复方贞术调脂方中抑制HMG-CoA还原酶表达成份筛选

复方贞术调脂方中抑制HMG-CoA还原酶表达成份筛选 复方贞术调脂方中抑制HMG-CoA还原酶表 达成份筛选 [摘要]目的筛选复方贞术调脂方(FTZ)中抑制HMG-CoA还原酶(HMGCR)mRNA表达的活性成份。方法体外培养人肝癌细胞株HepG2,以复方中单味药材提取物给药,MTT法检测确定各提取物的给药浓度范围,再进行给药干预,24 h后提取细胞总RNA,RT-PCR法检测HMGCR mRNA表达的变化。结果丹参中丹酚酸类成份对HepG2细胞HMGCR mRNA表达具有明显的抑制作用,且呈一定的剂量依赖性;丹参酮类成份则具有一定的促进作用;其它提取物对细胞HMGCR mRNA表达无明显影响。结论FTZ的丹酚酸类成份中含有抑制HMGCR mRNA表达的活性成份。 [关键词]复方贞术调脂方; 活性成份; HMGCR ; mRNA表达 [中图分类号]R914.1[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515(2010)-8-147-01 复方贞术调脂方是郭姣教授治疗高脂血症的经验方,临床应用多年,调脂疗效确切。前期实验研究表明,该方对饮食性高脂血症大鼠具有降低血TC、TG、LDL-C,升高HDL-C、 1 LPL的作用[1]。检测大鼠肝脏脂质代谢相关基因表达及活性,发现该方能够抑制肝组织中HMGCR基因的表达作用。但由于复方成份比较复杂,其中影响HMGCR基因表达的成份及其作用的机制目前还不清楚。为进一步明确复方中影响HMGCR基因表达的成份,深入研究该方调脂作用机制,阐明“调肝降脂”新理论。本实验对该方的主要成份分别进行提取,筛选确定对HMGCR基因表达有影响的活性成份。 1材料与方法 1.1 主要仪器与试剂H-DMEM培养基(GIBCO公司);胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、Trigol、RT-PCR通用试剂盒、DNA ladder(鼎国生物技术有限公司);2X power Taq PCR master mix、UltraPower核酸染料(bioteke)。高速冷冻离心机(德国EPPENDORF);LB940型酶标仪(德国borthold);T-Gradiant PCR仪(德国biometra);Thermal cycler PCR仪(AB公司)。G box凝胶成像仪(英国GENE公司);EV265电泳仪(美国heofer公司);水套式二氧化碳培养箱(美国shellab公司)。 1.2材料HepG2细胞由中山大学干细胞与组织研究中心提供。女贞子、三七、黄连、丹参等药材购自广州致信药业有限公司。 1.3方法 1.3.1细胞培养HepG2细胞接种于75cm2培养瓶中,用 2 含10%胎牛血清的H-DMEM中,待细胞生长融合>80%时,用0.25%胰酶消化,进行传代培养。 1.3.2药物成份提取与配制根据组方药物成分的理化性质,分别提取女贞子中三萜酸、三七中三七总皂苷、黄连中总生物碱、丹参中丹参酮和酚酸类化合物。女贞子三萜酸用DMSO溶解,黄连总生物碱则用盐酸酸化的水溶解,其他提取部位则用无血清DMEM配制成饱和溶液。用时稀释。 1.3.3药物的细胞毒性试验取对数生长期细胞离心后,用含10%FBS的H-DMEM培养液调整细胞浓度为5×104/ml,接种于96孔培养板中,于5%CO2、37?培养箱中培养过夜。各处理组按2倍梯度稀释的方式加不同浓度药物提取成份,分别设空白对照组、溶剂组和四个浓度梯度组,每组均设3个平行孔,培养24 h。实验终止前4 h 加入MTT 20μl/孔,继续培养4 h。弃去培养液后,每孔再加入DMSO 150μl,摇床上震荡10 min后,在酶标仪上测定490 nm处的吸光度值(A值)。比较不同浓度药物对细胞活力的影响,细胞存活率%=(1-用药组平均A值/空白对照组A值) ×100%,存活率?95%,则认为在该浓度范围内,药物对细胞活力没有明显影响。 1.3.4实验分组将处于对数生长期的细胞接种至6孔板中。根据MTT测试结果确定最高给药浓度后,再稀释2倍,按2倍浓度梯度稀释给药。实验分组为:空白对照组、溶剂组、3个药物处理组。 3 1.3.5RT-PCR检测HMGCR mRNA表达分别收集处理24 h的各组细胞,用Trigol试剂提取总RNA备用。按照逆转录说明合成cDNA。利用Primer5.0软件目的基因HMGCR和内参β-actin的引物。委托invitrogen公司合成,具体序列如下:HMGCR引物上游序列 为:5?-AACTCCTCCTTACTCGATAC-3?,下游序列为5?-ATAGATACACCACGCTCAT-3?,扩增长度为226 bp;β-actin引物上游序列为:5?- ACGTTGACATCCGTAAAGAC-3?,下游序列为 5?-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3?,扩增长度为203 bp。按照通用型RT-PCR试剂盒说明书逆转录总mRNA,制备成cDNA。取逆转录产物0.5μl,用2×power Taq PCR master mix及相应的引物扩增目的基因。PCR扩增反应条件如下:95?预变性3 min,95?变性30 s,58?退火30 s,72?延 伸45 s,循环35次;最后一个循环结束后72?延伸5 min。产物与EB替代物混合后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳;凝胶成像分析仪上观察电泳结果并照相,以HMGCR与β-actin扩增产物的灰度比作为HMGCR的相对表达量,用gene tool软件进行定量分析。 1.3.6统计分析各样本HMGCR与β-actin的比值以(x?s)表示,并进行t检验。 2结果 4 2.1 药物的细胞毒性实验MTT结果显示,女贞子三萜酸在?250μg/ml范围内、三七总皂苷在?1.14 mg/ml范围内、 黄连总生物碱在?62.5μg/ml范围内、丹酚酸在?1.3 mg/ml 范围内、丹参酮在?500μg/ml范围内对细胞活力均未见明显影响。 2.2 不同提取成份对HMGCR mRNA表达的影响RT-PCR结果显示:(1)与空白对照组和DMSO溶剂组比较,各浓度女贞子三萜酸给药组对细胞HMGCR mRNA表达无明显影响,见表1。(2)与空白对照组比较,各浓度三七总皂苷提取部位给药组对细胞HMGCR mRNA表达无明显影响,见表2。(3)与空白对照组比较,各浓度黄连总生物碱提取部位给药组对细胞HMGCR mRNA表达有轻度的抑制作用,但无统计学差异,见表3。(4)与空白对照组比较,各浓度丹酚酸提取部位给药组对细胞HMGCR mRNA表达有明显的抑制作用,见表4和图1。(5)与空白对照组比较,各浓度丹参酮提取部位给药组对细胞HMGCR mRNA表达有轻度的促进作用,但无统计学差异,见表5。 表1女贞子三萜酸提取部位对HMGCR表达的影响 表2三七总皂苷提取部位对HMGCR表达的影响 表3黄连总生物碱提取部位对HMGCR表达的影响 表4丹酚酸提取部位对HMGCR表达的影响 注:与空白对照组比较,*P 5 本研究结果显示,丹参中丹酚酸类成份对HMGCR基因表达有明显的抑制作用;表明FTZ调节HMGCR表达作用与丹参中丹酚酸类成份有关。而有研究者利用autodock技术对复方丹参中HMGCR抑制活性成份进行虚拟筛选,认为丹参中含有潜在的HMGCR抑制性成份[2]。这与本研究结果一致。本研究结果虽然没有发现其它提取成份对HMGCR基因表达有明显影响,但有研究表明女贞子三萜酸的主要活性成份齐墩果酸具有改善内脏脂质沉积和抗氧化的作用[3-4];三七总皂苷能够降低ApoE-/-小鼠血脂水平从而预防动脉粥样硬化[5];黄连总生物碱的主要成份小檗碱对LDLR有上调作用[6]。这也从一定程度上反映出FTZ的调脂作用是多种成份通过对多个靶点和环节的调节实现的,以及“调肝降脂”理论的科学性。本研究证实了FTZ抑制HMGCR表达的作用来源于丹参中丹酚酸类成份。这为今后进一步深入研究FTZ抑制HMGCR的调控机制奠定了基础。 参考文献 [1] 唐春萍,郭姣,杨超燕,等.调脂灵对高脂血症大鼠脂代谢酶及载脂蛋白的影响.广东药学院学报,2007,23(2):175-177. 6 [2]盖伟,张燕玲,艾路,等.利用Autodock 筛选复方丹参方 中HMG-CoA 还原酶抑制活性成分.中国天然药 物,2010,8(1):51-56. [3] de Melo CL,Queiroz MG,Fonseca SG,et al.Oleanolic acid, a natural triterpenoid improves blood glucose tolerance in normal mice and ameliorates visceral obesity in mice fed a high-fat diet.Chem Biol Interact,2010,185(1):59-65. [4] Wang X,Ye XL,Liu R,et al.Antioxidant activities of oleanolic acid in vitro:possible role of Nrf2 and MAP kinases.Chem Biol Interact,2010,184(3):328-337. [5] Liu G,Wang B,Zhang J,et al.Total panax notoginsenosides prevent atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice: Role of downregulation of CD40 and MMP-9 expression.J Ethnopharmacol,2009,126(2):350-354. [6] Abidi P,Zhou Y,Jiang JD,et al.Extracellular signal-regulated kinase-dependent stabilization of hepatic low-density lipoprotein receptor mRNA by herbal medicine berberine.Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005,25(10):2170-2176. 7 8