遗传球形红细胞增多症红细胞膜力学特性研究

遗传球形红细胞增多症红细胞膜力学特性研究 () Vol . 22 1999 年 7 月自然科学版重庆大学学报 第 22 卷第 4 期 ()J ul . 1999 Journal of Chongqing UniversityNatural Science Edition () 文章编号 :1000 - 582x 19990420074 - 04 遗传球形红细胞增多症 Ξ 红细胞膜力学特性研究 宋 关 斌 , 吴 泽 志 , 龙勉 , 王翔 , 蔡 绍 皙 () 重庆大学 生物工程学院 ,重庆 400044 摘 要 : 采用微管吸吮实验技术并结合十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电 ( ( ) ) 泳 SDS2PAGE等生化方法研究遗传性球形红细胞增多症 HS红细胞膜粘弹特性 及膜骨架蛋白的变化 。结果明 : HS 红细胞膜的弹性模量和正常对照组比较无明 显差异而粘性系数显著高于正常值 ,细胞粘滞性增大 ,变形能力降低 ; 在红细胞膜 骨架蛋白中 ,收缩蛋白 、带 3 蛋白和带 5 蛋白的含量低于正常细胞 ,膜骨架蛋白的 巯基含量低于正常细胞 。这一结果提示在膜骨架蛋白网络中 ,其结构和成分的完 整性在决定红细胞变形行为上起着重要作用 。 关键词 : 遗传性球形红细胞增多症 ; 红细胞膜 ; 粘弹性 ; 巯基 ; 微管吸吮技术 中图分类号 : Q66文献标识码 :A 红细胞膜骨架蛋白在支撑细胞形态 、维持细胞变形和运动方面起着重要作用 ,也是决定膜力学特性以及整个细胞流变特性的重要因素 ,其分子结构或成分上的异常均可导致红细 胞上述性质的变化 ,引起系列临床疾病 。HS 是一种重要的红细胞膜蛋白遗传性疾病 ,以溶 血 、黄疸 、脾大为主要体征 ,外周血中球形红细胞明显增多且渗透脆性增加 。患者中大多数 1 ,3 有膜骨架蛋白成分的异常 ,并且异常的程度与红细胞渗透脆性及临床严重程度有关。 为了探讨 HS 红细胞膜骨架蛋白成分和结构与其力学行为的相互关系 ,笔者以微管吸 () 吮技术 Micropipette Aspiration Technique研究了 HS 病人红细胞膜的粘弹性变化 ,并进一步以 SDS2PAGE 等生化技术研究了红细胞膜骨架蛋白组成 、巯基含量 ,以期为研究 HS 的分子病 理机制提供定量的细胞流变学依据 。 1 材料和方法 111 病例及红细胞制备 HS 患者 ,中国人民解放军第三军医大学新桥医院随诊病人 。按常规方法抽取患者静脉 血经肝素抗凝 ,加适量悬浮介质 Hanks 液 ,500,800 r/ min ,离心 5 min ,弃上清液后加 Hanks Ξ 收稿日期 :1998204222 () 基金项目 :霍英东基金资助项目 0401016 () 作者简介 :宋关斌 19682,男 ,重庆人 ,重庆大学讲师 ,硕士 。从事生物医学工程研究 。 液重复离心 3,5 次 ,取红细胞配制成 Hanks 悬液备用 。正常对照组血液由重庆市中心血站 提供 ,同前操作制成细胞悬液备用 。 112 实验方法 4 5 ) 1红细胞膜骨架蛋白的制备按张龙翔等的方法,蛋白浓度按 Lowry 法测定 。 6 ) 2SDS2PAGE 按 Laemmli 方法进行。Acr 为 BDH 产品 ,Bis 为 Fluka 产品 ,其它试剂均 为国产分析纯 。电泳时令 HS 与正常对照组的样品浓度与点样体积的乘积相等 , 凝胶用 1602光密度扫描仪在 540 nm 处扫描 ,测量 HS 红细胞膜骨架蛋白的变化 。 7 ) 3膜骨架蛋白巯基含量测定按 Takeo 等的方法 ,巯基含量以 nmol/ mg 蛋白质表示 。 ) 4红细胞膜粘弹性的测量 : 采用微管吸 ( 吮实验系统 , 该系统 由 倒 置 显 微 镜 Axiovert ) (35 ,Zeiss Co ,德国、显微操作器 MR5170 ,ep2 ) (pendorf Co ,德国、图象处理仪 Vidas 21 , Kon2 ) ( tron Co , 德 国 、摄 录 系 统 含 时 标 发 生 器 , ) VTG2FOR. A Co ,日本、压力控制和系统 () ( ) 本院自行设计及微管等部分组成 图 11 ( 微管 由 普 通 毛 细 波 管 在 微 管 拉 制 器 P287 , ) Sutter Ins Co ,美国上拉制而成 ,内半径 0 . 53 图 1 微管吸吮实验系统 μ,0 . 73m. 将约 0 . 5 ml 细胞悬液注入一特定 ( ) 的圆形小腔 Chamber内 ,置于倒置显微镜的载物台上 ,利用显微操作器控制微管尖部靠近 细胞表面 ,通过压力控制系统给细胞施以一定的负压以吸吮细胞 ,使红细胞膜的一小部分被 吸入微管 ,细胞在微管内的变形时间过程由电视摄录系统记录 ,通过回放到图象处理系统测 () 量细胞在微管内的变形值 。所有实验均在室温 约 25 ?下 4 h 内完成 。整个系统在图象监 μ视器上的放大倍数约为 3 500 倍 ,并用 40 m 的光栅尺进行标定 。 ) 5计算与数据处理 ,参照 Chien 等的方8 ( 法 ,用 Kelvin 模型 —弹性元件和 —弹性元 ) μ 件并联拟合实验结果 。以弹性模量 和粘 η性系数表征红细胞膜的粘弹特性 ,定量比 较 HS 与正常红细胞膜的弹性参数 , 组间数 据比较用两样本均数的 t 检验 。 2 实验结果 211 HS 红细胞膜的粘弹特性 利用微管吸吮 n ———所测细胞个数 ; 实验技术定量研究 HS 红 μη ———弹性模量 ;———粘性系数细胞膜的粘弹特性 , 根据 Chien 的方法拟合 图 2 正常及 HS 病人红细胞膜的粘弹特性实验数据 ,结果见图 21 - 8 - 1 ( ) ( ×) HS 红细胞膜的弹性模量为 5 . 65 ?2 . 27×10 Nc?m ,粘性系数为 6 . 29 ?2 . 97- 9 - 1 - 8 - 1 ( () ) 10 Ns?c?m n = 23,正常红细胞的弹性模量为 5 . 36 ?0 . 56×10 Nc?m ,粘性系数为 - 9 - 1 (( ( ) ) ) 1 . 91 ?0 . 96×10 Ns?c?m n = 14,二者的弹性模量无明显差异 P < 0 . 05,而 HS 红细 胞的 ( ) 粘性系数明显升高 P < 0 . 001,说明 HS 患者红细胞的粘滞度增大 ,变形能力降低 。 () 重庆大学学报 自然科学版1999 年76 212 HS 红细胞膜骨架蛋白的变化 提取 HS 与正常红细胞膜骨架蛋白 ,经 SDS2PAGE 分 析 ,结果见图 31 从图 3 可见 , HS 红细胞膜骨架蛋白中 ,收缩蛋白 、带 3 蛋白和带 5 蛋白颜色明显浅 、淡 。电泳凝胶经光密度 扫描仪在 540 nm 处扫描 ,发现 HS 红细胞膜骨架蛋白的 收缩蛋白 、带 3 蛋白和带 5 蛋白的相对含量分别为 ((() ) ) 36 . 61 ?2 . 28% 、8 . 01 ?2 . 05%和 4 . 46 ?0 . 91% ,而 正 ((() ) 常对照组分别为 52 . 84 ?4 . 65% 、26 . 19 ?5 . 23%和 9 . ) 25 ?1 . 92% ,这一结果提示 HS 红细胞膜骨架蛋白中 收缩 ( 蛋白 、带 3 蛋白和带 5 蛋白有明显的缺乏 P < 图 3 正常及 HS 病人 红细胞膜骨架蛋白的 SDS2PAGE 图谱 ) 0 . 05. 213 HS 红细胞膜骨架蛋白的巯基含量 按 Takeo 的方法 ,所测正常红细胞膜骨架蛋白巯基 (( ) ) 含量为 152 . 05 ?10 . 32nmol/ mg 蛋白质 , HS 红细胞膜骨架蛋白巯基含量为 71 . 05 ?3 . 25 ( ( ) ) nmol/ mg 蛋白质 n = 3,明显低于正常对照组 P < 0. 05,提示其巯基发生了氧化 ,膜骨架蛋 白之间的缔合交联度增加 。 3 讨论 微管吸吮实验技术是本世纪 70 年代中末期发展起来的一种研究单个细胞或细胞对变形和粘附的重要手段 ,笔者采用该技术研究了 HS 红细胞膜的粘弹特性 ,发现其弹性模量与 正常红细胞比较无明显差别 ,但粘性系数明显高于正常值 ,细胞粘滞性增大 ,表明红细胞变 形能力降低 。HS 是一种红细胞膜骨架缺陷疾病 ,这种缺陷可能是引起膜力学特性改变的重 要原因 。迄今已发现 HS 病人红细胞膜骨架蛋白中有收缩蛋白 、带 411 蛋白和带 412 蛋白含 1 2 量缺乏和带 3 蛋白增高等缺陷,亦有报道带 3 蛋白缺乏的。我们采用 SDS2PAGE 法观察 骨架蛋白的变化 ,发现收缩蛋白 、带 3 蛋白明显缺乏 ,这一结果与文献 3 关于 HS 患者收缩 蛋白缺乏的报道基本一致 。我们还发现带 5 蛋白也有一定缺乏 ,这一结果至今未见报道过 , 尚需进一步的实验验证 。这种骨架蛋白的缺失可能造成红细胞膜表面电荷减少 ,从而使红 细胞间的粘附力增大 ,聚集性增强 ,红细胞的瘀滞造成红细胞代谢功能改变 ,变形性降低 ,故 难以通过脾脏而被其网状系统拦截 ,在脾微循环中被破坏 ,造成血管外溶血 。 为了进一步探讨引起 HS 红细胞膜力学特性及膜骨架蛋白变化的原因 ,我们研究了 HS 红细胞膜骨架蛋白巯基含量的变化 ,结果表明 :其膜骨架蛋白巯基含量低于正常细胞 。从理 论上说 ,膜骨架蛋白巯基含量是膜蛋白交联程度的一个重要生化指标 ,巯基含量减少意味着 膜骨架蛋白巯基发生氧化 ,膜骨架蛋白交联程度增加 ,这可能是膜力学特性改变的重要原 因 。但是 ,有关膜骨蛋白的巯基含量和交联度与 SDS2PAGE 图谱的关系却有待于深入研究 。 2 + 2 + 2 + HS 患者红细胞膜分子成分的异常 ,使 Ca、Mg、ATP 酶活性降低 ,造成 Ca沉积在细 胞膜 上和胞内 ,红细胞变得僵硬而粘滞 ,其粘弹性参数均应比正常值高 ,结果发现该 HS 患 者红细胞膜的弹性模量和正常红细胞比较无明显差别 ,其原因尚需进一步研究 。 目前 ,脾切除是治疗 HS 症的有效方法 ,脾切除后 ,贫血可获得永久性治愈 ,但球形红细 胞增多及红细胞脆性试验增加可持续存在 ,而且脾切除后 ,病人发生感染机会增多 ,同时可 () 能产生并发症 如再生性危象及胆结石,因此从 HS 患者的发病机制入手 ,寻找一条治疗因 膜骨架缺陷而引起的细胞形态 、分子成分 、变形能力和代谢功能异常的方法 ,可能会取得更 好疗效 。 4 结语 HS 是一种重要的红细胞膜骨架蛋白缺陷性疾病 ,其致病的原因很多 。传统的观念认为HS 主要是由于膜骨架蛋白的缺失造成 ,而本实验发现膜骨架蛋白巯基含量的减少可能也起 着重要作用 ,其具体发病机制尚需进一步研究 。 参 考 文 献 丁训结 1 实用血液病学 M 1 上海 :上海医科大学出版社 ,1992. 65,70. 1 () 邵宗鸿 1 我国临床血液学研究现状与展望 J . 中华血液学杂志 ,1995 ,16 4:171,174. 2 ( ) 方芳 1 遗传性球形红细胞增多症红细胞膜收缩蛋白的改变 J . 中华血液学杂志 ,1994 ,15 8: 409, 3 410. 张龙翔 1 生物化学实验技术和方法 M . 北京 :高等教育出版社 ,1982. 49,51. 4 LOWRY O H. 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The membrane vicoelastic properties are determined by the micropipette aspiration technique . The results show that the membrane elastic modulus of HS erythrocyte hase no remarkable difference but the viscosity is significantly higher than normal cells and the deformability of HS erythrocyte is reduced. It is discovered that spectrin ,band 3 and band 5 of HS erythrocyte are partly deficient ;the membrane thiol group s concentration of HS erythrocyte is lower than normal cells. These results suggest that the integrity of the struture and ingredient of the cytoskeleton protein networks plays an important role in deformability of erythrocvte . KEYWO RDS : hereditary spherocytosis ; erythrocyte membrane ; viscoelasticity ; thiol group s ; ()micropipette aspiration technique 责任编辑 李胜春