哺乳动物的克隆技术——哺乳动物克隆的原理、方法、影响因素及存在的问题

哺乳动物的克隆技术——哺乳动物克隆的原理、方法、影响因素及存在的问 哺乳动物的克隆技术——哺乳动物克隆的 原理、方法、影响因素及存在的问题 中国畜牧兽医2006年第33卷第l0期遗传繁育 哺乳动物的克隆技术 哺乳动物克隆的原理,方法,影响因素及存在的问题 张荣昌,岳福杰,李森远,张廷龙. (1.山东省即墨市畜牧兽医局,即墨266200;2.山东省莱阳农学院动物科技学院,青岛266109) 摘要:哺乳动物细胞克隆是2O世纪末生命科学领域最引人注目的高新技术,该技术对于优良种畜的复制,减少试验用动 物数目,动物遗传多样性保存及濒危动物挽救,转基因动物培育等方面具有重要意义.近年来克隆技术发展迅速,多种哺乳动 物相继克隆成功,但也存在克隆效率太低,克隆动物型正常而实质异常的问题.作者阐述了动物克隆的基本原理,操作方法 及其相关影响因素,提出了解决相关问题的关键. 关键词:哺乳动物克隆;核移植;重构胚胎 中图分类号:$814.8文献标识码:A文章编号:16717236(2006)10-005503 克隆一词来源于英文”clone”的音译.克隆是通 过无性形式由单个细胞产生和亲代非常相像的单个 动物后代.这里所说的单个细胞从来源上既可以是 体细胞,也可以是胚胎细胞,从年龄上看,既可以是 成年细胞,也可以是幼年或胎儿细胞. 1克隆的原理 通过核移植产生的重构胚胎能够完成整个胚胎 发育的关键,就是移入的核能够正确的进行重新编 程.目前,认为移入的核能够正确开始和进行重编程 与下列因素有密切关系. 1.1MPF的作用卵母细胞中最为重要的胞质影 响因子之一是细胞胞质中的MPF水平.MPF的活 性在卵母细胞成熟过程中的第1次和第2次减数分 裂中期最高.受精后或激活处理后,MPF水平迅速 下降. 1.2DNA的复制在1个细胞周期中所有染色体 DNA都必须进行1次而且只能是1次复制.如何协 调DNA复制并防止已复制的继续出现,现在还不是 很清楚.必须有足够的时间允许移入的核,在有丝分 裂之前启动和完成复制.复制完成的证据还只是间 接的,即以核移植胚胎以较高的比例发育到囊胚期 为标准(Bondioli等,1990). 1.3细胞骨架的作用关于重构胚的发育,除上述 PCC和DNA的复制外,用M?期卵母细胞为受体 进行的胚胎重构中还有一个极体形成的问题.在受 收稿日期:20060414 作者简介:张荣昌(1979一),男,山东人,助理兽医师,主要从事 畜禽疾病等方面研究. 通讯作者:岳福杰. 精中,极体的形成移出了一半的雌性遗传物质,所以 雌核是单倍体(Gordon等,1980).如果移入卵母细 胞的核在移植时处于G2期,重构卵将保持正确的染 色体倍数.然而,如果转入的核在移植时处在G1期 或s期,或是有丝分裂或减数分裂产生的分离不均 等,将会引起染色体异常或染色体倍数产生变化,这 样,极体形成的效应加上PCC和DNA复制的不协 调将对重构胚的整倍性,染色体结构和其进一步发 育产生非常明显的影响(Wilmut等,1997). 2动物克隆技术 2.1早期的哺乳动物克隆技术早期哺乳动物的 克隆主要通过胚胎分割,胚胎嵌合等技术得到. 2.2目前动物克隆技术目前动物克隆技术的核 心是核移植,核移植是指将胚胎细胞或体细胞的细 胞核用显微外科手术的方法移入去核的卵母细胞 中,构建成重组胚,通过体内或体外培养,胚胎移植, 产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程,又 称为动物克隆技术.根据核供体的来源不同,可将其 分为胚胎细胞克隆技术及体细胞克隆技术,主要包 括胚胎细胞核移植,胚胎干细胞核移植,胎儿成纤维 细胞核移植,体细胞核移植. 3核移植的基本技术环节 动物细胞核移植是一项复杂的生物技术,它主 要包括1组以显微操作与常规操作相结合的技术: 卵母细胞去核,供核细胞的获得和处理,供核细胞移 入受体细胞,细胞融合和激活,重组胚的体内外培养 及发育胚移入雌性受体的过程. 在细胞核移植的研究过程中,作核受体的主要 有去核受精卵与去核成熟卵母细胞2种.Willadsen 首创用去核成熟卵母细胞(M?期)作受体细胞后, ? 56?遗传繁育中国畜牧兽医2006年第33卷第1O期 得到了胚胎克隆绵羊(Prather等,1987).以后的研 究者大部分用去核成熟卵母细胞作受体,相继得到 了克隆动物.研究结果证明,处于M?期的卵母细胞 有利于供体核在重组胚中的再程序化,保证了核移 植一定的成功率.去核率越高,其重组胚发育成个体 的可能性越大.由于处于M?期的卵母细胞核不易 辨认,在操作过程中一般采用盲吸法.为了提高去核 成功率,在去核前对卵母细胞用DNA荧光染料 (Hoechst33342)进行染色处理并在荧光显微镜下操 作.目前在牛,羊的核移植中,这种方法仍被广泛采 用.用去核针(外径约20m,尖端呈3O,45度角)对 准已被固定针(前端为钝形,外径75,100m)固定 的卵母细胞中心处(Rogina等,2000),沿水平方向 穿过透明带然后慢慢接近核,利用负压将细胞核连 同少量细胞质及包裹其外的细胞膜一同吸进去核针 内(不需刺破细胞膜),并拉动去核针,这样带有少量 细胞质并由细胞膜包裹着的细胞核体便被分离或 去掉. 从哺乳动物细胞核移植发展过程看,供体细胞 核主要包括胚胎分裂球及体细胞,胚胎细胞.多莉羊 的成功,使得体细胞作为一个新的供核资源加入到 核移植的行列.与胚胎细胞相比,用体细胞作为核供 体具有明显优势,而且其应用价值远远大于胚胎细 胞作为供体核.1996年Campbell首先采用血清饥饿 法控制细胞周期,使细胞停留在GO期,从而提高了 体细胞克隆的成功率(Schnieke等,1997).Wilmut 认为该方法对多莉羊的诞生起到关键性的作用.然 而,1998年Cibelli在其研究中发现用正常细胞和饥 饿处理的细胞克隆动物的出生率相同(陈大元, 2002).由此可见,核与质的相容性是一个非常复杂 的问题. 哺乳动物融合一般采用2次连续的直流电脉冲 进行融合,然后再进一步用化学药物激活.在小鼠, 家兔的融合中发现脉冲强度为2.0,3.6k/cm,融 合时间在6O,200uses是适宜范围.但Wakayama 等用化学融合和激活在小鼠克隆上亦取得了良好结 果(曹果清等,2001).主要采用琼脂包埋后移入输卵 管内培养4,7d,发育至桑椹胚和囊胚(何兰花等, 1999),且获得了良好效果.核移植胚胎的移植与常 规胚胎移植的方法相同,将发育的重组胚移植到同 种,同期化受体的输卵管或子宫,产生克隆动物. 4影响因素 4.1卵母细胞对核移植效率的影响 4.1.1卵母细胞来源克隆牛研究中多用屠宰牛 卵巢回收卵作核受体.卵供体动物的年龄和生产状 况对重组胚的发育能力也有影响.当用经产母猪的 卵母细胞为受体时,卵裂率及囊胚率显着高于青年 母猪的卵母细胞(Teale等,1994).牛体外受精研究 也发现,卵供体动物越年轻,其体外受精胚的发育能 力受外界环境损害越大,对核移胚是否也有相似影 响,尚需进一步研究证实. 对于种间核移植,当以水牛体细胞为供体,以水 牛和黄牛IVM卵母细胞为受体进行核移植,二者在 融合率,卵裂率及囊胚发育率上均无差异.在克隆犬 的研究中发现,牛卵母细胞作受体时似乎优于犬卵 母细胞(Willadsen,1982).’ 4.1.2卵母细胞及供体细胞的胞质容量去核时 所吸除的胞质量与移入的供体细胞体积相似时有利 于重组胚的发育,把供体细胞移入含有半量胞质的 受体中时,不能发育到囊胚,但将供体细胞的胞质去 除之后,则可获得10的囊胚发育率(Rorie等, 1985).以桑椹胚卵裂球为供体进行研究,结果发现 小卵裂球比大卵裂球好. 4.1.3卵母细胞去核T?期去核较M?期 去核所获重组胚的囊胚率显着升高,且质量也更好, 这可能与T?期去核卵母细胞经历了激活和排出PB ?的选择,且所吸除胞质量较少有关(Ozil等, 1982).但T?期去核方案虽有利于SUZI重组胚的 发育,却不利于ICI重组胚的发育.采用离心去核法 所获重组胚在体外发育能力上可与显微操作去核法 所获重组胚相媲美. 4.2供体细胞对核移植效率的影响 4.2.1细胞供体动物的年龄来自不同年龄及不 同汇合程度的细胞,其细胞周期特征虽有实质差异, 但这些因素对核移胚的体外发育无影响. 4.2.2供体细胞的传代次数,组织来源兔成纤 维细胞的原代细胞较传代细胞囊胚发育率低,经细 胞周期分析,传6,12代的细胞更易进入GO,G1期, 这与传代细胞囊胚发育率高的结果相吻合(Leibo, 1988).以传至2代与18代克隆牛胎儿成纤维细胞作 供体,发现尽管囊胚发育率较低,但并无显着差异. 研究结果发现,当来自胎儿和成年动物的成纤维细 胞进行群体培养时,G1期细胞比例随时间延长而呈 线性增长,而S期细胞同比下降,这就解释了晚期传 代细胞较早期传代细胞用作供体时有更高的囊胚发 中国畜牧兽医2006年第33卷第10期遗传繁育?57? 育率的原因(Spemman,1998).但8,16代细胞较 17,32代细胞有更高的囊胚发育率,这可能是17, 32代细胞传代次数太多,细胞染色体突变累积而降 低了其支持发育的能力(Briggs等,1952). 4.3融合一激活方案目前采用的融合一激活方案 有3种:?融合前激活,即在卵母细胞与供核体细胞 融合前激活卵母细胞;?融合时激活,即在将供受体 融合的同时激活卵;?融合后激活,即在供受体融合 后数小时再激活,可延长核在受体胞质内的时间,使 重编程更彻底(McKinnell,l962). 为保证重组胚的正常染色体倍数,供体细胞和 受体可通过2种办法来协调,如用M?期去核卵(激 活前融合),则供体细胞必须处于2倍体的G1期,如 不能保证供体细胞处于G1期,则受体卵去核并应在 融合前激活(Briggs,1960). 4.4核移植方案的影响目前常用的有3种方案: ?单次核移植,即将体细胞移入去核卵母细胞内获 得重组胚;?二次核移植,即以体细胞为供核体,移 入去核卵母细胞内构成一级重组胚,在一级重组胚 发育到原核期时,再将其原核移人到弃原核的受精 卵内构成二级重组胚,这一方面避免了人工激活所 带来的不利影响,另一方面延长了核质相互作用,利 于重编程;?继代再克隆,即以体细胞克隆的卵裂球 为供体核,移入去核卵母细胞中,从而延长了供体核 在受体胞质中的曝露时间,使重编程更彻底,并增加 了核移胚后代的数量(DiBeradino等,1967). 4.5重组胚培养方案对核移植效率的影响目前 有3种体外培养系统用于哺乳动物胚胎培养:?添 加能量底物的简单盐溶液培养基,通常需添加胎牛 血清或牛血清白蛋白;?复杂组织培养基,这些培养 基的基本代谢物水平与雌性生殖道很少有同源性; ?共培养系统,即在培养系统中添加一些饲养细胞. 据认为体细胞可去除培养基中对胚胎发育不利的因 子,有利于胚胎发育.共培养系统中采用多为雌性动 物生殖系统的细胞,也有非生殖系统细胞的,如胎鼠 皮肤成纤维细胞(Smith等,1965). 5克隆技术存在的问题 5.1提高成功率动物体细胞克隆的成功率很低, 目前公认的成功率在1,3,克隆胚胎移植后的 出生率平均不到10(DiBeradino等,1971).因此, 要最大限度地利用起动物克隆技术,就要解决好成 功率问题. 5.2解决部分个体生理或免疫缺陷问题目前大 ? 多数研究发现体细胞克隆动物有半数多有严重缺陷 或是畸形,包括心脏,肺脏等器官携有罕见的缺陷, 其中许多未出生就胎死腹中,或出生后不久突然死 亡(Gurdon,l962).Hill克隆了13头牛,4头牛胎流 产,3头出生时或出生后死亡,大部分牛胎或牛仔的 肺脏畸形,心脏肥大,心室壁极薄,特大的胎盘充满 了过多羊水(Gurdon,1968).生物学家认为,克隆动 物产生畸胎,器官缺陷,猝死等问题可能与遗传”印 迹作用”受到破坏有关(Kobel等,1973).除了”印迹 作用”之外,产前及围产期死亡率增加可能与目前的 体外培养有关,因为在体外培养胚胎的卵裂球核移 植过程中也发现有类似现象. 5.3解决受体细胞质与供体细胞核周期相容性的 问题当受体细胞与供体细胞处于细胞周期同一时 间,核移植的成功率就大.克隆羊”dolly”之所以成 功,关键在于Willmut等找到了一种使供体细胞核 和受体卵母细胞更相容的方法,供体细胞核在DNA 复制时间上与受体卵母细胞基本同步(Gurdon等, 1997).目前一般认为,受体细胞质是M?期的卵母 细胞,除了S期外,其它各时期细胞均可作为核 供体. 5.4通过核移植产生的重构胚能否完成整个发育 过程的问题解决问题的关键是移入的细胞核能否 在受体细胞质的作用下正确的重新编程,使重构胚 成为全能性细胞,在适宜的环境条件下如正常胚胎 那样分裂,分化,发育形成个体(DiBradino等, 1984). 5.5减少或避免供体线粒体的带入在核移植过 程中,供体核带入一部分细胞质,于是,移核胚胎的 线粒体就成为杂合型,既有供核细胞来的,也有受体 细胞质来的,因此,核移植的克隆动物实际上是一种 遗传嵌合体.为此,应亟待解决动物克隆中这一方面 的问题,尽量减少或避免供体线粒体的带入. TheCloningTechnologyofMammal —— thePrinciple.OprationMethodsandAffectingFactorsoftheCloning andsomeKeyProblemsExistinginClone ? 58?遗传繁育中国畜牧兽医2006年第33卷第10期 黄羽肉鸡IGF一1基因单核苷酸多态性 与生长性状的相关研究 沈华,王金玉 (扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009) 摘要:本试验将类胰岛素生长因子1(IGF一1)作为研究肉鸡生长的候选基因,以海门京海集团的第二世代黄羽肉鸡为试验 材料,根据鸡IGF一1基因DNA序列引物,采用PCR—SSCP方法进行SNP和基因型分析,探讨IGF一1基因多态性与鸡 生长性状之间的关系.于IGF一1基因外显子1上发现一处突变.这个突变产生的不同基因型与鸡生长性状进行的统计分析结 果表明,个体的1日龄初生重,4周龄,12周龄及300日龄成年体重在 不同基因型之间均存在显着差异(P<O.05).AA基因型 1日龄初生重,4周龄,8周龄及300日龄成年体重均显着高于BB基因型个体(P<O.05).推测可以将IGF一1基因应用于鸡生长 的标记辅助选择育种实践. 关键词:黄羽肉鸡;IGF一1基因;SSCP;体重 中图分类号:$831.2文献标识码:A文章编号:1671—7236(2006)10-0058—03 我国是世界第一养鸡大国,也是优质鸡的主要发 源地,蕴藏着极其丰富的优良鸡种资源,在国内外拥 有广阔的现实市场和潜在市场.黄羽肉鸡是我国地方 优势品种,又叫土种鸡,三黄鸡,也称为草鸡,柴鸡,童 子鸡.黄羽肉鸡概念中的”三黄”特征通常是指黄羽, 黄脚,黄皮,故俗称”三黄鸡”.具体地讲,黄鸡还应具 备皮薄肉嫩,骨细而软,脂肪分布均匀,食之味美,嫩, 滑等特点.优质黄羽肉鸡是由一些地方黄羽土鸡经过 多年纯化,并与引进的生长速度快的肉鸡品系杂交配 套选育出来的,其生产性能特别是生长速度有所提 高,体质外型毛色趋于一致.这些鸡种既保留了原有 地方黄羽土鸡的肉质风味,又兼备较高的产肉性能, 越来越受消费者欢迎(黄启忠等,2003). 收稿日期:2006—04—11 胰岛素样生长因子(IGFs)是体内重要的生长 因子,它对组织细胞的增殖,分化,凋亡,机体的生长 发育起重要的调节作用(陈照丽,2003).IGFs只有 在游离状态才具有生物活性(Kelly等,2002),其生 物学效应由胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin— likegrowthfactorbindingprotein,IGFBP)调控. 胰岛素样生长因子1(IGF一1)是胰岛素家族成员之 一 ,其主要作用是促进细胞增殖,分化,是促进动物 生长发育的重要生长因子(欧阳建华等,2003).鸡的 IGFs是由70个氨基酸残基组成的单链碱性多肽, 分子量约为76kD.IGF一1基因位于鸡1号染色体 上,包括4个外显子和3个内含子(孙汉等,2003). 本研究以163只海门京海集团第二代黄羽肉鸡 为材料,对鸡IGF一1基因第1外显子进行PCR—SSCP 分析,研究其突变与不同生长阶段体重的关系. ………,……,,……………,………………………?………,…,………… ZHANGRong—chang,YUEFu—jie,LISen—yuan,ZHANGTing—long (1.JimoBureauofHusbandryandVeterinaryinShandongProvince,Jimo266 200,China; 2.TheAnimalScienceandTechnologyCollege,LaiYangAgriculturalUnive rsity,Qingdao266109,China) Abstract:Mammaliancloningisthemostremarkablehightechniqueintheendof20centuryinlifesciencefield.itcanbe usedforduplicationofexcellentbreeders,cuttingdownthenumberofexperimentalanimals,conservationofanimalgenetic diversities,retrievaloftheendangeredspecies,makingtransgenicanimalseta1.CloningtechniquehasdevelopedrapidlySO far,althoughmanymammalianspecieshavebeenclonedfromadultsomaticcells,theefficiencyisstillverylow,theoffspring areaberrantwithnormalsurface.andSOon.Thisarticlegivesthebasicalprincipleofthecloning,oprationmethodsand affectingfactorsandsomeproblemsexistinginmammalianclonehavebeenanaIoped. Keywords:mammalianclone;nucleartransfer;reconstructedembryo