食管癌组织微卫星DNA序列不稳定性和杂合性缺失及预后的研究

食管癌组织微卫星DNA序列不稳定性和杂合性缺失及预后的研究 【摘要】目的探讨微卫星DNA序列不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)与人食管癌发生、临床病理特征及预后的关系。方法应用聚合酶链反应(PCR)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对30例人食管癌中MSI及LOH阳性情况进行研究，术后随访5年，了解预后。 结果D3S1067位点MSI发生检出频率较高，为26.7%;D18S58位点 MSI阳性率为20%。MSI的发生在食管小细胞癌中较食管鳞癌为高(P,0.05);MSI、LOH与肿瘤的病理分级、PTNM分期、有无区域淋巴结转移和浸润深度无关(P,0.05)。 结论食管癌在3p和18q染色体位点均存在微卫星不稳定现象;D3S1067和D18S58二个位点上MSI与食管癌的临床病理类型均相关;研究未发现这两个位点MSI、LOH与食管癌的临床分期、细胞分化程度、癌组织浸润深度和有无区域淋巴结转移等参数相关;3p位点基因的改变在食管鳞癌发生过程中具有较重要意义。 【关键词】 食管癌;微卫星不稳定性;杂合性缺失;聚合酶链反应;肿瘤 食管癌的发生、发展过程中涉及一系列遗传学的改变，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。近期研究发现，微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)在肿瘤的发生过程中能间接反映基因突变情况，可作为基因突变检测的筛查方法〔1〕。联合检测食管癌组织MSI和LOH，寻找其与肿瘤发生之间的关系，国内尚未见报道。本文拟研究MSI、LOH与人类食管癌生物学行为和病理类型之间的关系及其与食管癌患者预后的关系。 1 材料与方法 1.1 研究对象 我所采用标本均取自2001年8月,2002年8月在我院胸外科行食管癌手术切除的病例，共30例，其中男17例，女13例;年龄42,72(平均62.2)岁。每1病例取肿瘤中心部位的癌组织及远离癌组织5 cm以上的食管正常黏膜，离体标本手术切除后立即置于液氮中，然后转移至-80?低温冰箱中保存。 1.2 引物设计 选取3号染色体短臂上D3S1067和18号染色体长臂上D18S58两个基因位点，其引物设计参考基因文库，由上海生工生物工程公司合成。D3S1067 3p21.1,3p14.3引物1:5′TCATCTATCTCCCAACTGTTGAG3′，引物2:5′GAGCACTACCTGTTTAAGATAGG3′，95 bp。D18S58 18q22.3,18q23引物1:5′GCTCCCGGCTGGTTTT3′，引物2:5′GCAGGAAATCGCAGGAACTT3′，144,160 bp。 1.3 实验方法 1.3.1 标本基因组DNA的提取 酚,氯仿异戊醇法提取基因组DNA，溶于TE缓冲液，-20?保存。 1.3.2 DNA的浓度测定及纯度判定 取1.5 μl DNA溶液，用无菌蒸馏水稀释1 000倍，以蒸馏水做空白对照，在紫外分光光度计上读取A280和A260的光密度值，按下列公式计算浓度:DNA浓度μg/ml,(A260×50×稀释倍数),1 000;DNA纯度的测定:A280,A260比值介于1.7,2.0。 1.3.3 MSI位点引物的PCR扩增 PCR反应体系(体积25 μl):10×反应缓冲液(Mg2+Free) 2.5 μl;MgCl2 1.0 mmol/L(扩增D3S1067) 或 0.8 mmol/L(扩增D18S58);4种dNTP 混合物(美国Promega公司)各100 μmol/L;模板DNA(上海生工生物工程公司)1.0 μg(扩增D3S1067)或0.1 μg(扩增D18S58);上下游引物(上海生工生物工程公司)5 pmol/L 1.0 μl(扩增D3S1067)或12.5 pmol/L 0.5 μl(扩增D18S58);TaqDNA聚合酶(华美生物工程公司)1.5 U(扩增D3S1067)或0.9 U(扩增D18S58);三蒸H2O补至25 μl。将反应管置于PCR扩增仪中，按下列条件进行扩增:D3S1067:?预变性94?，3 min;?变性:94?，30 s;退火:59?，30 s;延伸:72?，30 s;40循环;?72?延伸5 min。D18S58: Http://Www.Yaokuo.Com ?预变性94?，5 min;?变性:94?，45 s;退火:59?，30 s;延伸:72?，45 s;35循环;?72?延伸10 min。 1.3.4 PCR产物的电泳及显色 将PCR产物8 μl与适量6×凝胶加样缓冲液混合，加样于7%变性聚丙烯凝胶，在60 V电压下进行电泳30 min。电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部，切断电源，将凝胶小心剥入EB溶液中，室温染色30 min。弃去EB溶液，用三蒸H2O冲洗凝胶3次，将凝胶移至凝胶成像系统光源上，观察摄影。 1.4 结果判定 将肿瘤组织与相应正常组织PCR产物同时上样比较，若肿瘤的某一等位基因出现条带的增多或位置的改变，则判定为MSI;若肿瘤的某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上，则判定为LOH。 1.5 统计学方法 采用SPSS10.0软件进行χ2检验，以实验数据的95%可信区间为正常值范围。 1.6 生存率统计 术后随访5年，统计其生存率。 2 结果 2.1 微卫星DNA多态位点MSI、LOH检出情况 30例食管癌及正常组织中，D3S1067和D18S58两个位点均正常的有18例，8例在D3S1067位点出现MSI，为26.7%，9例在D3S1067位点出现LOH，为30%，频率较高;6例在D18S58位点出现MSI，为20%;4例在D18S58位点出现LOH，为13.3%;2例在两个位点同时存在MSI、LOH阳性(见表1)。食管癌中3号染色体，尤其是3p14,3p21位点，MSI、LOH的频率较高。 2.2 MSI、LOH与食管癌临床病理特征的关系 食管鳞癌和小细胞癌MSI阳性率之间的差别显著(P,0.05)(见表2，图1，图2)。食管小细胞癌LOH阳性率虽高于食管鳞状细胞癌，但其差异不显著(P,0.05)(见表3,图1,图3)。病理分级中MSI和LOH的阳性率差异不显著(P,0.05)。食管癌标本中有区域淋巴结转移的MSI和LOH阳性率与无区域淋巴结转移的阳性率差异不显著(P,0.05) 。癌组织侵及黏膜、黏膜下层和肌层标本MSI和LOH阳性率与侵及全层和食管外组织标本的阳性率差异不显著(P,0.05)(见表2、表3)。 图1 食管癌组织基因组DNA图像照片(略) N:正常食管黏膜组织;T:食管癌组织;M:MSI等位基因增多的条带 图2 MSI聚丙烯酰胺凝胶电泳图像照片(略) N:正常食管黏膜组织;T:食管癌组织;L:LOH等位基因消失的条带 图3 LOH聚丙烯酰胺凝胶电泳图像照片(略) 表1 30例食管癌组织MSI和LOH阳性率比较(略) 表2 MSI与食管癌临床病理类型之间的关系(略) 与鳞癌比较:1)P,0.05 表3 LOH与食管癌临床病理类型之间的关系(略) 2.3 MSI、LOH与食管癌患者预后的关系 对所有30例患者术后随访，失访4例，16例术后肿瘤复发，其中14例死于复发的食管肿瘤。16例复发者中MSI阳性5例，LOH阳性7例，4例MSI、LOH均阴性。7例术后出现局部脏器转移(MSI 3例，LOH 2例，二者均阴性2例)，9例发生肿瘤的远处转移(MSI 3例，LOH 4例)。10例患者生存5年以上，无明显复发征象(MSI 5例，LOH 3例)。MSI及LOH阳性率与食管癌患者术后5年生存率无明显差异(P,0.05)。 3 讨论 近年来，在参与肿瘤发生、发展的相关基因中，除癌基因和抑癌基因外，另一种癌相关基因，即错配修复基因(mismatch repair gene，MMR)越来越成为学者们研究的热点，而作为MMR突变子表型的MSI〔2〕更成为研究中的焦点。 Http://Www.Yaokuo.Com 微卫星(microsatellite，MS)是指一类不编码，数量可变，简单串联式的核苷酸重复序列，由2,6个核苷酸组成，多位于基因编码区附近〔3〕，呈遗传稳定性。MS通过改变DNA结构，与特异性蛋白结合发挥基因调控作用，是基因重排和变异的来源〔4〕。MSI是指由DNA复制错误(replication errors)引起的简单重复序列的改变，表现为肿瘤组织与其相应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变〔5〕。MSI最早在1993年发现于遗传性非息肉性结肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)，后又陆续在胃癌、胰腺癌、小细胞肺癌〔6〕、膀胱癌〔7〕、鼻咽癌、甲状腺癌 〔8〕等肿瘤中发现。迄今为止，几乎每一类型的肿瘤都已被证明有MSI存在。产生MSI的主要原因是MMR功能缺陷，不能正常地发挥错配修复作用，增加了整个基因组的不稳定性，从而促进肿瘤的发生。 某等位基因的基因型由杂合状态变为半合性(hemizygosity)、纯合性(homozygosity)或零和性(nullizygosity)称为LOH。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段缺失。这是人类肿瘤基因组中常见的遗传学改变。MS多态位点与抑癌基因紧密连锁，探讨LOH现象，有助于研究肿瘤发生发展过程中的隐性遗传变化及其机制〔9〕，开展肿瘤预测，开拓基因治疗。 国内外文献报道不同病理类型的食管癌均能检测出不同程度的MSI阳性率:Barrett食管并发食管腺癌仅有低水平的MSI表现〔10〕，食管鳞状细胞癌MSI的阳性率为40.3,〔11〕，小细胞癌为100%〔11，12〕。同时，食管癌的发生与DNA复制错误密切相关，MSI更易发生在食管小细胞癌中，而不易发生在食管腺癌〔13〕，而各期食管癌MSI阳性率相接近，MSI与各项临床病理生理参数无关。本实验结果显示MSI的发生与食管癌的临床病理分型关系密切。不同类型食管癌MSI所起的作用可能不同，而其在小细胞癌的发生中可能起着更为重要的作用。在本研究中，食管鳞状细胞癌MSI的阳性率为26.1%，与Nakashima报告的13%〔12〕和Ogasawaras报告的60%〔13〕有差异，这与所选择的多态位点和组织标本不同有关。Ikeguchi对25例原发食管癌研究发现，55% 的D3S1067位点发生LOH，10例没有MS位点改变的食管癌患者，其3年无瘤生存率为75%，高于另外10例有MS位点改变的食管癌患者(48%)，这提示有多个MS位点改变的食管癌有更强的转移倾向〔14〕。 本研究所选择的D3S1067和D18S58两个染色体位点均有较高的MSI、LOH检出率。李卫东等〔15〕在D9S156、D3S1480、D3S647、D9S176、D2S170、D17S518、D7S286等位点检测到了MSI较高频率的阳性。显示了MSI分布广泛，高度多态，在食管癌中普遍存在，并较易检测，此特点为规模性普查提供了条件和可能。 p16、pRb和野生型p53是公认的抑癌基因。Mathew等〔16〕发现基因错配修复基因(RER)阳性的食管鳞状细胞癌与p16/pRb缺失密切相关。他们选取2p、3p、16q染色体上7个位点检测食管鳞状细胞癌的MSI，发现这些位点存在MS的改变。临床上RER阴性病人的预后明显好于RER阳性病人。同时他们还发现MSI和p53突变无相关性，这说明对RER阳性病人来说，MSI是独立于p53的一个癌变途径。以上结果说明MSI与RER有可能是食管癌的一种潜在易患因素〔16〕。 本研究显示，D3S1067位点(3p14.3,3p21.1)的LOH例数为9例，频率为30%(9/30)，明显高于D18S58位点(18q22.3,18q23)LOH频率的13.3%。D3S1067位点跨越基因FHIT(3p14.3)。FHIT与多种消化道肿瘤有关。有研究提示，LOH还与肠道肿瘤的侵袭性正相关〔17〕，提 Http://Www.Yaokuo.Com 示3P位点上LOH在食管癌的发生过程中起重要作用。根据Knudson的"二次打击"学说，癌 的发生需要抑癌基因的一对等位基因均发生改变。所以食管癌特异性抑癌基因若有一个等位 基因发生改变，则该个体就是食管癌易感个体。如果在食管癌标本的某一染色体位点检测出 频发的基因改变，则此位点附近可能存在抑癌基因。深入分析3P位点DNA分子结构与食 管癌的关系，对于明确食管癌发生分子机制，绘制食管癌基因异常"图谱"有重要意义。 Ogasawaras等〔13〕认为各期食管癌MSI阳性率接近，与除组织学类型外各项临床病理、 生理参数无关，与本实验结果相一致。Matsuura〔18〕的研究提示LOH与肿瘤的组织学病 理类型相关。而我们的结果显示D3S1067和D18S58位点MSI及LOH与病理分级、临床分 期、有无区域淋巴结转移、癌组织浸润深度等因素均无显著相关性。由此推断，MSI极有可 能发生在食管癌的早期，是食管癌发生过程中的一个早期分子事件，并贯穿于食管癌发生、 发展的全过程，但未参与食管癌细胞的分化和侵袭过程，与食管癌预后无明显关系;LOH 对预测食管癌预后的作用有限。但MSI、LOH在预后评估方面的确切意义尚需进一步扩大 检测样本例数和临床随访来证实。 【参考文献】 1Debniak T，Kurzaawski G，Gorski B,et al.Value of pedigree/clinicaldata，immunohistochenistry and microsatellite instability analyses in reducing the cost of determining hMLHl and hMSH2 gene mutations in patients with colorectal cancer〔J〕.Eur Cancer，2000;36:4954. 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