复方血栓通胶囊化学成分在比格犬眼球和肾脏内的分布研究

复方血栓通胶囊化学成分在比格犬眼球和肾脏内的分布研究 复方血栓通胶囊化学成分在比格犬眼球和 肾脏内的分布研究 [摘要]糖尿病视网膜病变,DR,和糖尿病肾病,DN,是最常见的糖尿病并发症,也是糖尿病致死致残的主要原因,临床报道显示复方血栓通胶囊对DR和DN均有较好的治疗作用,但复方血栓通胶囊中的化学成分在眼球和肾脏中的分布尚无报道,该研究主要探索复方血栓通胶囊中的化学成分在比格犬眼球和肾脏中的分布情况。比格犬连续灌胃给予复方血栓通胶囊3 d后,取眼球和肾脏,运用高效液相色谱-高分辨液质联用技术LTQ-Orbitrap鉴定其中的化学成分,通过与对照品及相关文献中化学成分的精确相对分子质量、保留时间以及二级碎片信息比对,确认化合物。该研究在眼球和肾脏中分别鉴定出14,19个三七皂苷类成分。鉴定结果为阐释复方血栓通胶囊在治疗DR和DN的有效成分奠定了一定的物质基础 [关键词]复方血栓通胶囊, 三七皂苷, 眼球, 肾脏, HPLC LTQ-Orbitrap [Abstract]Diabetic retinopathy,DR, and diabetic nephropathy,DN, are the most common complications of diabetes, and the main causes of death and disability of diabetes. Clinical reports showed that Fufang Xueshuantong capsule,FXT, had effective curative effect on DR and DN, but there was no report on the distribution of chemical compounds of FXT in beagle dog eyes and kidneys. In this study, FXT was given by gavage administration in Beagle dogs for 3 days, and then their eyeballs and kidneys were taken. The chemical compounds in beagle dog eyes and kidneys were detected by HPLC LTQ-Orbitrap technology. Furthermore, by comparing with the data from retrieving literature and references, the chemical compounds were identified by the accurate mass, retention time ,tR,, and MS/MS. Fourteen and 19 types of notoginsenosides were respectively identified in eyeballs and kidneys in this study, and these results could lay foundation for clarifying the effective ingredients of FXT in treatment of DR and DN. [Key words]Fufang Xueshuantong capsule, notoginsenosides, eyeball, kidney, HPLC LTQ-Orbitrap doi,10.4268/cjcmm20162022 糖尿病是一种常见疾病,它不仅导致机体代谢紊乱,而 且可引起多个系统的并发症,严重影响人类健康。糖尿病并 发症,是糖尿病致死致残的主要原因。糖代谢异常导致血管、神经以及组织器官的损伤,其中糖尿病眼病、糖尿病肾病是最常见的糖尿病微血管并发症之一,目前对该类疾病的治疗药物较少。复方血栓通胶囊是中山大学中山眼科中心与广东众生药业股份有限公司共同研制开发的纯中药复方制剂,由君药三七、臣药丹参、佐使药黄芪、玄参4味药组成。三七占全方的54.3%,具有活血化瘀、益气养阴的功效。复方血栓通胶囊在眼科疾病中广泛应用,尤其是对糖尿病视网膜病变疗效显著[1-3]。同时,相关文献报道[4-5],复方血栓通胶囊能较好的改善肾功能,对糖尿病肾病具有保护作用 在中医理论的指导下, 中药的药效物质基础,即具有临床疗效的有效成分,是探索中药功效与其作用的本质与核心,是中药现代化发展的基础[6]。课题前期已对复方血栓通胶囊入血成分及粪、尿中的代谢成分进行了研究,但对复方血栓通胶囊在组织器官中的化学成分分布情况未见相关报道,有关复方血栓通胶囊治疗糖尿病眼病和肾病的物质基础研究较薄弱,前期研究结果显示复方血栓通胶囊进入体内的主要为三七皂苷类成分,故三七皂苷类成分为研究的重点关注对象 二维线性离子阱,LTQ,-Orbitrap是一种新型质谱仪,具有很高的灵敏度和分辨率,能够提供高精度的质量数,从而得到可能的元素组成信息,能够获得化合物丰富的多级质 谱信息从而利于化合物的结构鉴定[7-8],同时,母离子列,parent ion list, PIL,以及选择离子监测,select ion monitoring, SIM,检测方式结合数据依赖性扫描,可以辅助达到目标化合物以及微量/痕量成分快速检测的目的[9]。无论是常规化合物鉴定还是要求更为严格的复杂体系中痕量物质的分析,该质谱系统优越的检测性能使之在各个领域得到迅速应用[10-11] 为了进一步阐释复方血栓通胶囊治疗DR和DN的物质基础,本研究运用高分辨液质联用技术HPLC LTQ-Orbitrap 鉴定给予复方血栓通胶囊后比格犬眼球和肾脏中的三七皂苷类成分。 1 材料 结合型傅立叶变换高分辨质谱 Thermo-Fisher LTQ-Orbitrap XL,Thermo Fisher Scientific, USA,,配有Accela 600 pump HPLC液相系统,Thermo, USA, 复方血栓通胶囊,批号150421,购自广东众生药业股份有限公司,原人参三醇,,型皂苷,人参皂苷Re,MUST-15031711,,Rg1,MUST-16022407,,Rg2,MUST-14040919,,Rh1 ,MUST-15052717,,三七皂苷R1,MUST-16041806,, R2,原人参二醇,PPD,型皂苷,人参皂苷Rg3,批号MUST-15082211,,Rb1,MUST-16021907,,F2,批号MUST-16032202,,Rh2,MUST-14031112,,Rd,MUST-16012503,,七叶胆皂 苷??,MUST-16040617,,均购自成都曼斯特生物科技有限公司 色谱级甲醇和乙腈购自Fisher科技,美国,有限公司,质谱级甲酸购自Sigma化学有限公司 2 方法 2.1 溶液的制备 复方血栓通胶囊混悬液的制备,复方血栓通胶囊去壳,称取药物粉末,配制成质量浓度约为0.25 g?mL-1的0.5%羧甲基纤维素钠混悬溶液,备用 对照品溶液的制备,精密称取三七皂苷类对照品适量,用甲醇定容,配制成一定浓度的混标溶液 2.2 动物给药和生物样品的采集 雄性比格犬,2只,每只重10 kg左右,购自北京市沙河通利试验动物养殖场 健康雄性比格犬2只,随机分为空白组和给药组,给药前禁食12 h,不禁水,。按照4 mL?kg-1,即1 g?kg-1,给比格犬灌胃,每日1次,连续给药3 d,于第3天给药后2 h注射戊巴比妥钠溶液处死,取眼球和肾脏,用生理盐水清洗干净,于-80 ?冰箱保存 2.3 生物样品的前处理 取给药犬眼球,称重,除去外膜,加入2倍量生理盐水,匀浆机充分搅碎,取匀浆液2 mL,加入3倍量甲醇,涡旋1 min,12 000 r?min-1离心15 min,取上清液室温下氮气吹干,残渣用200 μL甲醇-水,5?1,复溶,进样 10 μL,进行 LC-MS/MS 分析。空白眼球、肾脏 前处理同给药眼球 2.4 液质条件 色谱条件,采用 XBridge C18色谱柱,4.6 mm×150 mm,5 μm,,联有Phenomenex C18预柱,0.3 mm×4 mm,5 μm,,流动相 A 为乙腈,B 为 0.1%甲酸水,梯度洗脱,0,10 min,20%,22%A,10,15 min,22%A,15,18 min,22%,31%A,18,30 min,31%,32%A,30,35 min,32%,63%A,35,40 min,63%A,40,45 min,63%,83%A,,流速 1.0 mL?min-1,柱温为室温 质谱条件,ESI 源,负离子模式,毛细管温度 350 ?,鞘气流速 30单位,辅助气流速 10单位,喷雾电压3 kV,毛细管电压-35 V,管透镜电压-110 V,样品先进行全扫描,分辨率 R 设为3万,扫描范围 m/z 100,1 500,二级和三级质谱采用动态数据依赖性扫描,data dependent scan,DDS,,选取上一级丰度前三强的峰进行碰撞诱导解离,CID,碎片扫描,以离子阱打拿极,dynode, 检测 2.5 数据处理 高分辨数据处理软件,用 QualBrowser of Xcalibur 2.1 ,Thermo Fisher Scientific ,。该软件可进行化合物的提取鉴定,EIC,,元素组成预测误差在5 3 结果与讨论 3.1 三七皂苷对照品HPLC-MS规律分析 在流动相中含有0.1%甲酸、负离子条件下,三七皂苷类成分主要以[M+COOH]-和[M-H]-2种离子形式存在,其中 [M-H]-的响应 强度一般较低 在二级质谱中,三七皂苷类成分主要经过CID裂解产生脱去糖基后的碎片离子和皂苷苷元,人参三醇苷元和人参二醇苷元,的碎片离子。糖基主要有葡萄糖,m/z162,、鼠李糖,m/z146,、阿拉伯糖,m/z132,、木糖,m/z132,,二醇型皂苷常产生的共同碎片离子有m/z621 ,C42H71O13-,苷元+C6H10O5-H-,、459,C30H51O3-,苷元-H-, 和375,C24H39O3-,苷元-C6H12-H-,,三醇型皂苷常产生的共同碎片离子有m/z637,C36H61O9-,苷元+C6H10O5-H-,、475,C30H51O4-苷元-H-,和391,C24H39O4-, 苷元-C6H12-H-,。根据以上特征,能更好更快的鉴定三七皂苷类成分。 3.2 三七皂苷类成分的鉴定 结合3.1项下皂苷特点,通过化合物的精确相对分子质量、二级碎片信息以及保留时间,与对照品或者文献比对,对化合物进行鉴定,鉴定结果图1,2和表1 化合物M3,tR8.6 min,,该化合物的加合离子峰m/z977.528 0 [M+COOH]-,准分子离子峰m/z 931.521 7 [M-H]-,通过数据处理软件推测其分子式为C55H93O25。该化合物二级碎片离子m/z637,475,391为PPT型皂苷产物离子,推测该化合物为三七皂苷类成分。其二级碎片主要通过丢失糖基产生,m/z799.53为m/z931.53丢失1个木糖基,m/z132,的离子[M-H-Xyl]-,m/z769.43为m/z931.53 丢失1个葡萄糖基,m/z162,的离子[M-H-Glc]-,m/z637.43为m/z769.43丢失1个木糖基,m/z132,或m/z799.53丢失1个葡萄糖基,m/z162,的离子[M-H-Xyl-Glc]-,m/z475.46为m/z637.43丢失1个葡萄糖基,m/z162,的离子,[M-H-Xyl-Glc]-,,m/z391.31为m/z475.46进一步丢失C-20位连接的脂肪链所得的离子[M-H-Xyl-2Glc-84]-。与对照品三七皂苷R1的精确相对分子质量、保留时间以及二级碎片信息一致,故确认该化合物为三七皂苷R1 化合物M5,M20,M21,具有相同的加合离子峰m/z991.54 [M+COOH]-和准分子离子m/z945.54 [M-H]-,保留时间分别为11.5,33.0,33.9 min。经CID裂解,M20和M21均通过丢失糖基产生碎片离子m/z783[M-H-Glc]-和621[M-H-2Glc]-,见表1。M20和M21与对照品七叶胆皂苷??和人参皂苷Rd的精确相对分子质量、保留时间以及二级碎片信息均一致,故推测化合物M20为七叶胆皂苷??,M21为人参皂苷Rd。而化合物M5经CID裂解后,丢失一系列糖基产生碎片离子m/z783[M-H-Glc]-,637[M-H-Glc-Rha]-,475[M-H-2Glc-Rha]-, 其中m/z637,475为三醇型皂苷常见碎片离子,与M20,M21不同,与对照品人参皂苷Re精确相对分子质量、保留时间以及二级碎片信息一致,故推测化合物M5为人参皂苷Re 其余化合物皆可同样推导,其中化合物M1,M2,M6, M11,M16,M19,M23无对照品,与参考文献比对确定结构[12-15] 4 讨论 复方血栓通胶囊灌胃后,运用高效液相色谱-高分辨液质联用技术鉴定出比格犬眼球和肾脏内三七皂苷类成分分别14个和19个 由于基质效应,以及三七皂苷类成分生物利用度等影响,生物样品中三七皂苷类成分检测率较低,采用全扫描模式,无法获取低丰度皂苷的二级碎片信息。因此本研究在全扫描的基础上,加以母离子列表扫描模式,针对性的获取浓度较低化合物的二级碎片信息,对这类皂苷成分进行进一步确认 三七皂苷类成分在眼球和肾脏中主要以原型形式存在。由于血眼屏障作用,进入眼球中的三七皂苷类成分种类较少,进入眼组织的三七皂苷类成分主要为低相对分子质量皂苷,连接糖基个数主要为1,3个,极个别连接糖基个数为4个,如人参皂苷Rb1。进入肾脏中的三七皂苷类成分糖基个数主要为3,5个,有较少数连接糖基个数为1,2个,如人参皂苷F2,三七皂苷R1,肾脏中的三七皂苷类成分主要以原型形式存在,但个别皂苷为取代型皂苷,以取代形式存在,如化合物M6,M7为乙酰基取代皂苷,化合物M17,M19为丙酰基取代皂苷。这些三七皂苷类成分可能为治疗糖尿病视网膜病变和肾病的有效成分 [参考文献] [1]程莹雪. 复方血栓通胶囊治疗糖尿病视网膜病变的临 床疗效观察[J]. 中国医药, 2013,11,33,,215. 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