【doc】犬肺巨噬细胞的制备及其对不同毒力犬瘟热病毒的敏感性
犬肺巨噬细胞的制备及其对不同毒力犬瘟
热病毒的敏感性
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甏翟谙乏咯,77墅和蠡藤
中国畜禽传染病1995年苇{期(总苇83期)
犬肺巨噬细胞的制备及其对不同毒力一6J
犬瘟热病毒的敏感性.
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钟志宏刘兴筮娄淑杰杨春梅夏成柱(指导)刘家友—._——一_--——一
'
(兰州军区后勤部军事医学研究所)
/摘要
I
犬肺巨噬细胞(DLM)是犬瘟热病毒允许性细胞系统. 奉文报道了钢备高纯度,高活性DLM的方法.通过本方法 制备的巨噬细胞培养物纯度达99%以上,活细胞数占 9l%.1只2,6周龄小犬的肺可制备5X6,9×107细胞. 病毒的敏感性试验表明,DLM不但能支持犬温热强毒增 殖,而且还能支持犬瘟热弱毒的增殖且其感染力无明显差 异.因此可以得出结论;犬瘟热病毒对犬和水貂的毒力并不 总是与该病毒在DLM上的感染和复制能力相一致的. 犬瘟热病毒(CDV)是犬,貉和水貂最重
要的传染病原之一,除引起急性疫病导致大
批动物死亡外,还能感染神经系统使免疫犬
和老龄犬发生脱髓鞘性脑脊髓炎[1~.这种
脑脊髓炎类似于由麻疹病毒(MV)引起的人
亚急性硬化性全脑炎.由于MV与CDV在免 疫学上具有很近的亲缘关引,因此在研究 MV引起的这种神经疾病中常把CDV神经 毒株诱发的老狗脑炎作为其动物模型.但是 因为CDV的特殊性质,很难通过常规的细胞 培养方法从临床病料中分离获得该病毒n]. Apple等在研究CDV的发病机理时发现,动 物感染CDV后病毒最早就在上呼吸道内的 巨噬细胞上复制.以后的研究证实用巨噬细 胞很容易分离出CDV并保持其毒力【7].因此 制备出纯度高活力好的巨噬细胞是CDV研 究的基础.本试验在这方面进行了深入的探 讨并对强毒和弱毒CDV在巨噬细胞上的敏 感性进行了研究.现报告职下.
材料和方法
本文为垒军青年基金课题
*
解放军农牧大学研究所
一
,DLM的制备:选用2,6周龄健康小 犬1只,氯胺酮麻醉后2来苏尔消毒3次, 吹干,75酒精浸泡消毒,吹干后动脉放血, 置于无菌罩内于胸腔处剥皮消毒,切开胸腔 取出肺脏,Hank's液(pH7.2)冲洗5次,加入 MI99完全培养基(90M199+l0胎牛血 清,均为GIBCO产品)浸过肺,置于d?冰箱 5,l0小时,取出剪成小碎块,加入M199完 全培养液于室温搅拌l,2小时,双层厚棉布 过滤,1000rpm离心3,5分钟,弃上清,沉淀
细胞用0.8氯化铵于4?作用l0分钟,离 心弃上清后再洗涤2次.所获得的细胞通过 酯酶活性及苏木精染色进行纯度鉴定,并通 过台盼蓝染色进行活力测定.
二,DLM对CDV强毒株和弱毒株敏感 性测定:本试验所用的强毒株为已证实的犬 瘟热病犬脾和水貂犬瘟热(貂瘟热)病死貂脾 (病料处理方法Is]为将脾脏研碎用MEM培养 液制成l0乳剂,冻融3次盾t000r/rpm离 心l0分钟,取上清过滤除菌后滤液即为病料 处理液);弱毒株为鸡胚成纤维细胞适应疫苗 株(Onderstcpoort株)和Vero细胞适应疫苗株 (Lederle株).
将新制备的DLM分种于小青瓶中,每瓶 lml,含细胞量为5×l0.,36?培养l2小时后 倾去培养液,分别接人0.1ml上述4种病毒 l0倍连续稀释的病毒悬液,每个病毒株的每 一
稀释度接种4瓶细胞,36?吸附3O分钟后 倾去液体,每瓶加入lmlM199完全培养液, 36?静置培养,每天观察细胞病变.直至第7 天,结果按Reed—Munch法计算出TCIDs0.
果
一
,DLM的制备:通过本方法制备的
DLM培养12小时后,大量单个圆形巨噬细 胞紧砧于培养瓶壁,显微镜下即看不见上皮 细胞相成纤维细胞,又不见红细胞.酯酶活性
和苏木精染色鉴定结果表明,其中99以上 细胞为巨噬细胞,台盼蓝染色表明,新制备的 巨噬细胞中活细胞数占91以上.1只2,6 周龄小犬的肺大约可获得巨噬细胞量为5× 10,9×10.
二,DLM对CDV的敏感性:本试验新用 的4个CDV株在DLM上都能增殖并产生典 型的多核巨细胞样的CPE,而且无论是强毒 株还是弱毒株,其TCID50,巨噬细胞系统比任 何其他细胞系统都高(表1),因此巨噬细胞 对强毒和对两株弱毒CDV都是敏感的细胞 系统.
表1CDV的滴定(1og-0/n~) '
t鸡胚成纤维纽胞,一t非iflI绿猴肾细腮?,'t犬肺 巨噬细胞.
讨论
细胞对于病毒来说,可以分为允许性细 胞和非允许性细胞.允许性细胞很容易支持 病毒的生长增殖而没有适应期,而且病毒在 这些细胞上传代后其毒力不易丧失;非允许 细胞系统不支持初始病毒的复制,但是当接 种物经过多次盲传或与移植物共同培养适应 了这些细胞以后,该病毒便很容易增殖,然而 病毒在这种细胞系统上传代以后其毒力很快 降低以至丧失[".?].对于CDV,DLM就是允 许细胞系统[11.12】,从前人的研究结果以及本 试验结果可以看出,DLM不但很容易从临床 病料中分离出CDV,而且Apple等证实,CDV
中国畜禽传染病1995年第4期(总第83期) 在这个细胞系统上传38代仍保持其毒 力[;而在同源或异源动物的上皮细胞 (Vero?DK等)或成纤维细胞(牛成纤维细 胞)上,尽管适应后能增殖,但毒力很快降低, 在Vero细胞上传至14代病毒便已致 弱口h"].对于这2个细胞系统在实际应用 上各有优势,允许性细胞系统用于病毒的分 离鉴定和强毒株的保存;非允许性细胞系统 便可用于弱毒疫苗株的驯化,如目前临床上 使用的Vero细胞适应的CDV弱毒疫苗和鸡 胚成纤维细胞适应的弱毒疫苗.
以前的文献报道,DLM只支持CDV强 毒的增殖,而弱毒株只有经过宿主动物多次 传代返祖为强毒时才能感染DLMCs】.因此有 人建议在CDV弱毒疫苗的安全性监测中把 病毒对DLM的感染力作为疫苗对动物毒力 的指标[|?.本试验结果表明,除2个强毒 CDV外,目前临床上使用的2个弱毒疫苗株 对DLM都有很强的感染力,其TCID~o与强毒 株没有明显的差别.由此是否可以得出这样 的结论:CDV病毒对犬和水貂的毒力并不总 是与该病毒在DLM系统上的感染和复制能 力相一致.
至于DLM的制备方法,以前已有报 道[J扣.但是根据该方法制备的巨噬细胞不够 纯净,含有较多的上皮样细胞,成纤维样细胞 和红细胞,从而影响实验结果;或者方法特殊 难以操作而且收率很低.本试验在Apple方
法的基础上补加0.8氯化胺处理及整个肺
浸泡5,10小时,大大提高了其纯度,而同样
能获得大量的巨噬细胞.整肺长时间的浸泡
有利于肺泡腔内巨噬细胞的游离,剪的时候
相对剪较大的块,减少了可能出现的组织细
胞数量,氯化胺处理破坏了红细胞和组织细
胞结构,从而提高了巨噬细胞纯度.
参考文献
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PreparationofDogLungMacrophageandIt'SSusceptivity toInfectionwithVirulentandAttrnuatedCDV
ZhongZhihongetal
(MilitaryMedicalInstituteofLanzhouCommand) DogLungMacrophage(DLM)isapermissivecellsystemofcaninedistempervirus.Thisrepo
rt
describesamethodofpreparingDLMwjtllhighpurityandhighviability.Thepurityofmacrop
hages
preparedbythismethodishigherthan'990Aand91areviable,Alungofpuppy2to6weeksofag
e
canyieldapproximately5×10to9×
10cells.TheresultofCDVinfectioninDLMshowsthatallthe fourvirulentandattemuatedCDVusedinthistestcanpropagateinDLM.Wecanconeludethat
CDV
virulencewasnotalwayslinkedtoitsabilitytoinfect ,7-'1钿Il,螽境笑荤病
奎整盛正太
(南京动植物检疫局)
犬细小病毒(cPv)是犬细小病毒病的病
原,发病率高达20---100oA,死亡率为lO,
5O,对养犬业造成极大的威胁.该病1977
年由美国学者Eugster等最早从患出血性肠
炎的犬粪便中分离,1978年美国和加拿大报
道了CPV的流行.目前已波及全世界,成为
犬的主要传染病之一.
1980年秋我国华东,西南,东北等地先
后暴发疑似CPV病.1982和1983年梁士哲,
朱维正等和徐汉坤等确认流行的犬出血性肠 炎病原为CPV.近年来,养犬业得到迅速发 展,犬的进出口频繁,CPV病成为养犬者和进 出口检疫最重要的犬病之一,现报道我们首 次从进境犬中分离,鉴定CPV的结果. 酾八
8.6}
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材料和方法
一
,病毒分离
1.样品来源:1994年4月问,江苏某公 司从香港引进2月龄挪威那犬l9头,在隔离 检疫期间出现呕吐,腹泻,血痢等症状,取发 病犬粪便肝,心,肠系膜淋巴结等作为病毒 分离样品.同时取本地一发病犬粪样对照分 离.
2.样品处理;粪便以PBS(pH7.2),lO倍 稀释4000rpm离心30分钟,取上清9份加氯 仿l份,10000rpm离心3O分钟,取上清,按 1000pg/ml加双抗作用后接种细胞.内脏按l .5加PBS(pH7.2)研磨,按上述步骤离心处