黄粉虫纤溶活性蛋白的酶学性质的抑癌作用的研究（可编辑）

黄粉虫纤溶活性蛋白的酶学性质的抑癌作用的研究（可编辑） 学校代号: 分类号: : 密级: 学号: 广东工业大学硕士学位论文 工学硕士 黄粉虫纤溶活性蛋白的酶学性质 和抑癌作用研究 吴艳玲 指导教师姓名、职称: 递笪丝熬援 企业导师姓名、职称: 玉 专业或领域名称: 生物化王 学生所属学院: 轻王丝王堂院 论文答辩日期: 生堇旦三旦 ?’一??????摘要 摘 要 黄粉虫富含蛋白质等多种营养成分,是一种宝贵的食用昆虫资源, 已在人类食品 上、保健品、医药和饲料等方面得到广泛应用。黄粉虫生存能力和适应能力强、生长 发育快、养殖成本低等优点,己成为当今世界上仅次子养蚕、养蜂业发展最快的养虫 业之一。已经证明从黄粉虫体内提取出一种活性蛋白,具有很好的溶血栓作用,而癌 症和心血管疾病是目前世界上两大生命杀手,希望通过迸一步研究该活性蛋白,提供 更加完善的基础实验数据,为以后找出一种高效、安全、低价的治疗药物打下基础。 本文经匀浆浸提、盐析、阴离子交换和葡聚糖凝胶过滤等方法,从黄粉虫幼虫体 内提取分离纯化出一种纤溶活性蛋白 ,,纤维平 板法显示其有很好的纤溶效果,非变性电泳证明其纯度,为单一组分,变性电泳测出 其相对分子量约为.,蛋白质浓度为.?一。 为进一步了解该酶的酶学性质,本文通过作用于种底物、和 酪蛋白,测定不同米氏常数值,其中以为底物时值为./,显 著小于为底物的值. /,而以酪蛋白为底物时测不出值。 作用于时使上的酯键断裂,表现出酯酶活力;作用于时使 上的酰胺键断裂,表现为非肽类酰胺键的酰胺酶活力;而作用于酪蛋白和纤维 蛋白时裂解肽键,表现为肽键酶活力,所以得出:的酯酶活力酰胺酶活力肽键 酶活力。模拟小肠环境,偏碱性,未被胰蛋白酶降解,可以做肠溶性制剂。 为了探讨的酶学种类,丝氨酸蛋白酶抑制剂作用于,纤维平板法 测抑制酶活性,研究结果表明浓度为/可完全抑制纤溶活性,表明 能有效抑制纤溶活性,其对的抑制作用与其浓度呈正相关。同时根据 红外光谱检测结果,表明胰蛋白酶与的结构很接近,而胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白 酶,蛋白酶活性部位在种系进化上具有严格保守性,因而初步推断也属于丝氨酸 蛋白酶。 本文还尝试性的对的抗癌作用作了初步研究,通过体外培养动物癌细胞, 法检测,结果显示,黄粉虫纤溶活性蛋白对肿瘤细胞细胞有较显著的抑制作用, 对细胞抑制作用不明显,对于癌细胞有选择性。另外,比较和抗癌药物顺铂广东工业大学硕士学位论文 对肿瘤细胞的作用效果,得出:.抗癌效果很迅速,短时间就能达到较好的抑 制肿瘤生长的效果,这是其它抗癌药物不可比拟的优势。可能两 者作用机理不一样, 还有待继续深入研究。 关键词:黄粉虫纤溶活性蛋白酶学性质米氏常数丝氨酸蛋白酶抑 癌作用 , , , . ,, , , ? ., . ’, ., ., ; . ; .; ?一. , , , .. , /,. /, ’ . . , 够;; ? : ’ , ? . . 广东工业大学硕士学位论文, / . .,, ., . ,, , ? ,. . : 目 录 目 录 摘要 ..?.?.......?.?.?.?.?..??.?..??.??.??.目 录??.?.??. 缩写. 第一章绪论.概苤??. .黄粉虫研究与利用现状..黄粉虫在国内各个领域的研究利用现 状?。 ..黄粉虫在国外各个领域的研究利用现状?。 .血栓形成机理及血栓病..血栓形成机理。 ..血栓类疾病?.. .抗血栓药物? ..抗血栓药物来源与分类??一 ..抗血栓药物的特点.纤溶酶抗肿瘤机制? .论文研究意义及主要研究内容..研究意义??。 ..研究内容 第二章 黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定??.. .实验?.. ..主要实验材料和试剂 ..主要仪器.实验方法?.. ..黄粉虫纤溶活性蛋白的分离 广东工业大学硕士学位论文 ..黄粉虫纤溶活性蛋白纯化? ..活性蛋白纯度的鉴定 ..纤溶活性的测定..黄粉虫活性蛋白分子量检测. ..样品蛋白含量的检测. .实验结果与讨论?.. ..黄粉虫纤溶活性蛋白的分离纯化? ..黄粉虫纤溶活性蛋白分子量的测定 ..黄粉虫纤溶活性蛋白中蛋白质含量测定?. .本章小结?一 第三章 黄粉虫纤溶活性蛋白的酶学性质研究.实验材料..主要 实验仪器 ..主要实验试剂 .实验方法?.. ..以作为底物测黄粉虫纤溶活性蛋刍的米氏常数? ..以作为底物测黄粉虫纤溶活性蛋刍的米氏常数. ..以酪蛋白作为底物测黄粉虫纤溶活性蛋白的米氏常数? .. 对纤溶活性的影响??. ..胰酶对的影响? ..胰酶和的红外光谱检测 .实验结果与讨论?.. ..黄粉虫纤溶活性蛋刍的紫外吸收光谱??一 ..温度和对黄粉虫纤溶活性蛋白的影响. ..以为底物测的值? ..以触为底物测的值. ..以酪蛋白为底物测的值? .. 抑制酶活性??. ..胰酶对黄粉虫纤溶活性蛋白酶的影响目 录 ..黄粉虫纤溶活性蛋白和胰蛋白酶的红外光谱图分析?. .本章小结?。 第四章黄粉虫纤溶活性蛋白对肿瘤细胞作用的研究? .. 主广东工业大学硕士学位论文..??.. ..?. .??.. ..??. .,.. . .. ... . ... .. ?。 ....? ...??...?..?.??..?.. ...? .. .?一” . ..暑詈詈昌毫詈晕昌詈昌皇詈皇詈皇暑皇詈鲁鲁暑墨置詈詈皇 詈鼍鼍詈皇詈皇詈皇詈皇詈皇詈昌詈鼍暑皇暑詈暑暑皇暑皇詈鲁皇 盲詈暑皇富暑昌暑寡昌詈鼍詈皇皇毫詈詈詈詈詈暑晕葛暑暑暑皇詈 宣宣毒昌詈詈毫皇 ..?... ’. ..? ....’? .? ..? ....’ ...??: .??.. :;..:;.... .? .... ...... ..。 。.. ... ....?...?。..?.. .广东工业大学硕士学位论文 ..?.. .. ..?.?.. ... ....。 ...?... ..??. ...... ..?. ....??.?.?..?...?..?.??.?.??.?....??.??.??. 缩写 缩写 ,??? ,.苯甲酰..精氨酸乙酯 ,一苯甲酰.精氨酸对硝基苯酰胺 ??? 盐酸盐 ,汉语化学名为一, ,,一? ,一 .二甲基噻唑...,.二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 , ,苯甲基磺酰氟 , , ,十二烷基硫酸钠 ,,,’,,’,’一四甲基乙二胺 , ,黄粉虫纤溶活性蛋白 ,,三羟甲基氨基甲烷 第一章绪论 第一章 绪论 .概述 血栓类疾病的发病率随着生活水平的提高而上升,加上近年来, 我国人口老龄化 程度日益加剧,血栓性疾病的发生率不断上升,这种增长势头在 中国还会保持相当长 的时间,因此,开发治疗血栓类疾病的药物迎合了人类健康的需要,有着重大的研究 意义和远大前景。随着人口的老龄化、心血管疾病发病率的增加,现行标准药物已经 不应适应和满足这些需求。陆续改善的新药物获准上市是一种必然趋势,所以我们也 要研究出新来源的药物,它具有较大的研究空间及开发前景。 随着医学诊断水平的不断提高以及高端诊断成像设备的迅速普及使用,被准确诊 断出乳腺癌、肺癌、胃癌及其他常见肿瘤疾病的病人数量直线上升。据统计, 年,全球新确诊的肿瘤病人多达万,而过去几年来,全球每年死于癌症的病 人高达万人以上。这一数字已与死于急性心血管病的人数非常接近。有统计资料 表明,过去年来,美国的癌症发病率已比世纪年代初提高了%,美国与中 国一样,同为世界癌症高发国。需求量增加,世界抗癌药物市场正在急速增长中。业 内人士预测:未来几年国际抗癌药物市场上的主流产品将会是蛋白质/多肽类生物工程 抗癌药物。这是因为与传统化学合成抗癌药化疗药相比而言,蛋 白质/多肽类抗癌 药对人体毒副作用较小,安全性好,病人的依从性更好。国际肿瘤药物协会专家认为, 一些类别的生物工程抗癌新药将成为今后新药开发的“重中之重,例如,反义寡核 苷类抗癌药、促进细胞凋亡的新药、蛋白质/多肽类“生长因子、甲基化药物 等。 陈雅雄【】已经成功地从黄粉虫幼虫体内提取具有较强纤溶活性的活性蛋白,这是 目前还没有研究过的新的方向,具有很大的研究空间和研究价值,本课将对此纤溶 活性蛋白酶的酶学性质和抗癌作用这两个主要方面作进一步探索性的研究,并研究该 活性蛋白酶的酶学性质和作用机理,希望做好基础研究,提供基础实验数据,为开发 出新的抗癌类蛋白药物奠定基础,服务于科学研究,服务于人类和社会。广东工业大学硕士学位论文 .黄粉虫研究与利用现状 黄粉虫 又名大黄粉虫、黄粉甲、面包虫,属昆虫纲鞘翅目拟步行 虫科粉虫的幼虫生长阶段。分布于我国各地,原是粮食、药材仓库及各种农副产品仓 库的重要害虫,由于其幼虫及蛹含有丰富的蛋白质、多种氨基酸、不饱和脂肪酸及维 生素等,可作为人类食品和保健品,是一种宝贵的食用昆虫资源。又因黄粉虫食性杂、 生存能力和适应能力强、生长发育快、养殖成本低等优点,并且体内富含几丁质、抑 菌肽和不饱和脂肪酸,在人类食品、保健品、医药等方面的利用日趋广泛,己成为当 今世界上仅次于养蚕、养蜂业发展最快的养虫业之一。 ..黄粉虫在国内各个领域的研究利用现状 ...黄粉虫在食品领域的利用现状 黄粉虫蛋白含量非常丰富,被誉为“蛋白质饲料宝库”。陈氏等【】对广州市售黄粉 虫的蛋白质总量进行测定,发现其蛋白质占干重的.%。并对黄粉虫蛋白质所含的 氨基酸进行分析,测定结果表明氨基酸种类齐全共种,且含人体所需的种必需 氨基酸以及组氨酸。其必需氨基酸含量占氨基酸总量的.%,基本达到了/ 建议的优质蛋白质,必需氨基酸应占氨基酸总量%的标准。进一步研究为解决目前 蛋白质食物来源带来新的前景,也可以用来满足人类对必需氨基 酸的需求提供了一种 营养丰富、成本低、低脂肪的优质蛋白质资源。 在此基础上,人们开始研究蛋白质的水解条件、水解率及其影响因素,旨在优化 氨基酸的提取工艺条件,以便大规模生产和满足各种需求。李氏【】用木瓜蛋白酶对水解 黄粉虫蛋白进行了研究,并对影响酶解反应的因素进行了选择和分析。最终确定的最 佳反应条件是:黄粉虫与水的重量比为:;酶用量为黄粉虫重量的.%;酶解温度 为?;酶解时间为;酶解值为.。而王文亮等【】选用胰蛋白酶水解黄粉虫 蛋白,确定最佳条件为酶用量.%、固液比:、水解温度。、水解最佳值.、 水解时间 ,并针对胰蛋白酶水解率低的问题进行了提高水解能力的探讨。上述实验 均为研究出高产率优良品质的天然氨基酸口服液提供了可靠的实验数据和打下了扎实 的工艺基础。 根据产品的状态不同,人们将黄粉虫经脱臭加工成无异常气味的氨基酸口服液、 第一章绪论 乳白色粉状冲剂、蛋白粉、胶囊和多功能饮料等。将黄粉虫蛋白与其他各种乳饮料中 所含蛋白,按一定比例进行科学搭配,使动、植物蛋白得以互补,各种氨基酸构成比 较平衡,从而提高饮料中蛋白质的生物价【】。刘世民等【】利用食物蛋白质的互补作用原 理,在面条中加入一定量的黄粉虫蛋白乳,增加了面条中蛋白质及其他营养物质的含量, 同时提高了蛋白质的生物效价,改善了面条的营养品质,也为黄粉虫开发利用开辟了新 的途径。李雨露等也探讨了添加黄粉虫蛋白浆对面包品质的影响,最终确定了其最佳 配方。 黄粉虫能够被广泛应用,不仅由于其富含蛋白质和氨基酸,还因为含有丰富的脂 肪酸,并且所含脂肪酸多为我们身体需要但不能自己合成的不饱和脂肪酸。黄粉虫蜕 皮中含大量的几丁质,研制开发昆虫几丁质也在食品领域得到广泛应用,例如可以作 为糖汁、酒类【和果汁等的澄清剂,具有很好的效果;作为食品添加剂;作为食物防 腐剂和保鲜剂,因为壳聚糖具有较强的抑菌效果。另外,黄粉虫中 人体必需的微量元 素和维生素含量很高,冯彦博【】测定了黄粉虫中、、、、、等种无 机元素和维生素、的含量,发现这种元素含量高于其它的肉类、虾类中元素的 含量,是强化食品中微量元素和维生素、含量很好的添加剂。 作为食品就不得不考虑安全性,陈彤等【 】作了较系统的研究,试验证明,黄粉虫 体内少量毒素主要来自消化道和部分腺体分泌物,加工食品时必须将其彻底排除,方 能安全食用。因此,经严格清杂技术处理和脱色脱臭处理的黄粉虫就可以做成色泽鲜 美、口感一流的安全食品。 黄粉虫作为一种食用昆虫资源,营养成分种类丰富,分布均衡,符合当今人们追 求营养、绿色和健康的理念,具有相当大的社会需求、经济价值和开发利用前景。 ...黄粉虫作为动物饲料和植物有机肥料 一些学者报道,黄粉虫作为粗饲料喂养畜禽,如鸟、蝎子、鱼、蛙、蛇等珍贵禽 畜动物,能加快生长发育,提高抗病免疫能力,降低饲料成本,提高经济效益。另外, 黄粉虫是替代鱼粉的优质蛋白饲料,其营养成分与进口优质鱼粉 相媲美,而生产成本 远远低于鱼粉。申红等【】用黄粉虫虫粉代替鱼粉饲养肉仔鸡,结果显示,肉仔鸡生长 性能与鱼粉的效果接近,但经济效益显著提高。申红掣】通过试验证实,添加黄粉虫使 鱼体粗蛋白、粗脂肪、钙、磷含量有不同程度提高,鱼体血清总蛋白提高,胆固醇降 低。查天发和付应霄【】用实验证明了黄粉虫具有改善鸡肉风味,增加鸡肉保水能力,广东工业大学硕士学位论文 延长鸡肉货架期的作用。鄢铮等【】实验证明添加黄粉虫的饲料能提高土鸡的日增重。 另有相关报道:黄粉虫作为鸡饲料添加剂,可提高鸡产蛋率%.%。 黄粉虫虫粪沙用作特种水产动物的饲料添加剂和诱食剂,可明显提高动物的消化 速率及降低饲料消耗指数,还能维持它们的基础代谢相对稳定,使毛色光亮、润滑, 病后体质恢复快,营养缺乏症大幅度下降,从而提高生长速度和繁殖率。同时,把虫 粪沙配入水中,能缓解池水发臭作用,有效地控制疾病的发生。与微生物相结合后能 活化土壤、有效改良土壤结构、增强土壤蓄水、保水能力和提高养分利用率,加上营 养全面均衡,可以直接用作植物肥料,其肥力稳定、持久、长效,也可以将虫粪沙与 农家肥、化肥混用,对其他肥料具有改性及促进肥效的作用。另外黄粉虫虫粪沙无任 何异臭味道和酸化腐败物产生,也就无蝇、蚊接近,因此,黄粉虫粪的综合作用超过 了现在所有人类养殖的畜禽粪便的作用,是生产无公害蔬菜乃至有机蔬菜、花卉园艺 生产的一种优质、高效有机肥。甘耀坤等【 】探讨了黄粉虫粪提取液对种食用菌菌丝 生长的影响,加入合适浓度的黄粉虫粪提取液,对大多数食用菌菌丝生长有明显的促 进作用,有望解决目前食用菌栽培料的原料来源不足、成本高和代价大的问题,从而 也降低食用菌的成本,为广大消费者带来更实惠的利益。 ...黄粉虫在医药和保健用品方面的应用 从黄粉虫体提取纯化的超氧化物歧化酶作为抗衰老、防皱等化妆品效果均优 于现有市场产品。为了提高提取率和纯度,相关学者不断进行各方面的探索性研 究,例如杜开书【】从黄粉虫蛹冻干粉中首次分离纯化出了,并得出蛹中的最 适值为.,最适温度在.左右。这为黄粉虫在医药领域上奠定了一定的实验理 论基础,也为黄粉虫的深层次开发利用提供了依据。 研制开发昆虫几丁质,提取抗癌药,将昆虫胶脂水解制成几丁质冲剂及口服液为 最新抗癌药。它固有的生物活性、生物相容性、生物可降解性,使其在生物医药【】、 化妆品【】等领域得到了广泛的应用。例如何学斌等【】通过体内和体外试验,表明甲壳 素具有一定的抗肿瘤作用;作为保健品,甲壳素及其衍生物能极大强化机体免疫力, 如保护消化系统,减肥、去脂、高血压防治、增强机体免疫,延缓衰老等【,还有抗 脂质氧化的作用【和防止血管再狭窄的形成【。李氏【在研究黄粉虫营养保健作用 时,也得出:黄粉虫脂肪类提取物可以提高抗疲劳能力及促进学习能力,另外黄粉虫 脂肪能提高皮肤的抗皱功能,对皮肤病有一定的治疗和缓解症状的作用。 第一章绪论 黄粉虫与绝大多数昆虫一样,具有高度的环境适应能力和防御机能,体内能产生 抑菌物质来保护自己,已有试验表明抗菌肽不仅具有广谱的抗人体致病细菌的能力, 而且具有抗真菌、病毒、原虫和锥虫的活性,对多种癌细胞及动物实体瘤也有明显的 杀伤作用,有可能成为抗生素的新来源。 目前有关黄粉虫药用功效的研究工作还不多见。随着这方面研究的加强和深入,其 保健功能和药用价值将得到充分的展示,并进一步推动昆虫在医药和保健保健用品的研 制和开发。 ...黄粉虫的其它应用 黄粉虫能噬食有机塑料并能消化和吸收,它为我们治理白色污染提供了广阔前景。 黄粉虫能以纤维素含量较高的食物为食,则表明肠道里有比较完善的纤维酶系。黄氏【】 不仅从黄粉虫体内提取出了纤维素酶,而且研究了其纤维素酶的组成及其活性,这为 后面要进行机理研究提供了可靠的基础性数据,有望成为环保材料和降解膜等的原材 料,具有成本低、来源广和活性高等特点,为环保材料、纺织和降解膜等大规模生产 上打开新的广阔市场。 抗冻蛋白最早于年在黄粉虫幼虫体内发现,目前在此领域上的研究比较深入, 人们已经很熟悉抗冻蛋白的组成、结构、性质和功能,在分子水平上成功将抗冻蛋白 进行克隆,并广泛运用到农业、食品、医学、工业、非极地鱼的保护等领域。 另外,黄粉虫是昆虫学科研、教学中昆虫生理生化、解剖学及生物、生态学等方 面的试验材料,是农药药效检测与毒性试验的良好材料。 ..黄粉虫在国外各个领域的研究利用现状 虽然没有国内养殖和研究黄粉虫的报道多,国外有许多国家也在开发利用黄粉虫, 有的还设立专门机构,进行深入的研究。最早进行研究的有法国、德国、俄罗斯和日 本。他们从主要人工饲料的研究、人工养殖技术的改进到产品的食用、药用及保健功 能的探索等,做了较多研究。这些方面已有较多的报道。近年来,有人发现不仅黄粉 虫蛋白质是优质食用蛋白质及医用蛋白质,而且在一些液体产品中加人黄粉虫蛋白质 可以防冻、抗结冰【们,幼虫体内抗冻蛋白的热滞后性随着日龄增大而增强【,可作为 寒冷地区饮料、药品、车用水箱及工业用防冻液和抗结冰剂。还有一些国家和中国一 样,将黄粉虫加工成菜肴,摆上了餐桌。有的国家以黄粉虫为原料,提取生化活性物广东工业大学硕士学位论文 质,或作为特殊药品,如干扰素等;或制作药品和保健品,在市场上畅销,如以几丁 质产品为原料的果蔬增产催熟剂、美容化妆品等。另外,他们做了很多很深入的生理 生化研究,等从消化机理方向对黄粉虫消化道结构和肠组织中含有酶的相关 性质进行了深入研究【。; ..等首次从黄粉虫中发现内生神经肽作用于马尔 皮基小管间的拮抗作用【。】;国外还有学者对黄粉虫的生殖机理【、激素调节机理【 等作了研究与探讨,为充分挖掘其作为资源昆虫的潜力和作为实验昆虫的优势提供了 参考。 .血栓形成机理及血栓病 ..血栓形成机理 血栓形成是指:在活体的心脏或血管腔内,血液发生凝固或血液中的 某些有形成分互相凝集,形成固体质块的过程,在这个过程中所 形成的固体质块被称 为血栓。人体血液中存在着相互拮抗的凝血系统和抗凝血系统即纤维蛋白溶 解系统。生理状态下,血液中的凝血因子不断地被激活,产生凝血酶,形成微量纤维 蛋白,沉着于血管内膜上,这些微量纤维蛋白又不断被激活的纤溶酶溶解,同时被激 活的凝血因子也不断地被单核吞噬系统所吞噬。上述凝血系统与纤维蛋白溶解系统动 态平衡,既保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证了血液的流体状态。血栓形成 原因,随着人年龄增长,体内纤溶系统功能逐渐降低,血液中凝血与抗凝血功能失去 平衡而出现凝血,即血栓【。 血液凝固涉及到一系列复杂的生物化学过程】,这一过程包含两个主要环节:一 是血浆中凝血酶原受到血浆和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶;二是血浆中的 纤维蛋白原肽和形成单位后自发聚合成不稳定的纤维蛋白 多聚体,不稳定的纤维蛋白多聚体在等的作用下交联成稳定纤维蛋白多聚体,这 就是血栓的主要基剧删。无论心或动脉、静脉内的血栓,其形成 过程都从血小板粘附 于内膜裸露的胶原开始。当内源性和外源性凝血途径启动后,最后产生的凝血酶将纤 维蛋白原水解,其纤维蛋白单体再聚合成纤维蛋白多聚体血纤维素.血纤维素和内皮 下的纤维连接蛋白共同使粘集的血小板堆牢固的粘附于受损内膜表面,不再离散,形 成血小板血栓。 第一章绪论 ..血栓类疾病 血栓性疾病是严重危害人类健康和生命的主要疾病之一,其致残率和死亡率较高。 较常见的有冠状动脉疾病形成血栓而引起心肌梗塞或心绞痛;脑血管疾病形 成血栓,即脑血栓中风或称为脑梗;肺动脉栓塞引起肺梗塞或急性肺原心脏病;肢体 动脉血栓形成和栓塞引起肢端疼痛或坏死;肢体静脉血栓形成引起局部水肿和疼痛; 全身的毛细血管内发生弥漫性血栓,形成播散性血管内凝血【】。这些血管疾病等都会 给人们带来痛苦,残疾以至死亡。据世界卫生组织统计,全世界每年约有万人死 于心脏病和脑猝死。流行病学研究表明,近三十年来,我国人群心血管病的患病率、 发病率及其危险因素水平呈不断上升趋势,此外血栓形成还是许多疾病发病机制中涉 及的重要病理过程,如:肾小球‘肾炎、糖尿病、小血管病变、严重烧伤中局部病变的 恶化、视网膜中央静脉栓塞,外科手术等【。因此研制、发展高效、特异、安全、副 作用小的溶血栓药物,一直是近年来全世界范围的热门课题。由于血栓的形成和存在 都与血纤维素有关,溶栓疗法则以溶解纤维蛋白多聚体血纤维素为主,这样做可以彻 底瓦解血栓,及时使血管再通,减轻脏器损伤的范围和程度,大大提高了病人的存活 率,所以此法备受关注,成为治疗血栓病的主要方法。 .抗血栓药物 ..抗血栓药物来源与分类 从作用机理上纤溶酶大体上可以分成两类:一类是纤溶酶原激活剂,如尿激酶 、葡激酶擞,其作用原理是纤溶酶原激活剂能将纤溶酶原激活为纤溶酶, 而具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶则能降解构成血栓骨架的纤 维蛋白,从而引起溶栓 的作用;另一类是纤溶酶类物质,其作用不需通过激活纤溶酶原,直接降解血块中的 纤维蛋白【】。 从来源上可以分为三大类:第一类是生理来源的抗血栓药物,包括尿激酶 和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 ? 、链 激酶、葡激酶,,、组织型纤溶酶原激活物? 和酰化纤溶酶原一链激酶复合物 广东工业大学硕士学位论文 ,等;第二类是动物性来源和微生物来源的抗 . 血栓药物,例如吸血蝙蝠唾液腺纤溶酶原激活剂,.、水蛭素、蛇毒 抗血栓药物、蚯蚓纤溶组分四、沙蚕体内提取的纤溶酶【、昆虫螳螂【。、甲虫【 和果虫黾【】等体内提取的纤溶酶和由纳豆杆菌产生的纳豆激酶等;第三类是传统中药, 如丹参具有抑制动物血小板聚集、改善微循环、防治实验性心肌缺血等作用,而由丹 参、红花、赤芍、川弓和降香等五味药物组成的复方冠心号复方在临床试验中证明 能使血液纤维蛋白溶解活性升高;中药蒲黄水浸液具有不依赖纤溶酶系统的直接溶解 纤维蛋白的作用;而传统的蔬菜大蒜、洋葱也有增强纤溶的作用。 ..抗血栓药物的特点 链激酶和尿激酶为第一代溶栓药物,有良好的溶栓效果,但是缺乏特异性,可导 致广泛的纤溶系统激活,导致抗纤溶酶缺乏,产生游离的纤溶酶,导致严重出血现 象。、.和.为第二代溶栓药物,它们主要在纤维蛋白表面激活纤溶 酶,具有纤维蛋白特异性,但是需要大剂量使用才能产生良好的溶栓效果,有潜在引 起颅内出血的危险性、价格比较贵等缺点【。 鉴于这些溶栓药物普遍存在着副反应,目前正在开发研制第三代溶栓药物,利用 基因工程和单克隆技术对第二代产品的改造,目的是提高纤维蛋白特异性和溶栓效率, 减少颅内出血的危险。比如是溶栓药阿替普酶的分子结构的突变体,据临床 试验表明,被组织认为是治疗病人症状出现的内最佳药物 之一【】;重组葡激酶的突变体,特异性高,不激活系统性纤溶,无出血危 险;、砌【 】等人克隆表达的突变体...,具有更强更快的 溶解血栓作用; 【】等构建的.嵌合体,也显示了 比尿激酶更快更高效的溶栓活性。除此之外,人们还积极开发从生物体内提取的天然 抗血栓药物,如吸血蝙蝠唾液腺纤溶酶原激活剂,.、水蛭素、蛇毒 溶栓剂、蚯蚓纤溶酶等,已开发出的药物去氨普酶,在期临床试验急性肺栓 塞病人治疗中,治疗效果好于】,该药正在进行期临床试验,有望开发成为新 的溶栓药。天然抗血栓药物具有功效高、副作用小的特点,近年来倍受广大消费者的 欢迎。 第一章绪论 .纤溶酶抗肿瘤机制 临床研究表明,血栓形成是目前癌症患者最常见的并发症和第二死亡原因, 】早就证实了恶性肿瘤与凝血、纤溶系统功能的改变有密切联系。但是发病机制较 为复杂,与血流减慢、血液高凝状态和血管壁内皮细胞损伤等因素有关,其中血液高 凝状态与肿瘤促凝活性物质生成增多、血小板活化【】和纤溶系统失衡等因素相关,这 些都可能促进血栓形成而有利于肿瘤的生长和转移。 目前许多纤溶酶不仅具有很好的纤溶效果,而且研究发现也具有一定的抗肿瘤作 用,表现出多种作用机理。蚯蚓纤溶酶作为溶栓药物已得到广泛认可,后来被 发现具有抗肿瘤作用,人们进一步探讨出其作用机理:促肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生 成和抑制肿瘤细胞的黏附与转移【】等;从地鳖虫提取的纤溶活性蛋白,不仅具 有显著的抑制血管生成作用】,而且无明显细胞毒作用,对多种肿瘤细胞有显著的抑 制效果,但不是通过直接杀伤肿瘤细胞,这可能与其纤溶酶活性有关,与纤溶酶能抑 。。 制肿瘤血管生成关系密切 有关研究表明纤溶活性蛋白酶及其活性产物,可大量降解肿瘤细胞外基质,使肿 瘤细胞丧失生存的环境基础,而导致肿瘤组织自身的降解,也不利于肿瘤的侵袭转移 【。纤溶活性组分具有抑制内皮细胞增生的作用,从而阻碍肿瘤血管的形成,起到不 利于肿瘤转移灶建立的作用。 .论文研究意义及主要研究内容 ..研究意义 有统计,在我国死亡原因排前三位的分别是:肿瘤、心脑血管疾病和糖尿病。血 栓性疾病的发生率不断上升,这种增长势头在中国还会保持相当长的时间,现行标准 药物已经不再适应和满足以往需求,因此,开发治疗血栓类疾病的药物符合了人类健 康的需要,有着重大的研究意义和远大前景。“癌症已成为一个全球性公共健康问题,” 中国抗癌协会理事长郝希山院士曾说。据统计,全球目前每例死亡案例中就 有一例与癌症相关,如此下去,那么在年内,全球因癌症而死亡的人口将由现在的 万剧增到万。寻找新型的安全、有效和可行性的抗癌药物也是当务之急。 广东大学硕士学位论文 目前,临床上用于溶血栓的常用药物有尿激酶和链激酶、重组织型纤溶酶原激活 剂等,但这些药物尚存在稳定性差、药效短、导致出血和成本高等缺点。研究的动物 来源溶栓酶主要是蚓激酶和蛇毒纤溶酶,蛇毒的来源较少,并且 从蛇毒中提取纯化出 的天然蛋白药物,体外稳定性差,对于人体是一种异源蛋白,具有免疫原性、半衰期 短等缺点。近年来,从雌地鳖、福寿螺、单环刺蜢、沙蚕等体内,杭州虻腹部匀浆液 中分离纯化到了纤溶活性蛋白。相比之下,这些酶的资源同样受到局限。而昆虫和海 洋无脊椎动物资源丰富,且可望通过人工方法进行规模化养殖,减少投资风险,并且 缩短开发的时间,提高可行性,更利于实现规模化生产。 黄粉虫抗病力强、耐粗养、生长发育快、易繁殖、易于大规模养殖,且价格低, 其体内含有丰富的蛋白质,目前己成为当今世界上仅次于养蚕、养蜂业发展最快的养 虫业之一。我们已经成功地从黄粉虫幼虫体内提取出具有较强纤溶活性的活性蛋白, 不仅溶血栓效果好,无出血现象,而且有显著的生血管生成作用和体外抑制肿瘤细胞 生长作用,这是一种新的昆虫来源,目前国内外尚未有报道,具有很大的研究空间和 利用价值,用它来规模化生产低成本高活性蛋白酶,开发新型溶血栓药物和抗癌药物 具有深远的意义。 ..研究内容 本课题实验以黄粉虫幼虫为原料,匀浆。浸提过夜后,采用硫酸铵分段盐析 .柱等方法,从黄粉虫体内分离纯化出黄粉 法经.纤维素柱和 虫纤溶活性蛋白酶,对其纤溶活性、纯度、分子量和蛋白含量等性质的测 定;选择不同底物,通过动力学实验测量的米氏常数值,找出其最佳底物; 丝氨酸蛋白酶抑制剂对纤溶活性的抑制作用,胰蛋白酶与之间的作用 和红外光谱分析比较,对酶学种类的初步鉴定;还研究了对哺乳动物癌细 胞和的体外抑制作用。通过各项实验,本课题研究了黄粉虫纤溶活性蛋白 的纤溶作用、酶学性质和抗癌作用。 第二章黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定 第二章 黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定 .实验材料 ..主要实验材料和试剂 黄粉虫:购自广卅越和花鸟鱼大世界,由韩雅莉教授对其进行种 类鉴定 盐酸:分析纯,广州市东红化工厂 氢氧化钠:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 磷酸:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 磷酸氢二钠:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 磷酸二氢钠:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 硫酸铵:分析纯,天津市福晨化学试剂厂 三羟甲基氨基甲烷:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 氯化钡:分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司 聚乙二醇..:实验试剂,天津市瑞金特化学品有限公司 . 氯化钠:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 透析袋:进口 .纤维素:生化试剂,美国沃特曼公司,广东省汕头市西陇化工厂 分装 .葡聚糖凝胶:生化试剂,北京鼎国生物技术有限责任公司 牛血纤维蛋白原:,广州宽林仪器科技有限公司 凝血酶:,广州宽林仪器科技有限公司 尿激酶生化试剂,中国药品生物制品检定所 牛血清蛋白组分五:冻干粉,北京鼎国生物技术有限责任公司 丙烯酰胺:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 ’.亚甲基双丙烯酰胺:分析纯,天津市富晨化学试剂厂 过硫酸铵:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 甘氨酸:分析纯,北京鼎国生物技术有限责任公司 甘油:广州市度特化工有限公司广东工业大学硕士学位论文 十二烷基硫酸钠:分析纯,天津市瑞金特化学品有限公司 无水硫酸钠:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 丙三醇:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 ’ 无水乙醇:分析纯,天津市富宇精细化工有限公司 甲醇:分析纯,天津市富宇精细化工有限公司 考马斯亮蓝 ,北京鼎国生物技术有限责任公司 .. : 冰乙酸:分析纯,天津市大茂化学试剂厂 ?指示剂,天津市大茂化学试剂厂 溴酚蓝 ..主要仪器 组织捣碎机:佛山市顺德区方胜电器实业有限公司 .型恒温磁力搅拌器:上海雷磁新泾仪器有限公司 梅特勒.托利多 计:梅特勒.托利多仪器上海有限公司 低速离心机:科大创新股份有限公司中佳分公司 电子分析天平:梅特勒.上海 .高速冷冻离心机:科大创新股份有限公司中佳分公司 . .架盘药物天平:上海精科天平 型电热恒温鼓风干燥箱:上海一恒科技有限公司 .梯度混合器:上海沪西分析仪器厂有限公司 .恒流泵:上海沪西分析仪器厂有限公司 .自动部分收集器:上海沪西分析仪器厂有限公司 .紫外检测仪:上海沪西分析仪器厂有限公司 小型台式仪:上海自动化仪表三厂 真空冷冻干燥机:美国 紫外.可见分光光度计:北京第二光学仪器有限公司 .双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司 .培养箱:上海瑞丰仪器仪表有限公司 电热恒温水浴锅:上海博泰实验设备有限公司 第二章黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定 .电泳槽:北京市六一仪器厂 型电泳仪:北京市六一化工厂 脱色摇床:北京德天佑科技发展有限公司 自动双重纯水蒸馏器:上海建强玻璃仪器有限公司 型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司 .实验方法 ..黄粉虫纤溶活性蛋白的分离 取新鲜黄粉虫幼虫,洗净,加入倍黄粉虫重量体积的.,。预冷 .?磷酸钠缓冲液,玻璃匀浆器匀浆,置。冰箱浸提过夜。双层纱布过滤 掉上层残渣,平衡好后置高速冷冻离心机。 ?,离心分钟,去沉淀,合 并上清液。采用溶液饱和度的方法,在上清液中加固体硫酸铵至终浓度 %饱和度,?冰箱静置半个小时后,。 ?离心分钟,收集上清液。在上清液中加固体硫酸铵至终浓度%饱和度,?冰箱静置半个小时后,? 离心分钟,收集沉淀,再用少量缓冲液复溶,即得黄粉虫蛋白%%粗提液, 合并上清液。将粗提液装入预先处理好的透析袋中,先用双蒸水?透析小时, 后用.缓冲液进行透析,中间多次换缓冲液,直到用氯化钡溶液检测不出白色 硫酸钡沉淀为止【。 ..黄粉虫纤溶活性蛋白纯化 ... .纤维素柱纯化 ..纤维素预处理:称取.纤维素浸泡溶胀小时,缓慢倾去上 层水,先加入与凝胶等体积的.? 液浸泡.小时后,去离子水多次洗涤至 中性。再用与凝胶等体积的. ?’ 液浸泡.小时后,去离子水多次洗涤至 中性。最后加入与凝胶等体积的. ?液浸泡.小时后,用去离子水多次洗 . 涤至中性。将.纤维素用. .缓冲液平衡后脱气,备用。 ?~ .装柱:层析柱清洗干净,垂直固定,检查不漏水后,将预处理好的.纤 维素连续缓慢地从上口玻璃棒引流加入层析柱中,打开出水口,使胶粒自然沉积,用 广东工业大学硕士学位论文 灯光反面照射,若出现气泡、裂痕等,必须重新装柱。 .的. ?..缓冲液上柱继续进行平衡过夜,直到流 .平衡:用 出来液体的值也为.。 .上样:将黄粉虫蛋白粗提液小心加入到层析柱中,不要破坏柱里面固体表面,以 免影响洗脱效果。 .洗脱:上样后用含?. .的. ??.缓冲液进行 的 线性梯度洗脱。 .收集:以.为一管收集洗脱液,用分光光度计测的蛋白吸收值,合 并活性峰各管,纤维平板法检测各个活性峰纤溶活性。 ... .葡聚糖凝胶纯化 .葡聚糖凝胶再次纯化黄粉 用 虫蛋白提取液,具体如下: .葡聚糖凝胶烧杯中,加入蒸馏水于室温溶涨 .凝胶制备:称适量 分钟或?溶涨分钟,用倾泻法除去影响流速的细颗粒; .装柱:将内径.、长的层析柱垂直固定,将溶涨好的凝胶连续缓慢 地从 上口加入层析柱中,打开出水口,使胶粒自然沉积,用灯光反面照 射,若出现气泡、 裂痕等,必须重新装柱;沉好后的柱顶覆盖圆片滤纸,避免加样冲 击柱项平面。 .平衡:用.的磷酸缓冲液平衡过夜,直到流出液体的值也为.; ?。的磷酸缓冲液溶解,将所 .加样:粗分级分离所得的沉淀用少量.的. 得溶液.小心加入层析柱中; ?。的磷酸缓冲液洗脱; .洗脱:上样后用.的. .收集:收集洗脱液,用分光光度计的蛋白吸收值,在纤维蛋白平 板法上 检测酶的活性,合并具有酶活性的各管洗脱液。 ..活性蛋白纯度的鉴定 采用常规非变性聚丙烯 ...常规非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.原理 酰胺凝胶电泳.贝定蛋白质样品的纯度,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的特第二章黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定 作用分离开,因而分辨率较高,尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分 子的生物活性,这对于生物大分子的鉴定有重要意义。在凝胶上进行两份相同样品的 电泳,电泳结束后将凝胶切成两半,一半用于活性染色,用来鉴定某个特定的生物大 分子;另一半用于所有样品的染色,对样品中各种生物大分子的种类和含量等进行分 析。.和变性.电泳在操作方法上基本相同,只是非变性聚丙烯 酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有等变性剂。 ...常规非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳操作方法 采用浓缩胶浓度为%,分离胶浓 ..甘氨酸缓冲体系对样品进行纯度测定。电泳初恒 度为%,电极缓冲液为 流,样品进分离胶调电流至,指示染料迁移至距下缘时停止电泳。 固 定液固定,换染色液染色,脱色液脱色至背景退去,条带清晰,于 凝胶成像系统 成像。固定液:取%甲醇,冰乙酸混匀;染色液:考马斯亮蓝 ., 加固定液,过滤后使用;脱色液:冰乙酸,甲醇,加蒸馏水定容至 .。 ..纤溶活性的测定 . ?. . ...溶液配制 配制: ., ., . .。牛血纤维蛋白原:用 ., .,定容至,调 . ?的.溶解,浓度?~,分装为/管,备用。牛凝血酶: 用. ?以的.溶解,浓度?一,分装为/管,备用。尿激酶 原液:用. ?以的.溶解,浓度 ?~,分装为/管,备用。 稀释后尿激酶:用. ?的.稀释尿激酶液不同倍得不同浓度的尿激 酶。考马斯亮蓝染色液:.考马斯亮蓝,甲醇,冰醋酸, 用蒸馏水定容至。脱色液:甲醇,冰醋酸,用蒸馏水定容至。 ...纤溶平板的制备 参照文献方法【】制备纤维蛋白平板,牛血纤维蛋白原、牛 凝血酶用. ,煮沸,冷却 ?的.溶解,先配制.%的琼脂糖 ?。的凝血酶 至。左右,加入事先分装好的?。的牛血纤维蛋白原及 各一管,迅速摇匀,倒入直径的培养皿中,盖上玻璃盖,静置冷却凝固大概分 钟,备用。 ...样品纤溶活性的测定 采用纤维蛋白原、凝血酶最佳的用量重新制备纤维蛋广东工业大学硕士学位论文 白凝胶板,用特别处理过的胶头滴管在板上打孔小孔直径约,注意孔间距离, 设置阴性和阳性对照组,每孔加入微升至少两个平行孔,置。培养箱保温. 后,用考马斯亮蓝染色,脱色液脱色,游标卡尺精确测量溶圈两垂直直径 及孔的直径。计算样品的纤溶圈面积,可对应表示样品的纤溶活性。以溶圈面积为纵 坐标,以标准尿激酶每毫升的活性单位数为横坐标作图。 ..黄粉虫活性蛋白分子量检测 ... .聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理 常用十二烷基硫酸钠 ,简称.聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量,其明显优点是快速 灵便、设备简单等。 在一般的电泳方法中,蛋白质的电泳迁移率主要取决于它在某下所带的净电荷 量、分子大小即分子量和形状的差异性,而?电泳对大多数蛋白质而言, 主要取决于它们的分子量,而与原有的电荷量和形状无关。 是一种阴离子表面活性剂,在一定的条件下,它能打开蛋白质氢键和疏水键, 并按某种比例每克蛋白质一般结合.克结合到这些蛋白质分子上形成带负 电荷的蛋白质.复合物。与蛋白质的定比结合使蛋白质一复合物均带上相 同的负电荷,其量远远超过蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了蛋白质问原有的电荷量 差异。并且在水溶液中,蛋白质.复合物具有相同的构象,均为近似雪茄烟形的长 椭圆棒短轴均为.,长轴则随蛋白质的分子量成正比变化,因而克服了蛋白质 间原有的形状差异。故蛋白质.复合物在凝胶中的迁移率与原有 电荷量和形状基本 上没有关系,而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质分子量与电泳 迁移率间的关系可用 下式表示: ?? 式中 为分子量;为常数;为斜率:为迁移率。 因此,用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分 子量标准蛋白质 的迁移率图中的位置,就能得知待测蛋白质的分子量。 ...实验溶液的配制 .将丙烯酰胺和双丙烯酰胺加蒸馏水至配制成%丙烯酰胺贮存 液,做好保护措施,通风柜中搅拌至完全溶解; 第二章黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定 .配制. ..分离胶缓冲液和. .浓缩胶缓 冲液; .将 配制成%的过硫酸铵,现配现用; 过硫酸铵加入蒸馏水定容至 .将 加入蒸馏水定容至 配制成%; .分别将 , 甘氨酸和 溶解于蒸馏水中并调值到., 最后定容到 配制成×?电泳缓冲液; .将巯基乙醇,%,.溴酚蓝和甘油分别加入最后加 蒸馏水定容到 配制成凝胶上样缓冲液; .分别加入考马斯亮蓝一 .,甲醇和乙酸最后加蒸馏水定容到 配制成聚丙烯酰胺凝胶染色液; .分别加入甲醇和乙酸最后加蒸馏水定容到配制成聚丙烯 酰胺凝胶脱色液; .分离胶配制: 按表.中各试液的量配制浓度为%的分离胶。 表分离胶配制 .. 浓度 % . . %丙烯酰胺 . 分离胶缓冲液. % 儿 %的过硫酸铵 此 .浓缩胶配制: 按表.中各试液量配制浓度为%浓缩胶。 表浓缩胶配制 .浓度 % . 广东工业大学硕士学位论文 吐 %丙烯酰胺 砒 分离胶缓冲液. 也 % 匣 儿 吨 %的过硫酸铵 茹蚍 ....实验过程 .洗板:将洗洁精用温水稀释后,浸透海绵小心擦洗玻板,然后用 自来水多次冲洗, 最后用酒精将板擦干或者自然晾干; .安装制胶板:制胶前将玻板与塑料嵌条和凹型陶瓷板的边缘对齐,下沿用琼脂封 口,用铁夹子将两端夹紧,安放在固定架上,注意要确保密封,否则重新封胶; .分离胶制备:将制胶板垂直放好,插上与相应厚度的样品梳,在梳子下缘线 处做标记,卸下样品梳。将配好的分离胶溶液缓慢加入制胶板之间,直至液面达到标 记处。用滴管贴近胶液界面小心而又缓慢地覆盖厚度约.的双蒸水,以防止溶液 蒸发并保证胶面平整,还能去气泡; .浓缩胶制备:分离胶聚合后,倒去双蒸水,用滤纸吸去残液。插入样品梳,用滴 管将浓缩胶溶液加在分离胶面上,充满制胶板; .安装电泳槽:浓缩胶聚合后,除去梳子、密封胶带以及铁夹。将制胶扳、电泳糟 内芯、另一对制胶板依次放入槽内。两制胶板的凹型陶瓷板均应与电泳槽内芯接触。 然后插入楔型板以固定两套制胶板。如果每次电泳只用一块胶板,必须用提供的有机 玻璃板代替另一套制胶板; .加样:在内外水槽加注缓冲液,使内外槽的水位均超过凹形板的缺口但低于塑料 板的上沿。用微量加样器在梳井内加样; .电泳:盖好上盖,在的电压下电泳约,至溴酚蓝指示的电泳前沿 到达制胶板的下缘止,关掉电源。然后拔掉楔形板,取下制胶扳; .染色、脱色:用刀片或薄板将白塑料板与陶瓷板轻轻撬开,用刀片沿分离胶与浓 缩胶的交接处,将分离胶切下,并在分离胶的左上角切掉角,以标记样品顺序。 然后手戴橡胶手套将分离胶小心移入染色器皿中。在染色器皿中加入考马氏亮 蓝染液,加盖,在摇床上染色;将染液倒回贮存瓶可反复使用。在染色皿中加入 脱色液%乙酸,%乙醇,振荡脱色至蛋白条带清晰。 第二章黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定 ..样品蛋白含量的检测 ...考马斯亮蓝.法测定蛋白质含量的原理 考马斯亮蓝. .是一种甲基取代的三苯基甲烷,分子中磺酸基的蓝色染料,在处有最大 吸收值。考马斯亮监.能与蛋白质、多肽通过范德华力相互作用 形成蛋白质多肽. 考马斯亮蓝复合物蓝色溶液,引起该染料的最大吸收的位置发生红移,在 处有最大吸收值。由于蛋白质多肽考马斯亮蓝复合物在处的光吸收远高于考 马斯亮蓝在处的光吸收,因此,可大大地提高蛋白质、多肽的测定灵敏度。蛋 白质多肽.考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质多肽的浓度成正比,故可用比 色法进行定量分析。由于考马斯亮蓝染色仅在内稳定,所以要求在实际操作时, 最好在临加入比色皿之前加入亮蓝,这样可以避免由于时间因素导致的错误结果。考 马斯亮蓝稀释液容易被光破坏,所以必须现配现用。 . ...实验溶液的配制 .牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取牛血清白蛋白,溶于蒸 馏水中,即为.?。的原液。 .蛋白试剂考马斯亮蓝.的配制:称取考马斯亮蓝.,溶于 %乙醇中,加入%/的磷酸,最后用蒸馏水定容到。此溶液 在常温下可放置一个月。 ...标准曲线制作 取支洁净具塞试管,按表.加入试剂,盖塞后, 将各试 管中溶液纵向倒转混合,放置后用光经的比色杯在波长下比色,记 录各管测定的光密度吣,以咖为纵坐标,标准蛋白质浓度为横坐标,绘制标准 曲线。 ...样品中蛋白质含量的测定 另取支具塞试管,各准确加入.样品提取 液、.蒸馏水和考马斯亮蓝.试剂,充分混合,放置后,以标准 曲线做参比,在波长下比色,重复三次,记录吸光度。根据下列计算样品 蛋白质含量。 提取液总体积 ,, 样蹯白质含量眦髓卜二鬻篓竽 广东工业大学硕士学位论文 式中:为在标准曲线上查得的蛋白质含量。 .实验结果与讨论 ..黄粉虫纤溶活性蛋白的分离纯化 ... .纤维素柱纯化结果 ‘ .的 黄粉虫粗提物上.纤维素柱.×预先用. ?。 .缓冲液平衡过夜,用含?’ 的. .的%. 缓冲液进行线性梯度洗脱,流速.?,每管收集,共收集管,如图. 所示,图中三个组分记为峰、峰和峰。 图黄粉虫纤溶活性蛋白.纤维素柱层析 .经检测,如图.,峰和峰溶圈很小,几乎没有纤溶活性,从而确定 这两个峰 是杂峰,而峰在纤维平板上有很大很清晰的溶圈,与 .’浓度的尿 激酶的活 性相当,可见峰有很强的纤溶活性,是纤溶活性峰。第二章黄粉虫 活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定 峰 峰? . 峰扣 尿激酶一 图样品过.纤维素柱后纤溶平板图 . ... .葡聚糖凝胶纯化结果 .葡聚糖凝胶柱, 将经.纤维素柱纯化后的纤溶活性峰再过 如图.所示,得二个组分,分别标记为峰和峰。 .葡聚糖凝胶柱层析 图黄粉虫活性蛋白 .? .鲫 经纤溶活性检测,如图所示,峰具有强的纤溶活性,峰无活性,为 杂质 峰。 广东工业大学硕士学位论文 峰和 峰