鲎试剂方法检测胎盘多肽注射液中细菌内毒素

鲎试剂方法检测胎盘多肽注射液中细菌内毒素 鲎试剂方法检测胎盘多肽注射液中细菌内 毒素 第33卷第2期 2011年6月 湖北大学(自然科学版) JournalofHubeiUniversity(NaturalScience) Vo1.33No.2 Jun.,2011 文章编号:1000,2375(2011)02—0190一O3 鲎试剂方法检测胎盘多肽注射液中细菌内毒素 王宗春,张洪,姜俊勇 (武汉大学人民医院药学部,湖北武汉430060) 摘要考察采用鲎试剂方法检测胎盘多肽注射液中细菌内毒素的可行性.参照中国药典2010年版(二 部)附录?E细菌内毒素检查法,选择两个厂家生产的鲎试剂(灵敏度为0.5EU/mL),对不同稀释倍数的胎 盘多肽注射液供试品溶液进行细菌内毒素与鲎试剂之间凝集反应的干扰试验.结果显示胎盘多肽注射液经 4O倍稀释后对鲎试剂与细菌内毒素之间的凝集反应既无抑制作用,也无增强作用.因此,使用鲎试剂方法检 测胎盘多肽注射液中细菌内毒素是可行的,具有简便,快捷,可靠等优点. 关键词胎盘多肽注射液;鲎试剂;细菌内毒素;干扰试验 中图分类号R927.12文献标志码A 胎盘多肽注射液主要含有氨基酸,活性肽,脂质脂肪酸等成分,临床适用于细胞免疫功能降低或失 调引起的疾病,术后愈合,病毒性感染引起的疾病及各种原因所致的白细胞减少症.中国药典关于注射 剂热原检查方法有家兔法和细菌内毒素检查法2种,家兔法操作繁琐,费时费力,而细菌内毒素检查法 具有灵敏度高,简便易行等优点,已被广泛采用.目前尚少有胎盘多肽注射液细菌内毒素检查的报道,笔 者参照中国药典细菌内毒素检查法_1]以及《中国药品检验标准操作))2005年版],对本品细菌内毒 素检查方法进行研究. 1实验材料 1.1仪器恒温水浴箱(江苏南通嘉程仪器有限公司);微量取液器(50~250L)(上海金林生化试剂 仪器厂);SW一80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);细菌内毒素检查用具(厦门鲎试剂实验厂). 1.2药品与试剂胎盘多肽注射液(规格4mL,批号20090853,20091021,20091128,江苏正大天晴药 业股份有限公司);细菌内毒素检查用水(BET水,规格50mL,批号091107,厦门鲎试剂实验厂);细菌 内毒素工作标准品(规格10EU,批号2009—7,中国生物制品检定所);鲎试剂(TAL,规格0.1mL,批号 091149,标示灵敏度0.5EU/mL,厦门鲎试剂实验厂);鲎试剂(规格0.1mL,批号090325,标示灵敏度 0.5EU/mL,湛江安度斯生物有限公司). 2方法 2.1细菌内毒素限值(L)的确定细菌内毒素限值L=K/M~?,式中K为人每千克体重每小时最大可接 受的细菌内毒素剂量,注射剂为5EU/(kg?h);M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,按照胎盘 多肽注射液说明书用法用量,若M为0.135mL/(kg?h),则L—K/M=37.5EU/mL.由于胎盘多肽注射 液含有多肽类等稳定性较差的成分,为了严格控制热原,将本品的细菌内毒素限值 L定为20.0EU/mL. 2.2样品最大有效稀释倍数【MVD)的确定样品最大有效稀释倍数MVD=L,其中为鲎试剂灵 敏度,L为细菌内毒素限值(20.0EU/mL),目前市售鲎试剂的常为0.5,0.25,0.125,0.06,0.03 EU/mL,对应的样品MVD为4O,8O,160,320,640倍. 收稿日期:2010—11—12 基金项目:湖北省科技厅科技攻关项目(2002AA301C13)资助 作者简介:王宗春(1967一),男,博士,副主任药师,E—mail;W—zongchun@163.corn 第2期王宗春等:鲎试剂方法检测胎盘多肽注射液中细菌内毒素 2.3鲎试剂灵敏度复核将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解,在旋涡混合器上混匀15rain,然后 稀释成2.0,1.0,0.5,0.252(灵敏度标示值)4个浓度等级,按《中国药典)>2010年版二部附录XIE细菌 内毒素检查法l_】]进行灵敏度复核试验. 2.4干扰初筛试验用BET水将胎盘多肽注射液分别稀释至40,80,160,320,640倍的系列溶液,作为供 试品阴性对照(NPC)系列.另制备同样倍数的供试品系列溶液,使每一稀释度的供试品溶液中都含有2A(A 为0.5Eu/mL)细菌内毒素,作为供试品阳性对照(PPC)系列.每一供试品浓度重复2管,按常规设立阳性 对照(Pc)管和阴性对照(NC)管.用为0.5EU/mL的鲎试剂与上述系列溶液按药典方法进行反应. 2.5干扰确证试验口根据干扰初筛试验结果,用供试品40倍稀释溶液及BET水分别稀释细菌内 毒素工作标准品,配成细菌内毒素最终浓度分别为1.0,0.5,0.25,0.125EU/mL的系列溶液,分别取 ,每个浓度0.1mL加入到已复溶的两个不同厂家生产的鲎试剂(为0.5EU/mL)管内平行做4管,另 取供试品溶液做2支阴性对照管,进行干扰试验. 2.6样品的细菌内毒素检查取3批胎盘多肽注射液(每批各取5支),配制成40倍稀释溶液,使用两 个厂家生产的鲎试剂(灵敏度均为0.5EU/mL),按中国药典_】附录细菌内毒素检查法检查. 3结果 3.1鲎试剂灵敏度复核结果1为鲎试剂灵敏度复核结果,灵敏度测定值.均在0.5,2.0A之间, 说明两个生产厂家的2批鲎试剂其灵敏度均符合要求,可用于实验. 表1鲎试剂灵敏度复核结果 3.2干扰初筛试验结果通过对胎盘多肽注射液40,8O,16O,320,640倍稀释液进行干扰初筛试验,可 以初步判断当样品稀释40,640倍时,对细菌内毒素检查无干扰现象,结果见表2. 表2胎盘多肽注射液干扰初筛试验结果 3.3干扰确证试验结果根据初筛试验结果及简化操作要求,选择胎盘多肽注射液40倍稀释液进行 干扰确证试验,结果见表3.表3结果显示E/E在0.5,2.0之间(E为用BET水制成的细菌内毒素标 准溶液反应终点浓度的几何平均值,E为用供试品溶液制成的内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平 均值),按照中国药典判断标准,供试品4O倍稀释溶液对鲎试剂与细菌内毒素之间凝集反应既无抑制作 用,也无增强现象,说明使用鲎试剂方法检查胎盘多肽注射液中细菌内毒素是可行的. 表3胎盘多肽注射液40倍稀释液干扰确证试验结果 样品批号]NCEsEE 检查用水 2009O853 20091O21 2OO91128 检查用水 20090853 20091O21 20091128 +十++++++,一一一一一一一一一0.50 +++++++++一一一一一一一一一 +++++++一一一一一一一一一一一 +++++++++一一一一一一一一一 ++++++++一一一一一一一一一一0.50 ++++++十一一一一一一一一一一一 +++++++一一一一一一一一一一一 ++++++++一一一一一一一一一一 0.42 0.6O O.42 0.84 1.2 0.84 0.601.2 0.601.2 O.501.0 192湖北大学(自然科学版)第33卷 3.4样品细菌内毒素检查结果3批样品经稀释40倍后,依中国药典细菌内毒素检 查均符合规定. 4讨论 注射剂质量控制中,采用家兔法控制热原时操作复杂,影响因素多,而且费时;鲎试 剂法具有操作简 单,灵敏度高,重复性好,实验性强等优点. 干扰初筛试验的目的是初步筛选出对检查无干扰的样品稀释倍数范围及相应的 鲎试剂灵敏度,最 终要经干扰确证试验验证,从表2结果初步判断样品40,640倍稀释液对细菌内毒素检查无干扰作用. 理论上可选择样品40,80,160,320,640倍稀释液中的任一溶液,采用相应灵敏度的鲎试剂进行干扰试 验,为了简化样品的稀释操作步骤并降低对鲎试剂灵敏度要求,本试验选择稀释倍数为40,用为0.5 EU/mL的鲎试剂进行干扰确证试验. 表3干扰确证试验结果显示,3批样品经稀释4O倍后,分别使用两个不同厂家生产的鲎试剂(灵敏 度均为0.5Eu/mL)进行试验,其E/E均在0.5,2.0之间,按照中国药典口附录细菌内毒素检查干扰 试验项下的判断标准,认为样品在该稀释倍数下不干扰细菌内毒素检查. 根据实验结果,确定胎盘多肽注射液细菌内毒素检查方法如下:将本品稀释4O倍,依中国药典_1附 录细菌内毒素检查法进行检查,细菌内毒素限值定为2OEu/mI. 参考文献: [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版二部EM].北京:中国医药科技出版社,2010:附录99—102. [2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范FM].北京:中国医药科技出版社,2005:287—302. [3]祝清芬,丁勃.透明质酸钠眼内植入物细菌内毒素检查[J].中国生化药物杂志,2007,28(3):205206. [4]王宗春,陈志明,马福旺,等.薄芝糖肽注射液中细菌内毒素检测方法的研究r-J].中国生化药物杂志,2005,26(2) 105—106. [5]张义伟.细菌内毒素检查的几点体会[J].中国实用医药,2Oi0,5(3):86—87. Detectionofbacterialendotoxinsinplacentalpeptideinjectionby tachypleusamebocytelysatetest WANGZongchun,ZHANGHong,JIANGJunyong (DepartmentofPharmacy,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China) AbstractThefeasibilityfordetectingthebacterialendotoxinsinplacentalpeptideinjectionsvia tachypleusamebocytelysatetestwasinvestigatedinthispaper.Usingthetachypleusamebocytelysate withthesensitivityof0.5EU/mIproducedbytwomanufacturers,theinterferencetestwascarried outtostudytheinfluenceofsample'Sdilutiontimesonthecongregatingreactivitybetweentachypleus amebocytelysateandbacterialendotoxinsinaccordancewithappendixXIE,volumetwo,Chinese pharmacopoeia2010edition.Theresultsshowedthatthesamplehadnoinhibitiveorenhancedeffect onthecongregatingreactivitywhenitwasdiluted40times,indicatingthatthemethodoftachypleus amebocytelysatetestfordetectingthebacterialendotoxinsinplacentalpeptideinjectionsW3Ssimple, rapidandreliable. Keywordsplacentalpeptideinjection;tachypleusamebocytelysate;bacterialendotoxins; interferetest (责任编辑游俊)