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脂肽类生物表面活性剂研究进展

2017-09-30 15页 doc 354KB 49阅读

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脂肽类生物表面活性剂研究进展脂肽类生物表面活性剂研究进展 专论与综述 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集 脂肽类生物表面活性剂研究进展 肖怀秋1,兰立新1,李玉珍2 (1(湖南化工 职业技术学院应用化学系,湖南株洲,412004; 2('湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙,410128) 摘要:主要从脂肽类生物表面活性剂的生产菌株、生物合成因素、生物学结构与特性以及应用 等方面进行了综述,同时针对当前研究现状,对今后发展提出几点展望和建议( 关键词:芽孢杆菌属;生物表面活性剂;应用;研究进展 Biosurfactan...
脂肽类生物表面活性剂研究进展
脂肽类生物表面活性剂研究进展 专论与综述 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议集 脂肽类生物表面活性剂研究进展 肖怀秋1,兰立新1,李玉珍2 (1(湖南化工 职业技术学院应用化学系,湖南株洲,412004; 2('湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙,410128) 摘要:主要从脂肽类生物表面活性剂的生产菌株、生物合成因素、生物学结构与特性以及应用 等方面进行了综述,同时针对当前研究现状,对今后发展提出几点展望和建议( 关键词:芽孢杆菌属;生物表面活性剂;应用;研究进展 Biosurfactants Advance ofStudy Lipopeptides (XMO Yu-zhen2Huai-qiul(LANLi-xinl(1,1 Chemical Vocation Chemistry,Hunan (1(Department ofApplication Industry Technology Science and ofHunan Institute,Zhuzhou 412004,China:2(Food Technology College 4 1 0 1 Agricultural University,Changsha 28,China) and factors of structure of Abstract:Producing strains,effect synthesis,biological , characterizationsapplication summarized(And to surfactants were current research actuality,some lipopeptide meanwhile,according and forward( were proposals suggestions put Keywords:Bacillus:biosurfactants;application:study advance 1 前言 生物表面活性剂是微生物在一定条件下的生长代谢过程中分泌出来的具有一定表面 活性的 代谢产物,如糖脂、多糖蛋白脂、脂肽、磷脂和脂肪酸中性类脂衍生物等。脂肽类生物表面活性 剂一般是革兰氏阳性的芽孢杆菌的代谢产物。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组 成。由于其特殊的化学组成和双亲型分子结构,脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及 微生物采油等领域应用广泛。相对化学合成的表面活性剂,生物表面活性剂有许多重要的优点, 比如可生物降解、低毒性以及各种变异结构等。1968年,Arima等首次发现Bacillus subtilis菌株 可以产生脂肽类表面活性剂,呈晶状,商品名为surfactin,这类表面活性剂主要包含有lturins, Bacillomycin,Fengycin和surfactin等,其中以surfactin表面活性最高,也是迄今为止报道效果 最好 的生物表面活性剂之一。笔者主要从脂肽类生物表面活性剂的生产菌株、影响生物合成因素、 生物学结构与特性以及应用等方面进行综述,通过当前的研究现状,提出几点展望与建议。 2脂肽类表面活性剂生产菌株 脂肽类表面活性剂一般由革兰氏阳性的芽孢杆菌代谢产生,能产生脂肽类表面活性剂的菌 株有很多,如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus 可以产生licheniformis)等。除了细菌 脂肽类表面活性剂外,酵母、真菌也可以产生。常见的能产生脂肽类表面活性剂的菌株 及合成的脂肽类表面活性剂名称见表1。 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集 专论与综述 3脂肽表面活性剂生物合成的影响因素 脂肽类表面活性剂的合成代谢过程中,培养条件对其有着极为重要的影响。这些影响因素主 要包括菌株、培养温度、金属离子、底物以及发酵工艺等等,各因素的作用一个复杂的过程。 3(1菌株的选育 菌株的成功获得是脂肽类生物表面活性剂生产的先决条件,菌株的产量高低直接 影响发酵后 的产量,因此快速而有效地筛选和分离出高生产菌是研究的关键所在。判断生物表面活性剂生产 菌的存在与否可以通过测量液,气或两种液体之间的界面力来确定,其包括毛细管法、威廉 米吊片法、环法、泡压法及悬滴法等。近年来,有研究报道了一些快速筛选生物表面活性剂产生 菌的方法。如液滴轴线对称分析法(ADSA(P)和比色法等。液滴分散法可以定性地确定生物表面 活性剂产生菌的种类。改进后的液滴分散法既可以定性地筛选出生物表面活性剂产生菌,又可以 定量地测定出生物表面活性剂的浓度。为了有效的提高菌株的产表面活性剂能力,可以对其进行 物理、化学因子诱变或通过DNA重组等生物技术方法来提高菌株合成产物能力。 JF(2菌株能在好氧和厌氧条件下合成生物表面活性剂且能生活在10,NaCI、Bacillus lieheniformis 50?、 JF(2所具有的这些特点使得其可以应用于微生物法强 pH4,9的油层环境中。Bacilluslieheniformis 化采油。向Bacillus JF-2培养液中加入化学诱变剂-甲基(舭硝基水亚硝基胍? lieheniformis KGL 11,它产生的表面活性剂类型与Bacillus (MNNG),得到变异体Bacillus lieheniformis JF(2相同,但浓度比出发菌株提高了12倍多。 lieheniformis 3(2金属离子 wei等报道了添加金属离子大大提高了产脂肽类生物表面活性剂的能力。在铁离子 Yu-Hong 富集的培养中,Surfactin的产量会大大提高,在枯草芽孢杆菌生产Surfactin的实验中,在培养基 中 500 添加不同浓度的FeS04,Surfactin的质量浓度可高达3 me,t,,相对原来菌株合成能力提高了 近10倍,当葡萄糖培养基中Mnz+为0(Ol mmol,L时,Surfactin的质量浓度可高达2(6 g,L,为常规量的8倍。 产 3(3培养基碳、氮源 Hee(Sik subtilis Kim等以糖(葡萄糖)为培养碳源进行试验研究发现,Bacillus C9(BS在限制氧 供 subtilis 应比氧充足条件下产量增加了3倍多。Davis等对Bacillus ATCC21332生产Surfactin的产 量与氮源代谢关系进行深入研究发现,在以硝酸铵作为氮源的培养中,当铵被消耗完后,在厌氧 条件下,微生物可以利用硝酸根进行代谢合成生物表面活性剂,而且Surfactin产量还比较高。传 统的方法是利用烃或葡萄糖作为培养基碳源来生产表面活性剂的,由于葡萄糖作为碳源时成本过 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集 专论与综述 高,因此无法实现工业化规模的生产。因此,人们试图研究其它物质来替代。如城市生活污水、 工业废弃物以及工业副产品等。糖蜜可以作为碳源用于微生物代谢合成表面活性剂。用土豆废液 做碳源培养枯草芽孢杆菌生产Surfactin不需经过灭菌即可用于生产,产量比纯土豆淀粉培养基低 60,。 3(4发酵工艺 NK研究表明,用麦麸 传统的生产工艺是采用发酵罐培养细菌生产表面活性剂。Veenanadig 做原料制成填充柱反应器可使枯草芽孢杆菌产生表面活性剂并可以将填充柱式反应器作为生产 生物表面活性剂的固相反应体系应用于商业领域。泡沫分馏法可用于从发酵液中回收Surfactin, 因为含有细菌的发酵液比无细菌的发酵液产生的泡沫更稳定,所以提取效率更高。发酵过程中低 搅拌速度对产生泡沫是很有必要的,发酵lO~30 ll,搅拌速度146,166 r,min可以获得到高浓度的 Surfactin泡沫流出物,浓度在1(22,1(67 g,L,这个方法可以在完整的生产回收工艺中应用。 4脂肽表面活性剂的生物学结构与特性 脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基,脂肪烃链形成亲油基,亲水的氨基酸能和烃 链上的羧基、羟基或氨基结合形成环状,因此,脂肽类生物表面活性剂一般以内酯或酰胺键结合 形成环状脂肽(cylie lipopetide)。枯草芽孢杆菌可以产生Surfactin和Iturin两种脂肽类生物表面活性 剂,前 者是p(羟基脂肪酸和肽以内酯键结合,而后者是B(胺基脂肪酸和肽以酰胺键结合。不同细 菌能产 生不同种类的表面活性剂。同一细胞在不同条件下也可以产生不同类型的表面活性剂。如 枯草芽孢杆菌中某些菌株只能产生Surfactin,某些菌株可同时生产Surfactin、Rufin、Fengycin, 而且即使同一菌株产生的同一种表面活性剂也不是纯的单一分子化合物,如Surfactin具有多个结 构类似物,这些类似物具有共有结构(如图1)。 C‘o—LQI?l-(I(-I(m12-(D-Lind C弛 “?岫铂一(瓯k_川他一占咐 ? , 。’1‘ ,, o—bLe叮(I厶k哺(-b^l筘 图1 Surfactin基本结构 Basic structure ofsurfacfinFig(1 李蔚等用Bacillus licheniformis产生的一种脂肽类表面活性剂,其临界胶束浓度(CMC)为30 mg,L,该产物经PAGE电泳、红外光谱(IR)、色谱(质谱联用(GC(MS)和纸层析(Pc)分析发 现:其 疏水基半分子为p(甲基十四碳脂肪酸及p(羟基十八碳脂肪酸。肽链包括有天门冬氨酸(Asp)、谷氨 酸(Glu)、异亮氨酸(Lie)、缬氨酸(VaJ)、赖氨酸(Lys)等氨基酸,为一种由脂肪酸和肽组成的脂肽 类生物表面活性剂。特性分析结果表明:该表面活性剂可耐高温和高浓度盐、pH适应范围较广、 对原油具有较强的乳化、增溶、脱附和降黏作用。尹华等由Pseuomonas XD-1菌株所 活性剂为脂肽类和糖脂类混合物。其CMC为50 产生的表面 mg,L。在pH=6(O时活性最 subtilis 好。高学文等通过 MALDI(TOF(PSD(MS分析确定了Bacillus B2菌株产生的腊肽类抗生 素的变异体的分子结 构。经HPLC-SMART-SYSTEM分离,对变异体3个主峰收集液做 MALDI(TOF(PSD(MS分析确定 第l峰的变异体为含13个碳原子的脂肪酸链以及 皿(Giu)((L(Leu)(D(-Leu)。(L(VaI)((L-Asp) -(D—Leu)-(L—leu)环肽组成,称为C13表面活性素变异体。用同样方法分析了第2和第3峰,分别鉴 定为C14和C15表面活性素变异体。因此,B2菌株产生的表面活性素变异体由13、14和15个碳原子 的脂肪酸链以及皿-Giu)((L-Leu)-D(-Leu)((L-Val)-(L-Asp)(?(Lcu)((L-leu)七环肽组成。杨世忠等 subtilis }ABacillus HS0121的培养液中得到的一种表面活性剂,对环脂肽氨基酸顺序进行了质谱 ?116‘ 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集 专论与综述 测定,质谱显示了脂肽饱和羟基脂肪酸中羟基的位置,氨基酸分析表明肽部分由4个Leu、1个Asp、 l@Val和1个Glu组成,并确定了脂肽的环状结构。 脂肽中7个氨基酸联接成肽链,与羟基脂肪酸 以内酯键结合成环状,结构上的差别在于几个 位置的氨基酸被其它氨基酸取代。容易被取代的位置一般为7(,4(,2(位的L(氨基酸,特别是4,位更 易变化,但3(,6(位D(构象的氨基酸结构相当保守,可能原因是D构象的氨基酸在肽链闭合环中起 着关键作用。同时,碳链的长度及支链位置也不相同。已经分离发现的Surfactin结构类似物有十 多种(见表2)。对这些Surfactin的结构类似物用常规的分离仪器很难以完全分离和鉴定。目前,已 经 RP-HPLC分离结构差别微小的脂肽,用NMR、TOFMS等确定脂肽的分采用特殊分离柱的 构。但这些分离还只能满足分析用的微量样品,大规模的工业分离还仍需要进一步的研究( 子结 表2 surfactin的异构体 Table 2 Isomers of surfactins 序号 氨基酸 分子量 脂肪酸碳链长 碳链类型 里竺翌!竺璺里!翌Q竺塑 里竺!竺竺!竺!堡!璺坠 !塑曼坐旦!!竺垒旦!垫坐!!!!塑箜!垒!堕!曼旦型竺!!璺!垒Q!垒型翌 l 008 anteiso Cl, l口ku刀一 2 994anteiso rVm7】? CJ3 3 994 n(d【Ile2,Val刀一 C13 1 022 iso 4皿铷7】一 C14 5 l 008 iso,n [Val刀? Ci4 6 1 008 iso[Ile2,Val7】- C14 7 l 036 anteiso [heuV]- Cis 8 l 022 IsoBle71? C14 9 l 022 anteiso [ValT]- C15 10 l 022 anteiso [Ile2,ValT]? Cl l l 1 036 antciso [1ie刀一 Cls 12 l n(d036【Ilc2,Ile7】- Cl; 脂肽的分离和鉴定依赖于分离方法和分析手段的进步。自1968年分离得到表面活性素 Surfactin以来,人们就采用先进的分析方法和仪器设备认识TSurfactin及其结构类似物的分子特征。 同时也发展了很多新的检测方法,如x-射线光谱、化学修饰、质谱技术和二维核磁共振技术等。 5脂肽类生物表面活性剂的应用 脂肽类生物表面活性剂广泛用于食品、化妆品、医药以及微生物采油等诸多行业中,但由 于目前生物表面活性剂的生产成本相对较高,大规模的应用还需进一步研究以降低生产成本,纯 度较高的生物表面活性剂目前主要用于科学研究中。 5(1有抗病毒中的应用 Vollenbroich D等在研究surfactin对脂包膜病毒的灭活作用机制时发现,Sur-factin灭活病毒遵 循两阶段灭活动力学,对脂包膜病毒比非脂包膜病毒灭活效率高,特别是对于疱疹病毒、逆转录 病毒等的灭活效率更高,可能的原因是Surfactin作为表面活性剂能与病毒的脂质膜发生物理化学 交 互作用。Surfactin的病毒灭活作用可以使它能够应用于增强生物技术的病毒安全性方面。而且, 由于Surfactin的异构体具有体内毒性低的优点,使得在制药工业中生产的药品用此类试剂后不再 需要除去病毒灭活剂。进一步的研究还发现,Surfactin的抗病毒活性取决于疏水基的碳原子数目 和肽键的电荷,疏水基烃链的碳原子数为C13的抗病毒活性比C14和C15低许多,C15的单甲酯有灭 活SFV病毒的活性,这种病毒对枯草芽孢杆菌产生的Surfactin混合物具有抵抗力。c15的异构体 及带负电表现出最高抗病毒活性。 专论与综述 中国化工学会精细化工专业委员会全国第93次学术会议论文集 5(2除去受污染土壤中的重金属离子 脂肽生物表面活性剂能选择性除去土壤中的Pb,Zn, Cu,和cd等重金属离子,其中,Cu最 易被除去。重金属离子去除的原因在于生物表面性剂带有的负电荷可结合带正电的金属阳离子。 由地衣芽孢杆菌产生的脂肽地衣素能够和阳离子螯和,且地衣素是比表面活性素更稳定的阳离子 螯合剂。 5(3用于防治植物病原菌 芽孢杆菌属细胞产生的抗生素类Iturin具有广谱抑制植物病原菌的作用。用大豆残渣固体培 养 发酵得到的lturinfl皂有效抑制西红柿的丝核菌。实验表明,Iturin台E够作为生物杀虫剂取代化学 类杀虫剂,使得食品工业的有机废料经细菌转化可以产生生物杀虫剂,有效地实现了有机废物综 合利用。不同的枯草芽孢杆菌株还能产生杆菌抗霉素类似物,也具有强烈的抗真菌活性。 5(4发泡性能 度surfactin是表面活性剂,因此具有发泡性能,在水溶液中能形成稳定的泡沫。当Surfacin浓 从0(05增加到0(2 mg,mL时,发泡体积几乎不变,形成的泡沫比BSA(牛血清白蛋白)更加均 匀细腻。而且加入BSA后Surfactin的发泡产生协同增效作用。脂肽表面活性剂的亲水基团和疏 水基团对于发泡性能有影响。碳链数为14个碳原子时发泡性能最好。碳数增加到15以上泡沫体 积急剧减少,C13的乳化性能好,而另两者的发泡性能好。碳数相同时,Surfactin能产生更细腻 的泡沫,而Iturin产生的泡沫稳定性更好,表明亲水结构对于发泡陛能有重要影响。 5(5微生物采油 生物表面活性剂可促进原油从矿石、含有页岩断层的表面解吸附,从而有利于提高采油产量。 解吸附的范围和大分子量烃的浓度相反。表面活性剂复合物还能够促进原油降解。微生物在油井 内利用烃为碳源生长繁殖,能够产生表面活性剂、产酸、产气和产多聚物,从而促进原油从地底 采集。表面活性剂对长链烃的降解更显著。地衣芽孢杆菌NK-X3产生一种脂肽类生物表面活 000 性 mg,L的条件下,于120"C高温下不失活,这剂,在pH为和12和钙离子质量浓度为4 些特 点有利于该产品在原油的增采和输送中使用。 6展望 微生物代谢产物具有多样性,是多种抗生素、表面活性剂、功能性化学成分的重要来源。 细菌产生的脂肽种类繁多、结构复杂。即使具有同一基本结构的脂肽生物表面活性剂也存在多种 结构类似物。由于这些脂肽结构相似,因此从细菌发酵液中分离纯化得到单分子化合物非常困难, 同时也给进一步的结构鉴定带来了困难。脂肽结构鉴定的一个重点是肽链的鉴定,包括氨基酸的 种类、比例和连接顺序等,质谱技术的发展为肽链结构的鉴定提供了一种新的有效方法。生物表 面活性剂的研究在我国处于初级阶段,在其它发达国家也是新兴领域。目前,其工业化水平较低, 有很大的发展潜力。目前,化学家不仅清楚地认识到了合成天然产物的模块化细胞机制,并且已 经利用代谢工程来制造全新分子。相信随着基础研究的深入开展,生物表面活性剂将不仅仅作为助 剂,而是将作为药物的有效成分得以充分应用。脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生,然而, 由于其产量较低,生产成本较高,大规模的工业应用还未能实现。因此,脂肽表面活性剂还在许多 问题和关键技术有待于攻关,相信随着基因工程技术和生物工程技术的发展,脂肽类生物表面活性 剂的研究将会出现一个新的局面。特别是对产生菌株产脂肽表面活性剂机理和分子调控机制的深入 研究,其产量将会得到进一步的提高。通过有效构建基因工程菌和优化培养条件、改善分离工艺等 手段,将来人们将可能实现脂肽表面活性剂的大规模生产和应用并产生可观的经济效益。 参考文献(略)
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