互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品 .doc

互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品 .doc 互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子 多克隆抗体标准品 作者:夏玲芝 沈传来 唐秋莎 谢维 张建琼【摘要】 目的:纯 化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品。:利用人精子抗原 及其他组织蛋白等分别制备亲和层析柱，经正反相互补式亲和层析 从兔抗血清中纯化IgG和IgA型抗人精子多克隆抗体，用 SDS PAGE、ethods Three type of affinity chromatography column respectively made from human sperm antigen,normal serum and lysate of normal tissue cells polyclonal antibody(IgG and IgA) from rabbit anti human sperm serum.The resulting antibody e linked immunoabsorbent assay(ELISA) for determining its purity,specificity and linear reaction antigen. Results The purified anti sperm antibody shoan serum,lysate of human normal tissue cells munodiagnostic reagents.At the concentration range of 0.4882–7.8120ng?ml,,(for IgG isotype) or 1.953–31.250ng?ml,, (for IgA isotype),the purified antibody reacted in ELISA antigen in a linear manner. Conclusion The purification schedule is feasible for preparation of antibody standard used in antibody quantitative detection. Key antibody; quantitative enzyme labeled immunosorbent assay; affinity chromatography 我国不孕育症发生率占已婚夫妇的8%,15%，近20%为免疫性不孕 育，其中抗精子抗体的重要致病作用已被大量实验和临床观察所证 实〔1 5〕。存在于男女血清、精浆及宫颈分泌液中的抗精子抗体 的浓度高低直接决定着其抗生育效应的强弱，也是疗效观察和预后 判断的有效量化指标。因此，抗精子抗体的定量对诊断和治疗 免疫性不孕育非常重要。然而，由于精子抗原种类繁多，抗精子抗 体标准品不易获得，目前我国尚无厂家生产抗精子抗体定量检测试 剂盒。大多数医院采用酶标法或金标法试剂盒进行抗精子抗体的定 性检测，极少数医院采用昂贵的进口试剂盒进行定量 〔6 11〕。但是这些进口定量试剂盒实际上仍属于半定量的性质， 他们都只能以U?ml,1来示所测抗精子抗体的浓度，而并不能准 确说明一个U代表多少质量(ng或pg)的抗精子抗体，而且每家 公司各自定义其标准品中抗精子抗体的单位数，互不可比。本研究 首次利用高纯度人精子膜抗原等多种蛋白制剂制备互补式亲和层析 柱，从经人精子免疫的兔血清中提取纯化出纯度高、与正常人血清 蛋白和组织细胞裂解液无交叉反应的高特异性抗人精子多克隆抗体 标准品，为进一步纯化人源性抗人精子多克隆抗体标准品奠定了基 础，有利于我国抗精子抗体定量检测方法的建立。有关纯化已 申请国家发明专利。 1 材料与方法 1.1 免疫接种及人精子膜 抗原的提取纯化 取精液常规检查为正常的人精液标本(从南京金陵男科医院收集)200 ml，经0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS离心(1 200 r?min-1)洗涤3次，用生理盐水制成精子悬液后常规免疫家兔3次，皮下多点注射，每次1×106，每次接种间隔2周。末次免疫后2周心脏取血，分离兔血清，分装后置-70 ?冰箱保存备用。 人精子膜抗原采用超声波粉碎、NP 40萃取与3种互补式亲和层析柱(A、B、C柱)相结合的新提纯方案而得，经与两种市售ELISA试剂盒比较，阴阳性符合率达100%，且与正常人血清标本无反应，OD值?0.08〔12〕。 1.2 主要试剂 Br活化的Sepharose CL 4B、HRP、TMB、DAB(Sigma公司)，DEAE52纤维素、Sephadex G200(illipore公司)，HRP标记的羊抗兔IgG和羊抗兔IgA(北京天坛生物制品股份有限公司)，牛血清白蛋白?(BSA ?)、小牛血清(FCS)(上海伯奥生物科技有限公司)。 1.3 兔血清中总IgG和总IgA的提取纯化〔13〕 总IgG提取纯化:取免疫兔血清,经常规33%硫酸铵盐析法粗提IgG型免疫球蛋白,透析除盐后再分批过DEAE52纤维素层析柱，用0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，经聚乙二醇浓缩至2,4 mg?ml-1(BCA法蛋白定量)即为精制总IgG，分装置-70 ?保存备用。所有盐析、透析、层析及离心步骤均在4 ?进行，且下同。总IgA提取:取免疫兔血清加等量0.1 mol?L-1 ZnSO4液，调pH至7.0，搅拌1 h后离心去沉淀，上清中加等量饱和硫酸铵，混匀后4 ?过夜，离心去上清后溶沉淀于10% EDTA Na中，透析除盐后再分批过DEAE52纤维素层析柱，先用0.01 mol?L-1 pH7.4 PBS洗脱并弃洗脱液，再换用0.1 mol?L-1 pH 6.4 PBS洗脱，所收集蛋白峰即为IgA。聚乙二醇浓缩后再过Sephadex G200柱，经0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS洗脱,第一蛋白峰即为精制总IgA，BCA法蛋白定量后分装置-70 ?保存备用。 1.4 亲和层析柱的制备与抗精子抗体的纯化 以下纯化方案已申请国家发明专利(申请号200710190243.6;公告号101158681，公告日2008.04.09):将纯化的人精子抗原2 mg及其他两种组织蛋白各20 ml,分别与溴化氰活化的Sepharose CL 4B偶联成亲和层析D、E和F柱〔14〕。取从免疫兔血清中提取纯化的总IgG或总IgA，分批过D柱(每次5 mg)，按常规〔14〕层析，收集与层析柱相结合的蛋白，并立即调整酸性收集液的pH值至7.4。将多批层析所得的收集液合并浓缩后再过E柱，收集不与层析柱结合的蛋白,再过F柱，收集不与层析柱结合的蛋白。聚乙二醇浓缩后经0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS透析过夜即得精制的抗人精子抗体IgG标准品或IgA标准品。BCA法蛋白定量后加适量甘油，分装置-70 ?保存。 1.5 抗精子抗体的纯度鉴定(SDS 聚 丙烯酰胺凝胶电泳法) 常规制备10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶板。取BSA ?、人全血清、人组织细胞裂解液、纯化的人精子膜抗原和未加甘油的抗精子抗体IgG或IgA纯品,分别加入等量的2×样品缓冲液后煮沸10 min，离心后取上清20 μl上样。连接Bio RAD 200型电泳仪后于80 V电泳1,2 h，经考马斯亮兰R250染色1 h后脱色过夜。 1.6 抗精子抗体的特异性分析(免疫印迹法) 将800 μg辣根过氧化物酶(HRP)溶于200 μl含200 μg抗精子抗体IgG或IgA纯品的PBS中,缓慢加入1%戊二醛溶液800 μl，室温反应后于4 ?经PBS透析48 h除去游离的戊二醛，置4 ?备用。取人组织细胞裂解液、BSA ?、未婚少女血清和纯化的人精子膜抗原进行10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，经Bio RAD Trans Blot SD型半干转移仪转于PVDF膜上(15 V，35 min)，用2%BSA 5%脱脂奶粉 PBS溶液于4 ? 封闭PVDF膜过夜。取HRP标记的抗精子抗体IgG或IgA溶液与膜杂交(室温反应1 h)，用含0.1%吐温 20的PBS充分洗膜后加DAB底物显色1 min。 1.7 定量酶联免疫吸附实验(定量ELISA) 在酶标条板中加入5 mmol?L-1戊二醛溶液每孔0.2 ml，37 ?反应4 h，用0.01 mol?L-1 pH 7.4 PBS洗涤4次后自然晾干。将纯化的精子膜抗原用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释成1,8μg?ml-1，加入上述条板(每孔0.1 ml)，4 ?包被过夜。2%BSA PBS室温封闭条板2 h后用含0.05%吐温 20的PBS洗涤3次，加入倍比稀释于1%BSA PBS中的抗精子抗体IgG或IgA纯品，室温反应1h，同上洗涤后加入HRP标记的羊抗兔IgG或羊抗兔IgA(按厂家说明稀释)，室温30 min后洗涤3次，加TMB底物溶液显色10 min，0.2 mol?L-1硫酸终止显色后于450 nm处测吸光值。另外用少女全血清、人组织细胞裂解液和BSA等液分别包被酶标条板，同上封闭后与纯化的抗精子抗体反应，检测可能存在的非特异性结合或者说ELISA的背景噪音。2 结 果 2.1 抗精子抗体的纯度分析 将纯化的抗精子抗体(AsAb)IgG型(图1)和IgA型(图2)蛋白液跑10%SDS PAGE变性电泳,只在相对分子质量为55 000和25 000的位置各出现1条主要条带,即抗体的重链和轻链。同时人全血清、BSA ?及人组织细胞裂解液则显示众多蛋白条带。纯化的人精子抗原因相对分子质量大小不一且混有甘油保护剂，除1条主带呈弧形外尚有弥散分布的小分子蛋白区。 2.2 抗精子抗体的特异性分析 在免疫印迹实验中(图3), HRP标记的抗精子抗体仅与纯化的精子膜抗原杂交,呈现1条主带和多条弱带,且其位置与精子膜抗原在SDS PAGE中的位置一致。而与人组织细胞裂解液、少女全血清及BSA ?等无任何可见的杂交带，显示纯化的IgG型和IgA型抗精子抗体与正常 组织细胞蛋白和正常血清蛋白的交叉反应很弱。 2.3 抗精子抗体与精子抗原的酶联免疫反应 将纯化的精子抗原分别以1、2、4、8 μg?ml-1的浓度包板后，与倍比稀释的抗精子抗体作间接ELISA，结果显示:在,种抗原包被浓度下，IgG型抗精子抗体在抗体(IgG型)的纯度7.8120,0.488 2 ng?ml-1的浓度范围时,OD值呈直线性,最低可测浓度为0.488 2 ng?ml-1，其OD值如图4A;IgA型抗精子抗体在31.250,1.953 ng?ml-1范围时,OD值显直线性,最低可测浓度为1.953 ng?ml-1，其OD值如图4B。OD值的高低与抗精子抗体的浓度成明显剂量依赖关系，而对抗原包被浓度(1,8 μg?ml-1范围内)的依赖性不明显。在少女全血清、人组织细胞裂解液或BSA ?等液体包板时，抗精子抗体基本无结合反应，OD值与调零孔相似。 3 讨 论 与任何定量酶联免疫吸附实验一样，抗精子抗体的定量分析应该有抗精子抗体的标准品。但是人类精子抗原可能多达数百种，而且大多数未能进行基因确定和克隆表达，因此无法利用重组蛋白获得如此众多的单克隆或多克隆抗体。不同抗原诱导产生的抗体，其亲和力差异很大，即使能获得少数几种重组精子抗原，其相对应的单克隆或多克隆抗体与精子抗原的结合能力未必能代表针对几百种精子抗原的抗体的亲和力。这种亲和力差异将直接导致定量检测结果的不同。另外，鼠源性或兔源性抗体因亲和力的差异也不适于用作标准品定量分析人源性抗体，因此，利用人类精子抗原的混合物从众多患者血清中纯化的人源性抗人精子多克隆抗体，更能体现患者体内抗精子抗体的多样性和其各不相同的与抗原分子的亲和力。 如何制备对应的精子抗原种类多而同时又拥有高度特异性的抗精子抗体一直是准确检测抗精子抗体的难点问题。本研究利用来自众多健康个体的完整的精子细胞混悬液多次免疫实验兔，从免疫的兔血清和其他兔血清中分别提取IgG蛋白，制作成亲和层析A柱和B柱。前者包含抗精子抗体IgG和非抗精子抗体IgG，后者全部为非抗精子抗体IgG，且与前者所含的非抗精子抗体IgG成分相同。与A柱结合的蛋白中除含人精子抗原外尚有能与兔源非抗精子抗体IgG结合的未知人源蛋白，因此需继续过B柱，去除这些与非抗精子抗体IgG结合的成分。这种互补式亲和层析的新方案在理论上保证了所提取精子抗原的高纯度。我们先前提取精子抗原的研究结果也证明了这一点〔12〕。利用该精子抗原制作亲和层析柱，进一步纯化免疫兔血清中的抗精子抗体，并利用其他两种组织蛋白层析柱去除所纯化抗精子抗体中能与正常人血清反应的成分。免疫印迹实验和ELISA分析均证实，所得的抗精子抗体不与正常人血清、正常人组织细胞裂解液及牛血清白蛋白等可能出现在ELISA检测系统中的成分发生反应，为其成为定量分析中的抗体标 准品奠定了基础。 值得注意的是，鼠源性或兔源性抗体因亲和力的差异也不完全适于用作标准品定量分析人源性抗体。利用人类精子抗原的混合物从众多患者血清中纯化的人源性抗人精子多克隆抗体更能体现患者体内抗精子抗体的多样性和其各不相同的与抗原分子的亲和力。本研究为此奠定了技术基础。 另外，目前尚无商家使用纯化的抗精子抗体作为标准品进行定量分析。如果使用纯化的抗精子抗体作为标准品对临床标本进行定量分析，则应先利用自制的抗体标准品确定人群中抗精子抗体的正常值范围，其中已婚生育的男性人群和女性人群的抗精子抗体水平以及基于正常值范围的阳性预测值对临床检测结果的评价尤为重要。【