过氧化物酶增殖物激活受体γPPARγ激动剂罗格列酮在血管新生和血管通透性变化中的作用

过氧化物酶增殖物激活受体γPPARγ激动剂罗格列酮在血管新生和血管通透性变化中的作用 过氧化物酶增殖物激活受体γPPARγ激动剂罗格列酮 在血管新生和血管通透性变化中的作用 过氧化物 酶增殖 物激活 受 体 γPPARγ 激 动 剂 罗格列酮 在血管 新生和 血 管通透性 变化中 的 作用 重庆大学硕士学位论文 学术学位学生姓名 : 郑? 明 指导 :王贵 学 教 授 专 业:生物 医学工 程 学科门类 : 工 学 重庆大学生物工程学院 二 O 一三 年四 月The Effect of PPARγ Ligand Rosiglitazone on Angiogenesis and Vascular PermeabilityA Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Master’s Degree of Engineering By Zheng YimingSupervised by Prof. Wang Guixue Specialty :Biomedical EngineeringCollege of Biomedical Engineering of Chongqing University, Chongqing, China April 2013重庆大学硕 士学位论 文 中文摘要 摘 要 肿 瘤 、 动脉 粥 样硬 化 和糖 尿 病视 网 膜病 变 等常伴 随 有 血管 新 生, 新 生微 血 管 通 过 给病 变 组织 提 供氧 和营 养 促进 了 上述 疾病的 发 生和 发 展 。 而且新 生微 血 管 在 结 构 和功 能 上缺 乏 完整 性, 主 要 现 为细 胞连接 和 周细 胞 缺失 以 及基 底膜 不 完 整 等 病 理特 征 , 与 血 管通 透性 增 加密 切 相关 。高通 透 性血 管 有利 于 肿瘤 细胞 和 炎 症 细 胞 的浸 润 以及 促 血管 生成 因 子的 生 成和 局部聚 集 ,是 进 一步 恶 化疾 病的 重 要 因 素 , 因此 , 抑制 病 理性 血管 新 生是 减 缓上 述疾病 发 生发 展 的重 要 策略 。过氧化物 酶增殖物激活受体 γPPARγ 激动剂 罗格列酮作为治疗 II 型糖尿病的有效药物,对 血 管 新生 有 显著 的 调控 作用 , 可能 成 为治 疗血管 新 生相 关 疾病 的 潜在 药物 , 但 是 目前研究对罗格列酮和血管新 生的关系存有较 大争议。另外,PPARγ 激动剂 罗格 列酮在治疗 II 型糖尿病时易造成组织水肿等与 血管通透性相关的副作用,限制了 罗 格 列酮 等 类似 药 物的 临床 应 用。 基 于此 ,本研 究 拟考 察 罗格 列 酮与 血管 新 生 和 血 管 通透 性 的关 系 ,旨 在为 罗 格列 酮 安全 有效地 用 于治 疗 血管 新 生相 关疾 病 提 供 理论指导。 主要研究结果如下: 第一部分:PPARγ 激动剂 罗格列酮对血管新生 的影响和机制 ? 结合斑马鱼在体血管新生模型、 大鼠腹主动脉环离体血管新生模型、 人脐 静脉内皮细胞HUVECs 体外血管 新生模型综 合研究了 PPARγ 激动 剂 罗格列酮 对 血管新生的影响, 结果显示罗格列酮抑制了在体、 离体和体外的血管新生, 同时, 细胞实验发现罗格列酮抑制 HUVECs 增殖和迁移 。 利用 PPARγ 拮抗剂 GW9662 预 处理阻断了罗格列酮诱导的系列效应, 表明罗格列酮作用依赖 于 PPARγ 的活化; ? 在此基础上, 通过斑马鱼全胚原位杂交和荧光定量 PCR 分析得知罗格列酮 处 理 后 斑 马 鱼 的 VEGFR2flk-1 mRNA 表 达 下 降 , 提 示 罗 格 列 酮 可 能 通 过 抑 制 VEGF/VEGFR2 信号途径发挥血管生成抑制作 用 。 另外, 通过细胞免疫荧光实验发 现罗格列酮刺激 p53 表达, 流式细胞仪检测发 现罗格列酮促进细胞凋亡, 使用 p53 抑制剂 Pifithrin-可阻断罗格列酮诱导的促细 胞凋亡、 细胞迁移抑制和血管生成抑 制作用, 表明罗格列酮与 PPARγ 结合后通过激 活 p53 信号通路促进了细胞凋亡, 从而实现对血管新生的抑制作用 。 第二部分:PPARγ 激动剂 罗格列酮对血管通透 性的影响和机制 ? 通过检测罗格列酮对小鼠背部 皮肤血管和 HUVECs 融合单层 细胞的通透 性的影响 时发现,罗格列酮刺激血管通透性增加; ? 在此基础上, 利用 VEGF ELISA 检测罗格 列酮对 HUVECs 分泌 VEGF 蛋 I 重庆大学硕 士学位论 文 中文摘要 白的影响时,发现 罗格列酮 抑制 VEGF 蛋白分 泌,表明罗格列酮增加 血管通透性 不依赖 VEGF 的促血管通透性作用。 进一步 研 究发现 PPARγ 经罗格列酮激活后可 活化 PI3K/eNOS/NO 信号通路, 重要的是, 使用 PPARγ 拮抗剂 GW9662 、 PI3K 抑 制剂 Wortmannin 和 LY294002 、eNOS 抑制剂 L-NAME 均可阻断罗格列酮 刺激的 血管通透性增加,提示 PI3K/eNOS/NO 信号通路参与调控罗格列酮诱导的血 管通 透性增加过程。 关键 词: 过氧化物酶增殖物激活受体 γ ,罗格 列酮,血管新生,血管通透 性 II 重庆大学硕 士学位论 文 英文摘要 ABSTRACT Pathological angiogenesis is a critical event associated with formation and progression of tumor, atherosclerosis and diabetic retinopathy. On the one hand, newborn microvessels promote the development of these diseases by supplementing oxgen and nutrients. On the other hand, these microvessels exhibit defective features that are closely associated with the increase of microvascular permeability. The structural and functional abnormality, commonly characterized by absence of cell junctions and base membrane as well as peripheral cells, promotes vascular permeability and results in macromolecules extravasation. Highly permeabible vessels allow infiltration of tumor cells and inflammatory cells as well as production and local accumulation of angiogenic factors, ultimately exacerbating vessel-related diseasesTherefore, angiogenesis inhibition is proposed as a promising strategy to limit these vessel-related diseases. As the effective drug in antagonizing type II diabetes, peroxisome proliferator-activated receptor γ PPARγ ligand rosiglitazone is also a significant modulator of angiogenic processes and may prove to be a potential therapeutic strategy in correcting angiogenesis-related diseases. However, studies on PPARγ and the ligand rosiglitazone yielded contradictory findings with regard to its role in angiogenesis. Additionally, treatment with rosiglitazone often causes side effects like edema that are related to increased vascular permeability. Thus, the aim of this study is to identify the angiogenic and vascular permeability response to PPARγ activation by its ligand rosiglitazone. Related knowledge could pave way to safe treatment of angiogenesis-related diseases with rosiglitazone. Resusts are shown belowChapter one: the regulatory role and mechanism of PPARγ activation by its ligand rosiglitazone in angiogenesis ? In vivo zebrafish angiogenesis model, ex vivo rat aortic ring model and in vitro human umbilical vein cells HUVECs angiogenesis model were used to investigate the effect of PPARγ ligand rosiglitazone in angiogenesis. Our data showed that activation of PPARγ by rosiglitazone inhibits in vivo, ex vivo and in vitro angiogenesis. GW9662 blocked the inhibitory effect of rosiglitazone on angiogenesis, suggesting that rosiglitazone functioned in a PPARγ-dependent manner? Whole-Mount in Situ Hybridization ISH and qPCR analysis showed that rosiglitazone treatment decreased VEGFR2flk-1 expression in zebrafish, suggesting III 重庆大学硕 士学位论 文 英文摘要 rosiglitazone may inhibit angiogenesis by downregulating VEGF/VEGFR2 signalingAdditionally, immunocytofluorescent analysis found that PPARγ activation by rosiglitazone stimulated p53 expression, accordingly, flow cytometry data showed that PPARγ activation by rosiglitazone promoted HUVECs apoptosis. In addition, p53 inhibitor Pifithrin-?blocked rosiglitazone-stimulated cell apoptosis, suggesting that PPARγ activation by rosiglitazone inhibits angiogenic processes through p53 apoptotic signalingChapter two: the regulatory role and mechanism of PPARγ activation by its ligand rosiglitazone in vascular permeability ? By Miles vascular permeability and HUVECs monolayer permeability analysis, we found that rosiglitazone increased vascular and endothelial permeability ? Then, we found that this process was independent on VEGF as analyzed by ELISA. Furthermore, we found that PPARγ activation by rosiglitazone stimulated PI3K/eNOS/NO pathway. Importantly, PPARγ antagonist GW9662, PI3K inhibitor Worthmannin and LY294002, NOS inhibitor L-NAME blocked rosiglitazone- increased vascular endothelial permeability, suggesting that PI3K/eNOS/NO was involved in rosiglitazone regulation of vascular endothelial permeability Keywords: Peroxisome proliferator-activated receptor γ PPARγ, Rosiglitazone, Angiogenesis, Vascular endothelial permeabilityIV 重庆大学硕 士学 位论 文 目 录 目 录 中文摘 要. I 英 文 摘要. III 1 绪 论 1 1.1 问题的提出及研究意义 1 1.2 病理性血管新生和血管通透性 增高的地位. 1 1.2.1 血管新 生过程. 1 1.2.2 血管新 生促进肿 瘤发生发 展. 2 1.2.3 血管新 生促进动 脉粥样硬 化斑块破 裂 3 1.2.4 血管新 生过程中 血管完整 性和通透 性的变 化 4 1.2.5 血管通 透性变化 的机制 7 1.3 过氧化物酶增殖物激活受体 γPPARγ 影响血管新生和血管通透性变 化的研究进展 9 1.3.1 PPARγ 概述 9 1.3.2 PPARγ 在血管新生中的作用和 争议9 1.3.3 PPARγ 在血管通透性变化中的 可能作 用. 11 1.4 本论文的研究目的和主要内容 12 1.4.1 本论文 的研究目 的 12 1.4.2 本论文 的主要内 容 12 2 PPARγ 激 动剂 罗 格列 酮抑 制血 管新生13 2.1 引言13 2.2 材料与方法14 2.2.1 主要仪 器和试剂. 14 2.2.2 人脐带 静脉内皮 细 胞培养 14 2.2.3 斑马鱼 喂养和胚 胎收集. 15 2.2.4 罗格列 酮与胚胎 共培养. 15 2.2.5 斑马鱼 存活、孵 化和心率 等重要生 理指标 观察 15 2.2.6 斑马鱼 血管新生 检测15 2.2.7 RNA 探 针制备16 2.2.8 斑马鱼 全胚原位 杂交16 2.2.9 荧光定 量 PCR17 2.2.10 大鼠腹 主动脉 血管环离 体微血管 生成实验. 18 2.2.11 血管内皮 细胞体外 血管新生 实验. 18 V 重庆大学硕 士学位论 文 目 录 2.2.12 血管内 皮 细胞 增殖实验 18 2.2.13 血管 内皮细胞 迁移实验18 2.2.14 细胞 凋亡检测 19 2.2.15 细胞 免疫荧光 染色. 19 2.2.16 统计 分析19 2.3 实验结果 20 2.3.1 PPARγ 激动剂罗格列酮RSG 对斑马 鱼存活率 等 重要生理指 标的影响20 2.3.2 PPARγ 激动剂罗格列酮抑制斑 马鱼在 体血管新 生in vivo angiogenesis. 22 2.3.3 PPARγ 激动剂罗格列酮抑制大鼠 腹主动 脉环离体 血管新生ex vivo angiogenesis 25 2.3.4 PPARγ 激动剂罗格列酮抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体外血管新生in vitro angiogenesis. 26 2.3.5 p53 诱导的细胞 凋亡参与 罗格列酮 对血管新 生的 抑制作用. 28 2.4 讨论31 2.4.1 斑马鱼 作为血管 新生模型 的优势和 适用性31 2.4.2 PPARγ 及其配体 与血管新生的 关系 32 2.4.3 PPARγ 及其配体 调控血管新生 的机制33 2.5 小结34 3 PPARγ 激 动剂 罗 格列 酮增 加血 管通透 性 35 3.1 引言35 3.2 材料与方法35 3.2.1 主要试 剂和材料. 35 3.2.2 小鼠背 部皮肤微 血管通透 性检测. 36 3.2.3 血管内 皮细胞通 透性检测. 36 3.2.4 VEGF 分泌的 ELISA 检测. 36 3.2.5 胞内 NO 生 成的荧光 探针检测. 37 3.3 实验结果 38 3.3.1 PPARγ 激动剂罗格列酮提高血 管通透 性. 38 3.3.2 PPARγ 激动剂罗格列酮诱导的 血管高 通透性不 依 赖 VEGF 42 3.3.3 PPARγ 激动剂罗格列酮诱导的 血管高 通透性依 赖 于 PI3K/eNOS/NO 信号通 路 43 3.4 讨论46 3.4.1 VEGF 及其受体在 罗格列 酮调控血 管新生和 血管 通透性变化 的作用46 3.4.2 PI3K/eNOS/NO 信号 通路在罗 格列酮调 控血管新 生和血管通 透性变化 的作用. 47 3.4.3 罗格列 酮抑制血 管新生却 增加血管 通透 性 的临 床指导意义48 VI 重庆大学硕 士学位论 文 目 录 3.5 小结48 4 总 结与 展望50 4.1 总结50 4.2 展望50 致 谢. 52 参 考 文献. 53 附 录. 62 A. 作者在攻读学位期间发表的论文和专利 62 B. 作者在攻读硕士学位期间曾参与的科研项 目. 62 VII 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 1 绪 论 1.1 问题 的提 出及 研究 意义肿 瘤 和 心脑 血 管疾 病 是危 害 人类 健 康的 最 主要的 两 类 疾病 , 在肿 瘤 和心 脑 血 管疾病 的 发 生发 展 过程 中, 常 常伴 随 着血 管 新生 和 血管 通 透性 变 化。 不成 熟 的 新 生 微 血管 通 透性 增 加, 是促 进 肿瘤 和 心脑 血管疾 病 发展 的 重要 因 素。 因此 , 抑 制 病 灶 中病 理 性血 管 新生 可能 成 为防 治 血管 新生相 关 疾病 的 靶点 , 具有 潜在 的 治 疗 意义。 过氧化物酶增殖物激活受体 γPPARγ 作为一种重要的代谢型受体,通过 与其 配 体 结合 转 录调 控 与胰 岛素 敏 感性 和 糖脂 代谢相 关 的数 十 种基 因 ,在 糖尿 病 中 发 挥重要的调节作用。 除了是 目前研究糖尿病发病机制和防治的重要靶点, 因 PPARγ 在炎症 反 应 和肿 瘤 发生 发展 中 也有 重 要的 调节作 用 ,在 防 治 癌症和 动 脉粥 样 硬 化 方面备受关注。 [1-3] 重要的是, 近些年 越来越多的 研究表明 PPARγ 与血管新生密切相关 。 人工 合成的 外源性 PPARγ 激动剂 如罗格列酮和吡格列酮 不仅是治疗 II 型糖尿病的常 见药物 ,基于激活 PPARγ 的激动剂 可以活化 核内 PPARγ ,促进其 DNA 结合并调 控 靶 与血 管 生成 相 关基 因的 转 录, 可 实现 对血管 新 生的 调 控。 在 可预 见的 未 来 , 基于 激活或抑制 PPARγ 的激动剂或拮抗剂 有望 成为 病理性血管新生的潜在治疗药 [1, 4] 物 。 遗憾的 是,目前 PPARγ 激动剂与血管新生的关 系 莫衷一是,前后研究中 产生 [1-3] 较大的学术分歧 。 例如, 一项研究显示罗格 列酮抑制血管内皮生长因子VEGF [5] 诱导的血管生成 , 但另有研究却发现罗格列酮增加 VEGF 表达并缓解大脑缺血梗 [6] 塞 。 而 另一方面,已有临床数据表明,服用 PPARγ 激动剂药物如罗格列酮会导 致患者产生水肿等与血管通透性变化的副作用。因此, 探究 PPARγ 激动剂 对血管 通透性的影响尤为重要, 但是 目前针对 PPARγ 激动剂对伴随血管新生过程中血管 通透性变化的作用研究 鲜见报道。 本课题试图明 确 PPARγ 激动剂 对血管新生和 通 透 性 变 化 的 调 控 。 确 定 PPARγ 激动剂 在 血 管 新 生 和 通 透 性 变 化 中 的 作 用 可为 PPARγ 激动剂药物 安全有效地 应用于血管新生 治疗提供理论基础和可靠途径。 1.2 病理 性血 管新 生和 血管 通透 性增加的 地位 1.2.1 血管新生过程 血管新生angiogenesis 是 指原位血管处萌发出新的微血管的过程, 是一个由多 种促/ 抑血管生 成因子协调 作用并 与细 胞增殖和 迁移等 一系列细 胞行为密切 相关的 复杂活动。简而 言之, 当 血管被 损伤 时,促/ 抑 血管生成因子平 衡打破,抑 血管生 1 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 成 因 子表 达 下降 , 促血 管生 成 因子 分 泌增 加并在 损 伤血 管 局部 聚 集, 诱发 血 管 新 生 , 继而 基 质金 属 蛋白 酶 等 降 解细 胞 外基 质, 内 皮 细胞 与 周围 组 织连 接减 少 并 不 断 增 殖、 伸 长和 连 接, 形成 新 的血 管 芽胞 和血管 腔 ,管 腔 之间 不 断连 接, 最 后 形 成血管丛。 目 前 , 血管 新 生在 肿 瘤和 动 脉粥 样 硬化 等 众多疾 病 的 作用 和 地位 成 为未 解 决 的 主 要问 题 之一 。 血管 新生 从 不同 的 角度 吸引着 人 们的 兴 趣。 大 多数 研究 认 为 血 管 生 成因 子 治疗 是 一种 治疗 缺 血性 心 脏病 和提高 内 皮保 护 动脉 功 能的 方法 , 利用 血管生成因子如 血管内皮生长因子VEGF 或 成纤维生长因子FGF 刺激缺血性心 [7] 脏或四肢血管生成, 可以达到治疗目的, 即治 疗性血管新生 ; 然而, 也有大量研 究指出 肿 瘤 和动 脉 粥样 硬化 斑 块等 病 理条 件下由 于 缺氧 形 成的 大 量微 血管 通 过 给 病 灶 提供 氧 和营 养 加剧 了上 述 病变 过 程, 肿瘤和 动 脉粥 样 硬化 斑 块内 病理 性 血 管 [8] 新生是促进肿瘤转移和诱发动脉粥样硬化斑块 破裂的关键因素 。 1.2.2 血管新生促进肿瘤 发生发 展 上世纪 科学家们就发现肿瘤内存在病理性血管新生。70 年代 左右有人 便提出 假设认为肿瘤生长发展依赖其产生的扩散性的促血管生成因子 , Folkman 开创性地 提 出 肿瘤 生 长和 转 移是 血管 新 生决 定 的。 肿瘤不 断 生长 耗 尽附 近 营养 和氧 后 在这 些促血管生成因子的刺激下 形成大量微血管为其补充必需 物质 图 1.1 ,所以抑制 由 血 管生 成 因子 介 导的 肿瘤 血 管新 生 是阻 断肿瘤 不 断生 长 的策 略 。随 后肿 瘤 学 界 普遍开展工作寻找肿瘤血管新生的促进 和 抑制因子,其中便包括 Senger 等人在猪 肿瘤细胞株中 发现血管 内皮生长因 子VEGF 是 促进肿瘤生长 发展的关 键生长因子 [9] 。[10] 图 1.1:血管 新生在肿 瘤发生发 展中的作 用 [10] Figure 1.1: The role of angiogenesis in tumor development 2 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 已 知 肿 瘤血 管 新生 可 由多 种 病理 因 素刺 激 ,包括 低 氧 等代 谢 应激 刺 激低 氧 诱 导因子Hif 介导的促血管生成因子生成、 增殖肿瘤细胞所产生的压力等物理应激、 浸 润 至肿 瘤 的免 疫 和炎 症反 应 、致 癌 基因 的激活 或 者抑 癌 基因 的 失活 后产 生 系 列 因 子 调控 血 管新 生 。其 中, 缺 氧是 诱 导肿 瘤,等 众 多疾 病 形成 新 生血 管的 强 烈 刺 激因素。远离血管 >100μm 的细胞容易 缺氧, 另外,胞外基质的异常沉积和血管 [11] 堵 塞后 正常 供养 能力 降低 ,也 容易 造成 缺氧 环境 。作 为调 控众 多血 管生 成因 子 的转录因子,Hif 被低氧激活后, 可转录活化包 括VEGF 、 一氧化氮合酶 NOS、血 小板源生长因子PDGF 和血管紧张素Angiopoietin; Ang 等在内的血管生成相关因 [12] 子 。 肿 瘤 血 管生 成 有多 种 方式 , 包括 从 原先 血 管基础 上 以 芽生 和 套叠 方 式产 生 微 血 管 、骨 髓 基质 来 源内 皮祖 细 胞募 集 嵌入 肿瘤形 成 新生 血 管、 与 原先 血管 周 围 共 [8] 生长形成血管套 。 目前普遍认为, 肿瘤内血管新生是由促血管生成因子和抑血管 生 成 因子 协 调作 用 的。 正常 情 况下 , 血管 生成开 关 在抑 血 管生 成 因子 抑制 促 血 管 生 成 因子 的 效应 后 关闭 ,当 这 种平 衡 被打 破后, 肿 瘤便 在 促血 管 生成 因子 作 用 下 生成微血管。 [13] 血管生 成相 关因 子在 肿瘤 血管 新生 的多 个过 程 中发挥 作用 。以 芽生 型血管 新生为例,Ang-1 和 胞 间 连 接 分子 如 血 管 内皮概 粘 蛋 白VE-cadherin和血小板内皮 粘附分子PECAM 对肿瘤血管 的稳定效应被VEGF 诱导的促血管生成作 用替代,肿 瘤原先血管在VEGF 的诱导下开始膨大, 通透性增加。Ang2和蛋白酶降解血管基质 膜和胞间基质。 内皮细胞在VEGF 、Ang1和碱性 成纤维生长因子bFGF 等促细胞生 长因子刺激下增殖、 迁移和组装, 胞外基质受 体整合 素的家族成员如α β 和α 调控 v 3 5 细 胞 粘附 铺 展 。 新 生血 管的 成 熟过 程 涉及 基底膜 、 血管 周 细胞 和 平滑 肌细 胞 的 生 成。由PDGF-BB 招募的平滑肌细胞在转化生长 因子TGF-β1和Ang1/Tie2 作用下与 内皮细胞相互结合形成稳固的 细胞内膜和中膜 结构。蛋白酶抑制因子如PAI-1则遏 制微血管新生的胞外基质。 1.2.3 血管新生促进动脉 粥样硬 化斑块 破 裂 人 体 大 动脉 外 膜 一 般 均存 在 毛细 血 管构 成 的微血 管 从 ,即 血 管滋 养 层。 血管 滋养 层分 为 一级 和 二级 血管 滋 养层 , 一级 血管滋 养 层是 由 冠状 动 脉分 支点 出 发 沿 着 血 管壁 纵 向延 伸 形成 ,然 后 围绕 着 主冠 脉腔分 支 形成 环 状的 二 级血 管滋 养 层 。 这些微血管提供的血流和营养仅扩散至100μm 范围内的 周围组织 , 所以 它们一般作 为营养和氧分通道滋养 血管外膜 。 内 膜 血管 新生 与动 脉粥 样 硬化 的联 系最 先是 由Koester 在1876 年发 现的 。后 来 [14] 发现成人动脉内膜只有达到一定厚度时才会形成血管 。 Barger 等在综述前人的研 究 基 础上 开 创性 地 提出 ,冠 状 动脉 外 膜微 血管增 殖 进而 给 病灶 中 心提 供氧 和 营 养 3 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 [15] [16] 使得 斑块扩长超过 临界厚 度 。后来 通过研究 人病理样本 和 高脂 血症的灵 长类 [17] 动物冠 状动 脉 中 动脉 粥样 硬化程 度和 斑块 血 管新生 的关 系也 验证 了血 管新生和 动脉粥样硬化之间的联系。 利用 动脉粥样硬化动物模型- 载脂蛋白基因E 敲除 小鼠,Moulton 等在1999 年发 现将两种内皮细胞特异性的血管生成抑制剂endostatin 和TNP-470 作用 于上述小鼠 [18] 后,治 疗组 的斑 块面 积均 比对照 组显 著缩 小 ,这项 研究 首次 直接 证实了 抑制斑 块 内 血管 新 生可 成 为抑 制 动 脉 粥样 硬 化 发 生发展 的 重要 策 略 。 类 似的 ,用 另 外 一 [19] 种血管生成抑制剂也减弱了 动脉粥样硬化 疾病程度 。 斑 块 内 新生 微 血管 是 如何 产 生的 呢 ?斑 块 内缺氧 是 诱 发内 膜 血管 新 生的 主 要 [20] 因素 。 在动 脉粥 样硬 化发 展过程 中, 内膜 不 断增生 ,一 旦血 管壁 厚度 超过一定 的 界 限, 氧 浓度 急 剧下 降。 另 外, 外 膜微 血管丛 的 功能 紊 乱也 有 可能 造成 低 氧 环 [21] 境 。相 应地 ,在 高脂 动脉 粥样硬 化动 物模 型 中可观 察到 先于 斑块 形成 的血管新 [20, 22] 生 。 Hif 转录活化的促血管生成因子参与调 控低氧诱导的血管新生。 除了低氧, [23] 炎症反 应和 氧化 应激 也会 刺激斑 块内 血管 新生 和血管 重构 。炎 症细 胞可 放大维 持 由 低氧 诱 导的 血 管生 成效 应 。其 中 的机 制可能 包 括活 化 的斑 块 巨噬 细胞 促 进 分 泌更多的酸性成纤维细胞生长因子和白介素8, 微血管附近的肥大细胞运送碱性成 [23-25] 纤维细胞生长因子至斑块内 。 那 么 , 斑块 内 血管 新 生又 是 如何 促 进斑 块 发展进 而 诱 发斑 块 破裂 和 出血 并 最 终发展 为心肌 梗塞 等急性 冠状 综合症 的呢 ?Sluimer 等 发现 斑块内 新生 微血管 可作 为 炎 症细 胞 、脂 质 和血 细胞 运 输通 道 。这 些通道 的 重要 性 在于 实 现了 斑块 内 炎 症 [26] 反应、 氧化 应激 和微 血管 生成的 恶性 循环 。 首先, 微血 管异 常表 达的 粘附分子 [23] 和连接 蛋白 有利 于炎 症细 胞渗透 进入 斑块 。 而且报 道称 斑块 内微 血管 的钙粘蛋 [27] 白表达下调, 这有助于VEGF 诱导的内皮细胞 增殖和微血管再生 。 其次, 由新生 微 血 管渗 透 到斑 块 内的 游离 脂 质、 血 红蛋 白和铁 元 素增 多 ,促 进 了氧 化应 激 和 炎 [26] 症反应 的加 剧 。 反过 来, 加剧的 炎症 效应 和 氧化应 激又 会分 泌更 多血 管新生促 进因子,刺激微血管再生 。 1.2.4 血管新生过程中血 管完整 性和通 透 性的变化 血 管 新 生过 程 伴随 着 血管 完 整性 和 通透 性 的变化 。 经 历血 管 基底 膜 降解 、 新 生 血 管从 原 有血 管 上出 芽生 长 、芽 胞 增殖 迁移后 渐 渐成 熟 等系 列 过程 ,血 管 新 生 要 求 血 管 本 身 的 完 整 性 和 通 透 性 发 生 适 应 性 变 化 。 在VEGF 等 高 通 透 性 因 子 诱 导 下, 原先血管开始扩张, 通透性增大, 而抑制通透性增高因子Ang-1保护血管完整 性的效应 丧失。 一致的是,VEGF 刺激的血管新 生在治疗心肌和脑缺血疾病过程中 常 发 现急 性 血管 通 透性 增高 , 是导 致 组织 水肿的 重 要因 素 。在 心 脏发 生缺 血 缺 氧 后, 激活的Hif 在短时间内6h 造成VEGF 局部 生成聚集, 虽然受损组织血管得以再 4 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 [28] 生修复,且VEGF 、VEGFR2 、Hif 在较长时间 持续表达里有利于保护细胞活性 , 但VEGF 在数小时内大量表达却破坏心脏微血管内皮细胞的连接, 产生间隙, 致使 [29, 30] 血浆、血浆蛋 白和红细胞 进入心肌, 扩大梗塞 面积加剧心肌 损伤 。当缺血性 中风发生6h后产 生的VEGF 活性 被阻断 后,水 肿现象减 轻,由 此可改 善VEGF 的促 [31] 血管生成治疗效果 。c-Src 是VEGF 增高血管通透性的关键信号, 药物或者基因阻 断c-Src 可在不影响VEGF 表达的基础上抑制VEGF 诱导的高血管通透性和间质水 [29, 31] 肿, 同时减少心肌或者脑梗塞面积 。 基于此, 一种针对VEGF 诱导血管通透性 增强的新型抑制剂进入急性心肌梗塞的临床一期、 二期治疗, 旨在探究抑制VEGF 诱 导 急 性 血 管 通 透 性 能 否 实 现 在 维 护 缺 血 组 织 正 常 功 能 基 础 上 发 挥VEGF的促血 [32] 管生成作用 。 除 了 在 治疗 性 血管 新 生过 程 中发 现 血管 通 透性变 化 , 近些 年 有研 究 发现 缺氧 或 者 其他 各 种因 素 刺激 的斑 块 内 新生 微血管 缺乏 完 整性 , 血管 通 透性 增强 , 是 斑 块 稳 定性 丧 失导 致 急性 冠状 动 脉综 合 症的 关键因 素 之一 。 这些 不 成熟 的微 血 管 只 由 一 层内 皮 细胞 构 成, 血管 周 围没 有 周细 胞和平 滑 肌细 胞 覆盖 , 也没 有完 整 的 基 底膜包裹 图1.2 。 缺乏完整性的微血管可成为炎 症细胞和脂质浸润以及血细胞进入 [21, 26] 斑块的通道,是斑块出血和破裂的重要因素 。 5 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 [21] 图1.2:动脉 粥样硬化 斑块内新 生微血管 的病理性 [21] Figure 1.2: Pathological angiogenesis in atherosclerotic plaque 同 样 地 ,肿 瘤 转移 在 很大 程 度上 依 赖于 不 完整的 新 生 微血 管 。缺 血 缺氧 诱 导 形 成 的肿 瘤 微血 管 在结 构和 功 能上 是 不成 熟、不 完 整的 , 新生 未 成熟 血管 结 构 缺 陷 表 现为 基 底膜 不 完整 , 丧 失 平滑 肌 等血 管周细 胞 的结 构 性和 功 能性 支持 , 内 皮 细胞- 细胞以及细胞- 基底缺乏紧密连接 , 造成 血管通透性增加 , 高通透性的血管提 [33] 高了肿瘤细胞浸润 血管壁 的能力,使得肿瘤细胞容易经血液循环发生转移 。 6 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 肿瘤发生发展中由VEGF 诱导的病理性血管新生和血管渗漏更为常见。其实, VEGF 最初是在肿瘤细胞被发现, 肿瘤细胞分泌 的VEGF 刺激腹水形成和血管渗漏, 具 有 强烈 的血 管通 透性 增大 作用 ,其 效应 是组胺 的50000倍,VEGF 因 此最 初也 被 [9] 定义为血管通透因子VPF 。VEGF诱导的肿瘤附近血管渗漏可促进纤维蛋白渗 出 、 吸收 肿 瘤血 管 新生 所需 物 质。 肿 瘤血 管渗漏 引 起的 间 质压 力 增高 ,流 向 肿 瘤 中 心 的微 血 流方 向 被改 道至 周 边位 置 ,抗 肿瘤药 物 很难 递 送至 肿 瘤核 心位 置 。 当 然对于某些分布特殊的肿瘤而言, 增强血管通透性则有利于药物高剂量靶向递送。 抑制VEGF 及 其 介 导 的 信 号 途 径 是 降 低 肿 瘤 血 管 通 透 性 和 转 移 能 力 的 有 效 手 段。 临床研究发现化疗和bevacizumab 一种VEGF 抑制剂 结合化疗可显著延长转移 性 结 直 肠 癌 患 者 的 生 命 , 很 有 可 能 得 益 于VEGF 抑 制 剂 对 肿 瘤 血 管 的 正 常 化 作 用 [34] 。 这种正常化效应包括血管通透性的降低和 随后间质压力的降低以及药物递送, 也有研究表明阻断VEGF 也可以使肿瘤相关血管的周细胞和基底膜正常化, 是增强 [35] [36] [37] 血 管 完 整 性 的重 要 方 面 。在 肿 瘤 动物 模 型 和 直 肠 癌 患者 中,阻断VEGF 受 体VEGFR2 也可实现 肿瘤相关血管的正常化, 同样可降低间质压力和提高抗肿瘤 药物的递送效率。 另有研究发现表达VEGF 的肿瘤细胞在形态上呈现延伸性的突出 结 构 ,该 突 出结 构 破坏 内皮 细 胞间 链 接, 完整性 被 破坏 的 内皮 细 胞成 为肿 瘤 细 胞 [38] 转移的有利通道 。Src 或者Yes 敲除小鼠在VEGF 诱导下血管通透性不发生改变, [29] 抑制肿瘤细胞的浸润和转移 , 提示这些VEGFR2 下游分子在VEGF 诱导的血管通 透性变化扮演非常重要的角色。 1.2.5 血管通透性变化的 机制 内 皮 细 胞自 身 结构 和 胞间 连 接变 化 是血 管 通透性 变 化 的基 本 机制 。 不同 尺 寸 通过内 皮细胞 的机制 有所 不同 图1.3 。Roberts 和Palade 等发 现在血 管通 透因子如 [39] VEGF 作用下内皮细胞表面形成微型孔状结构使可溶性小分子渗透通过 。 在血管 通透性 增高 后,细 胞表 面也会 形成 微小 窝状结 构caveolae 促 进小 分子通 过。 主要 由caveolin-1构成的caveolae 是介导细胞质膜内 吞作用和胞吐作用的主要单位。 Feng [40] 等 发现沿内皮细胞质膜面上融合的囊泡是极 小分子渗透的通道,在14nm 高度超 薄切片 中观察到 “囊泡- 空泡细胞 器vesiculo-vacuolar organelles;VVOs 。VVOs 是一 簇 葡萄糖状的 由3层单位膜包绕的囊泡 结构, 由内皮细胞质膜内凹 成的小泡由囊泡 融合构成。 较大分子渗透则是通过 内皮细胞之间连接 被破 坏后形成的缝隙。细胞- 细胞紧 密连接和粘附连接以及细 胞- 基底粘附连接是保 证胞间通信和基底作用的 基础,这 些 连 接的 完 整性 由 一系 列连 接 蛋白 控 制。 连接蛋 白 功能 的 紊乱 使 内皮 细胞 与 细 胞 间 或 者基 底 连接 丧 失, 是导 致 血管 通 透 性 增强的 分 子学 基 础。 胞 间连 接破 坏 后 的 常 见 后果 是 血浆 、 血浆 蛋白 和 血红 细 胞渗 出进入 胞 外间 隙 ,造 成 间隙 压力 增 大 引 发 水 肿。 血 管渗 漏 间隙 部位 由 于基 底 膜外 露还会 募 集大 量 血小 板 甚至 是肿 瘤 细 胞 7 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 [38] 。 血小板与vW 因子、 纤连蛋白或者胶原蛋白结合后被活化, 活化的血小板通常 很 容 易造 成 小血 管 堵塞 ,是 造 成缺 氧 环境 的重要 环 节, 缺 氧又 会 刺激 更多 的 血 管 [41] 通透因子如VEGF ,加重血管渗漏 。 胞 间 紧 密连 接 由系 列 连接 蛋 白参 与 形成 的 咬合结 构 , 光镜 下 可见 细 胞间 质 膜 紧 紧 相连 , 没有 空 隙, 电镜 下 可见 相 邻细 胞由焊 接 线连 接 成绳 索 状。 该焊 接 线 由 occludin 等分子构成。血管内皮细胞粘附连接的 分子基础是钙粘蛋白。由胶原蛋白 collagen 和 纤 连 蛋白fibronectin 等 组 成 的胞 外基 底 膜是 大 分子 渗透 的重 要 通道 。 内皮细胞与基底膜的粘附连接主要由整合素integrin 及其接头蛋白构成。Integrin 在胞外与collagen 等胞外基质蛋白结合,在胞内 通过其街头蛋白与细胞骨架连接, 是胞内外信号传导和调控 血管内皮通透性的重要途径。 从 上 述 过程 中 不难 发 现各 种 连接 蛋 白与 细 胞骨架 密 切 相关 。 细胞 骨 架结 构 和 功 能 的改 变 是血 管 内皮 通透 性 变化 的 重要 过程。 细 胞骨 架 中与 血 管通 透性 关 系 最 为密切的是微丝,构成微丝的是F- 肌动蛋白F-actin 和G- 肌动蛋白,在骨 架重组的 过程中两者相互转化。 正常F-actin 分布在细胞 外缘成纤维丝束, 在血管通透性因子 作用下,F-actin 重组,胞外丝束消失 ,形成无 序的纤维丝束,称为应力纤维stress fiber 。另外,构成F-actin 的肌动蛋白轻链MLC 发生磷酸化是stress fiber 发生重组 的关键因素,stress fiber 重组形成的内皮细胞间隙是促进血管内皮通透性增加的重 要过程。[30] 图 1.3:血管 渗透的机 制 [30] Figure 1.3: The mechanisms of vascular leak 8 重庆大学硕 士学位论 文 1 绪 论 1.3 过氧 化物 酶增 殖物 激活 受体 γPPARγ 影响血 管新 生和 血管 通 透性 变化 的研 究进 展 1.3.1 PPARγ 概述 PPAR 是一类包括 PPARα 、PPARγ 和 PPARβ/δ 的核转录因子超家族, 其中, PPARγ 的研究最为深入。已知 PPARγ 在糖尿病 、高血压、肿瘤、肥胖和动脉粥样 [2] 硬化等疾病扮演非常重要的角色 ,PPARγ 因 此是众多药物开发的靶点。 PPARγ 与配体结合 激活后, 活化 的 PPARγ 在胰 岛素抵抗、 糖脂代 谢和炎症反 应 等 方面 有 重要 的 调节 作用 , 是研 究 糖尿 病、高 血 压、 肿 瘤、 肥 胖和 动脉 粥 样 硬 化等疾病发病机制和治疗的热点。PPARγ 在机 体内有多种天然配体,15- 脱氧前列 腺素 J215d-PGJ2 是目前研究最多的 PPARγ 天然配体 , 除了能与 PPARγ 直接结合, 15d-PGJ2 还会与 PPARα 结合,是