精子活力测定

精子活力测定 实验三 精液品质的感观检查精子活率、 密度检查 一、实验目的 掌握检查精子密度、活率的方法;熟悉感观检查精液品质的方法。 二、实验 1. 精液 选用牛、羊、猪、马、犬、兔任意一种动物的新鲜精液。 2. 药械用品 显微镜、显微镜保温箱(或显微镜恒温台)、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、温度计、滴管、擦镜纸、纱布、蒸馏水、3%和0.9%氯化钠溶液、2%煤酚皂溶液、1/3000新洁尔灭溶液、75%酒精。 3. 其他 精子密度挂图及有关图。 三、实验内容 ,一,精液的感观检查 观察测定下列各项结果并记入登记表内。 1. 测定射精量 将采得的精液倒入有刻度的试管或集精杯中，测量其容量。各家畜的射精量平均为:马70(30—100)ml，驴50(10—80)ml，牛4(2—10)ml，羊1.0(0.7—2.0)ml，猪250(150—500)ml。 2. 色泽、气味观察 观察精液的色泽并嗅闻气味。 3. 云雾状的观察 观察牛、羊精液翻腾滚动的云雾状态，并按以下符号记入表内，云雾状显著者以“+++”表示，有云雾状者以“++”表示，云雾状不明显或无云雾状者以“+”表示。 ,二,精子密度检查及活率评分 1. 精子的密度 取1小滴精液在清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，不得存留气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置于显微镜下放大400—600倍观察，按下列等级评定其密度。 密——在整个视野中精子密度很大，彼此之间空隙很小，看不清楚各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，每毫升精液含精子数约在10亿个以上，登记时记以“密”字。 中——精子之间的空隙明显，精子彼此之间的距离约有一个精子的长度，有些精子的活动情况可以清楚地看到。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约在2—10亿个之 间，登记时记以“中”字。 稀——精子分散于视野内，精子之间的空隙超过一个精子的长度，这种精液每毫升所含精子是在2亿以下，登记时记以“稀”字。 牛精子密度示意图 A:密;B.中;C.稀 2. 精子的活率评定 必须于采精后立刻在22—26?的实验室内进行，最好是在37?保温箱内进行，在评定精子活率的同时也可以测定精子的密度。 用玻璃棒蘸取1滴原精液或经稀释的精液(马、猪精液的精子密度低，可以不稀释，而牛、羊精液的精子密度大，须用0.9%氯化钠溶液或其他稀释液进行稀释，其温度须与精液温度相近)，滴在载玻片上，加上盖玻片，其间应充满精液，不使气泡存在，也可滴在盖玻片上翻放于凹玻片的凹窝上，置于显微镜下放大250—400倍检查。注意显微镜的载物台须放平，最好是在暗视野中进行观察。 悬滴法检查精子活率精子的活动有3种类型，即直线前进运动、旋转运动和振摆运动。精子的活率是根据直线前进运动精子数的多少而定的，即: 呈直线前进运动精子数 精子活率,，100%总精子数 目前评定精子活率等级的方法有两种: 十级制——在显微镜视野中估测直线前运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级;90%者评定为0.9级;无直线前进运动精子的精液为“0”级。 牛、羊的精液中由于副性腺分泌物少，精子密度大，因此，要求精液达到”密0.6”(即密度为“密”，活率为“0.6”级)及“中0.8”级以上才能作为合格的精液。而马、猪的精液中副性腺分泌物多，精子密度小，因此正常的精液定为“中0.6”、“稀0.8”以上的等级。 表1 种公畜精液品质检查登记表 采精时间 射精量 畜别 畜号 色泽 气味 云雾状 密度 活率 (年月日) (ml) 实验四 精子数量计算和畸形率的测定 一、实验目的 1. 掌握测定每毫升精液中所含精子数的方法，以及测定精子畸形率的操作要点。 2. 测定每一头份冷冻精液内有效精子数，以确定是否符合输精要求。 二、实验材料 1. 精液 任一种公畜或雄性动物的新鲜精液或冷冻精液。 2. 器械 显微镜、载玻片、盖玻片、红细胞及白细胞稀释管、血(色素)吸管、血细 胞计数盘、光电比色计、5ml试管、1ml及2ml吸管、玻棒、染色缸、染色架、玻片镊、纱 布。 3. 几种染色液配方 (1)0.5%龙胆紫 0.5g 96%酒精 100ml (2)酒精固定液 40%甲醛(福尔马林) 12.5ml 96%酒精 87.5ml (3)凡那他氏镀银染色液 ? 胡氏固定液 福尔马林 2ml 醋酸 1ml 蒸馏水 100ml ? 染色液 单宁酸 5g 石炭酸 1g 蒸馏水 100ml ? 硝酸银溶液 硝酸银 0.25g 蒸馏水 100ml (4)威廉斯染色液 ? 品红原液 品红 10g 96%酒精 100ml ? 伊红原液 将伊红溶于酒精中制成饱和溶液。 ? 染色液 品红原液 10ml 5%石炭酸 100ml 取混合液 50ml 伊红原液 25ml 注:充分混合，至少放置14天后，经过滤可用于精子染色。 ? 美蓝原液 美蓝 10g 酒精(96%) 100ml 4. 畸形精子形态图、血细胞计算盘构造图 三、实验内容 ,一,精子数量测定 1. 血细胞计算盘测定法 (1)清洗器械 先将血细胞计算盘及盖玻片用蒸馏水冲洗，使其自然干燥。血吸管或红细胞和白细胞稀释管先用蒸馏水冲洗，再用95%酒精清洗，最后用乙醚清洗。试管及吸管洗净后须经烘干。 (2)精液的稀释 ? 用1ml吸管准确吸取3% NaCl 0.2ml或2ml，注入小试管中。根据稀释倍数的要求，再用血吸管吸出10μl或20μl NaCl溶液弃去。 ? 用血吸管或红、白细胞稀释管吸取精液至刻度10μl或20μl处。 ? 用纱布擦去吸管尖端附着的精液，将精液注入到小试管中。 ? 用拇指按住小试管口，振荡2—3min使其混合均匀。 (3)精子的计数 ? 将擦洗干净的计算盘置于显微镜载物台上，在计算室上盖上盖玻片。 ? 将试管中稀释好的精液，滴一滴于计算室上盖玻片的边缘，使精液自动渗入计算室。注意不要使精液溢出于盖玻片之上，也不可因精液不足而致计算室内有气泡或干燥之处，如果出现有上述现象应重新操作。 ? 静置3min后以400—600倍显微镜检查。 ? 统计出计算室的四角及中央共5个中方格即80小方格的精子数。 ? 统计每个小方格内的精子，只数小方格内压在左线和上线的精子。 ? 由5个中方格(80个小方格)所统计的精子数(X)代入下列公式即得出每毫升的精子数。 X，400，10，稀释倍数，1000,每毫升精液所含精子数,X，50000，稀释倍数 80 血细胞计数板及计算顺序和方法 确定精液稀释倍数可以按表1、2计算。 表1 精液稀释倍数 吸取时所达到的刻度 精液种类 稀释管种类 稀释倍数 精液 3% NaCl 0.5 101 200 红细胞吸管 1 101 200 牛 羊 10μl 1990μl 200 血吸管 20μl 1980μl 100 0.5 11 20 白细胞吸管 1 11 10 猪 马 10μl 190μl 20 血吸管 20μl 180μl 10 表2 精子浓度计算 稀释倍数 应乘常数 稀释倍数 应乘常数 200 1000万 20 100万 100 500万 10 50万 为了减少误差，必须进行两次精子计数，如果前后两次误差大于10%，则应用第三次检查。最后在3次检查中取两次误差不超过10%的，求其平均数，即为所确定的精子数。 2. 光电比色计测定法 常用的光电比色计有581—G型、72—1型和76—1型等。 制备测定管，进行被检样品的比色。 (1)牛精液精子浓度的测定 ? 用2.9%等渗柠檬酸钠液5ml，定点到100;取鲜精0.1ml加进入另一个装有4.9ml的2.9%柠檬酸钠的比色皿中。 如用581—G型比色计，要用42号蓝色滤光片比色;如用72—1型比色计，要用440nm进行比色，其透光度和光密度值(X值)。 ? 同上另在测定管内加1滴8 mol的苛性钠，同除去精清的密度记录其透光度的光密度。 (2)用血细胞计数盘计数，待测各鲜精样品数批，每份样品测两次，如两次误差超过5%时需要重测。将两次平均值作为该透光度(或光密度)溶液的密度。用牛精液测定的结果见表3。 ,二,直线前进运动精子数的计算,精子活率的计算, 方法基本和精子数量计算法相同，有以下几点不同。 1. 用0.9%生理盐水作为稀释液，以保持活精子的正常动动。 2. 显微镜应置于保温箱内，保持37—38?。 3. 统计出4个角的4个及中央1个共5个方格中的非直线运动(包括死精子、摆动、 旋转运动)的精子数，求出每毫升精液中非直线运动的精子数。 4. 将计算盘放入120?的干燥箱中5min，利用高温杀死全部精子后，计数4角及中央 5个方格的精子数，求出每毫升精液中的总精子数。 5. 计算直线前进运动精子的百分率，即精子活率: 总精子数,非直线运动的精子数 精子活率,，100%总精子数 表3 奶牛、肉牛精子密度查数表 透光度 亿/ml 透光度 亿/ml 透光度 亿/ml 透光度 亿/ml 透光度 亿/ml 24.7641 19.7251 14.6789 9.6363 4.5937 5 24 43 62 81 24.4981 19.4561 14.4135 9.3709 4.3283 6 25 44 63 82 24.2333 19.0907 14.1481 9.1055 4.0629 7 26 45 64 83 23.9679 18.9253 13.8827 8.8401 3.7975 8 27 46 65 84 23.7025 18.6599 13.6173 8.7547 3.5321 9 28 47 66 85 23.4371 18.3945 13.3519 8.3093 3.2667 10 29 48 67 86 23.1717 18.1291 13.0865 8.0439 3.0013 11 30 49 68 87 23.9063 17.8637 12.8211 7.7785 2.7359 12 31 50 69 88 22.6409 17.5983 12.5557 7.5131 2.4705 13 32 51 70 89 22.3755 17.3329 12.2903 7.2477 2.2051 14 33 52 71 90 22.1101 17.0675 12.0249 6.9823 1.9397 15 34 53 72 91 21.8447 16.6021 11.7595 6.7169 1.6743 16 35 54 73 92 21.7593 16.5367 11.4941 6.4515 1.4089 17 36 55 74 93 21.3139 16.2713 11.2287 6.1861 1.1435 18 37 56 75 94 21.0485 16.0059 10.9633 5.9207 0.8781 19 38 57 76 95 20.7831 15.7409 10.6979 5.6553 0.6127 20 39 58 77 96 20.5277 15.4751 10.4325 5.3890 0.3437 21 40 59 78 97 20.2523 15.2097 10.1671 5.1745 0.0819 22 41 60 79 98 19.9869 14.9443 9.9017 4.8591 23 42 61 80 (注:新鲜精液0.1ml+2.9% 柠檬酸钠4.9ml) ,三,每头份冷冻精液中有效精子数的测定 1. 随机取一份精液，用常规方法解冻后，较准确地评定出精子活率。 2. 在同一批冷冻精液中，再随机取一份精液(取一粒颗粒冷冻精液直接投入小试管中， 不需加解冻液)。在60—80?热水中经数分钟杀死全部精子，用1ml吸管准确量取被检精液， 将测量过的精液依然注入到原试管内。 3. 另取一支1ml吸管，准确吸取2.9%柠檬酸钠溶液，取用量为1ml精液/头份，注入到 精液试管中，充分混合均匀。这样试管内经稀释后的精液量即为1ml。 4. 取稀释后的精液，滴入血细胞计算盘内，计数5个方格中的精子数(设为X个)。 5. 按下列公式计算 X精子数/ml,，400，10，1000(1) 80 或者以X个精子数直接乘以5万即为1ml稀释后精液内的精子数。 (2)精子数/头份=精子数/ml×精液量(ml)/头份 (3)有效精子数/头份=精子数/头份×精子活率 ,四,测定精子畸形率 1. 以细玻璃棒蘸取精液1滴，滴于载玻片一端，如系牛、羊精液应再加1—2滴0.9% NaCl溶液。 2. 以另一载玻片的顶端呈35度角，抵于精液滴上，向另一端拉去，将精液均匀涂抹于载玻片上。 3. 抹片于空气中自然干燥。 精液抹片的制备 1.将1滴精液滴在;2.玻璃片上用另一玻片 拉向液滴，使玻璃片边缘附着精液;3.将玻片推向另一端 4. 用下列任意一种方法固定染色。 (1)用0.5%龙胆紫酒精溶液染色3min，水洗、待干即可镜检，也可用蓝墨水染色。 (2)置于酒精固定液中固定5—6min，取出以水冲洗后，阴干或烘干，用蓝墨水染色3—5min，再用水冲洗，使之干燥后于显微镜下检查。 (3)凡那他氏镀银法 将自然干燥的抹片，以胡氏溶液滴在玻片上固定1min，水洗10s，将染色剂滴在玻片上，慢慢加热至发生蒸气为止，用水洗30s后，再加上0.25%硝酸银2—3滴，立即滴上1滴氨水，抹片左右摇动，则产生混浊的黄褐色，再放在酒精灯上慢慢加热，经20s，直至发出水蒸汽的“白雾”状为止，最后再进行水洗，待干后便可镜检。 (4)威廉斯染法 将自然干燥的抹片放入无水酒精中固定4min，然后移入0.5%氯胺T(Chloramine-T)中浸2min左右，直到抹片上的粘液物质被除掉而变得清洁为止。再分别浸入蒸馏水和96%酒精中轻洗几分钟，投入石炭酸品红—伊红染液中停留10min，取出后在清水中蘸2次，最后移入美蓝溶液中停留5min，取出干燥后即可在显微镜下进行检查。 5. 镜检 将制好的抹片置于显微镜下，查数不同视野的500个精子，计算出其中所含的畸形精子数，求出畸形精子百分率。 1 A. 正常精子 B. 游离原生质滴 C. 各种畸形精子D. 精子头部脱落 E. 精子附有原生质滴 F. 精子附有 远侧原生质滴 G. 精子尾部扭曲 H. 精子顶体脱落 I. 各种家畜的正常精子 a猪 b. 绵羊c. 水牛 d. 牛 e. 马 2 A. 正常顶体 B. 顶体膨胀 C. 顶体部分脱落 D. 顶体全部脱落