冻组织处理: 1)取组织块0.3-0.5cm3剪碎,加TE0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。 2)将匀浆液转移到1.5ml 离心管中。 3)加20%SDS25ml,蛋白酶K(2mg/ml)25ml,混匀。 4)60 C水浴1-3hr。 2、培养细胞处理:1)将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次。 2)离心4000g 5min,去除上清液。 3)加10倍体积的裂解缓冲液。 4)50-55 C水浴1-2hr。 DNA提取: 1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min。 2、离心5000g 10min,取上层水相到另一1.5ml 离心管中。 3、加等体积饱和酚,混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一管中。 4、加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。 5、加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一管中。 6、加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。 7、待絮状物出现后,离心5000g 5min,弃上清液。 8、沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g 3min,弃上清液。 9、室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。
/
本文档为【DNA提取方法(一)】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索