无精、严重少精症患者细胞遗传学和Y染色体微缺失研究_26390

无精、严重少精症患者细胞遗传学和Y染色体微缺失研究_26390 无精、严重少精症患者细胞遗传学和Y染色体微缺失研究 [标签:来源] 作者:杨丽，彭亮，胡小平，焦海燕，党洁，陈银涛，钟慧军，陆宏 【摘要】 目的 探讨无精、少精及严重少精症与染色体核型异常和Y染色体无精子因子(AZF) 微缺失的关系。 采用常规外周血淋巴细胞染色体制备方法和多重聚合酶链反应技术，对 136例(无精症98例，少精症24例，严重少精症14例)男性不育患者进行细胞遗传学和分子 遗传学检测。结果 染色体异常检出率为25%(34/136)，其中无精症占19.9%(27/136)，少精 症占2.2%(3/136)，严重少精症占2.9%(4/136);Y染色体AZF缺失率6.6%(9/136)，其中无 精症占5.1%(7/136)，严重少精症占1.5%(2/136)。结论 染色体异常和Y染色体微缺失是男 性不育的主要遗传因素，Y染色体异常与AZF缺失之间有一定关系。 【关键词】 无精症;严重少精症;染色体异常;AZF微缺失 Abstract: Objective To investigate the relationship between chromosome abnormalities and Y chromosome microdeletion of azoospermia factor (AZF) in patients with azoospermia and oligozoospermia. Methods Both routine periphearl blood lymphocytes cytogenetic analysis and detection of AZF region microdeletion of Y chromosome by multiplex PCR were carried out in 136 infertile men, including 98 patients with azoospermia, 24 patients with oligozoospermia and 14 patients with sever oligozoospemia. Results Chromosomal abnormalities were found in 34(25%) cases including 27 azoospermia, 3 oligozoospermia and 4 severe oligozoospermia. Microdeletions in AZF region were found in 9 ( 6.6% ) cases. The incidence of AZF microdeletion was 5.1% and 1.5% in patients with azoospermia and severe oligozoospermia respectively. Conclusion The findings indicated that chromosomal abnormality and AZF microdeletion might be important genetic causes for male infertility. AZF microdeletion might be associated with Y chromosome abnormalities. Key words:azoospermia; severe oligozoospermia; chromosome abnormality; azoospermia factor microdeletion 育龄夫妇中约10%,15%患有不育(WHO 1987)，而由男性因素引起的不育约占这一比例的 50%,1,。男性不育的病因复杂，较常见的有感染性、器质性和遗传因素等。遗传因素(染色 体异常、Y染色体微缺失和基因突变等)所引起的精子发生障碍约占男性不育病因的30%,2,。染色体核型异常是目前证实的男性不育的常见遗传病因之一。随着Y染色体长臂1区1带的无精子因子(azoospermia factor, AZF)的发现，Y染色体微缺失与男性不育的关系日益受到重视。本研究对无精、少精及严重少精症患者进行了染色体和AZF缺失性检测，其与男性不育的关系，并初步探讨Y染色体异常与AZF缺失之间的关系。 1 材料与方法 1(1 研究对象 136例无精、少精、严重少精患者来自宁夏医科大学遗传咨询门诊，年龄19,44岁，平均年龄(28.7?4.5)岁，所有患者均结婚2年以上，女方妇科检查正常，并未采取任何避孕而其妻不能受孕，不孕时间为2,7年。精液分析及无精症、少精症、严重少精症诊断,按世界卫生组织(WHO)推荐方法和诊断进行,3,，即连续2次精液检查分析并经离心沉淀均无精子者为无精症，精子密度,20×106/mL者为少精症，精子密度,5.0×106/mL者为严重少精症。所检136例患者中，无精症98例、严重少精症14例、少精症24例。另外选择5例已正常生育的男性为对照。 1(2 细胞遗传学检查 取外周血3mL，经肝素抗凝后进行常规淋巴细胞培养，染色体制备，G显带。每例分析20个中期分裂相，3,5个G显带核型，核型异常者加倍分析或辅做C显带分析。 1(3 Y染色体AZF缺失性检测 1(3(1 DNA提取 抽取外周血3mL，EDTA抗凝。严格按照全血细胞DNA提取试剂盒(H.Q.&.Q.Blood DNA Kit，安徽优晶生物工程有限公司生产)说明进行DNA提取，-20?保存。 1(3(2 AZF缺失性检测 Y染色体微缺失检测试剂盒购自上海透景生命科技有限公司，根据欧洲男科协会(European Academy of Andrology, EAA)和欧洲分子遗传实验预控网(European Molecular Genetics Quality Network, EMQN)检测指南推荐方法进行多重聚合酶链反应(multiplex PCR)。每次实验均以无菌蒸馏水和位于Y染色体短臂(Yq)的睾丸决定基因(SRY)为内对照，并选择正常生育男子DNA样品为阴性对照。每个AZF区域设置2个序列标签位点(STS)。AZFa为SY84、SY86;AZFb为SY127、SY134;AZFc为SY254、SY255。所有DNA样品均经2次多重PCR完成，称为Multiplex A和B，每次多重PCR均包括AZFa、b、c区域的STS和对照基因引物。在Multiplex A中完成SRY、SY254、SY86、SY127的扩增;在Multiplex B中完成SRY、SY84、SY134、SY255的扩增。反应条件为:基因组DNA1μL，预混液10μL，引物混合液9μL，体系为20μL。扩增条件为:95? 3min，95? 30s，59? 30s，72? 30s，35个循环，最后72?延伸10min。取PCR产物8μL加2μL 6×上样缓冲液，充分混合均匀后经3.0%琼脂糖凝胶电泳(恒压130V)40min，用Gel Doc2000凝胶成像系统进行DNA电泳条带的观察。 2 结果 2(1 细胞遗传学检测结果 136例无精、少精及严重少精症患者中共发现染色体明显异常34例，异常检出率为25% (34/136)，其中11例为Klinefelter's syndrome (47, XXY)，占异常检出率的8.09% (11/136);46, XY (大Y，Y ?18)患者10例，占异常检出率的7.35% (10/136 );46, XY (小Y，Y ?21)患者10例，占异常检出率的7.35% (10/136);47, XYY患者1例，占0.74% (1/136);46, XY (47, XYY，-9+?)患者2例，占1.47% (2/136)。无精症患者染色体异常检出率为19.9% (27/136);少精症患者异常检出率为2.2% (3/136);严重少精症患者异常检出率为2.9% (4/136)。结果见表1。表1 无精、少精及严重少精症患者染 色体核型分析结果(略) 2(2 AZF缺失性检测结果 136例无精、少精及严重少精症患者中共发现Y染色体AZF微缺失9例，总缺失率为6.6%(9/136)，其中无精症患者AZF微缺失7例，缺失率为5.1%(7/136);严重少精症患者缺失2例，缺失率为1.5%(2/136)。24例少精症患者未发现AZF微缺失。9例微缺失患者AZF各区域缺失情况为AZFc微缺失5例，占总缺失的55.6%(5/9);AZFa缺失2例(均为无精子症患者)，占总缺失的22.2%(2/9);AZFb+c缺失1例，占总缺失的11.1%(1/9);AZFa+b+c缺失1例，占总缺失的11.1%(1/9)。四种缺失类型进行PCR扩增电泳检测，结果见图1。无精症和严重少精症患者AZF缺失情况见表2。表2 无精、少精及严重少精症患者Y染色体AZF微缺失类型分析结果(略) 3 讨论 男性不育症患者染色体异常检出率一般在2.2%,33%之间,4,，本文异常检出率为25%，结果与此相符。文献显示无精症患者染色体异常频率为13.7%,15.4%，严重少精症患者染色体异常频率为1.7%,4.6%,5,，本研究中无精症患者异常率为19.9%(27/136)，少精症患者异常率为2.2%(3/136)，严重少精症患者异常率为2.9%(4/136)，与文献报道基本相符，异常率略显增高。本文核型异常者均为性染色体异常，异常类型主要有Klinefelter's syndrome(47,XXY)、大Y(Y?18)和小Y(Y?21)，且大多表现为无精症。大Y和小Y通常被认为是染色体多态性变异，一般不会引起有害的遗传学性状。但是近来的研究表明，染色体多态性与生殖异常如男性不育、精子异常等有关，可以导致不同程度的临床效应,6,。精子发生是一个持续性的分化过程，需经2次细胞分裂，染色体数目减半，细胞形态转变等复杂的变化，多种因子在该过程中严格调控其表达，其中染色体异常尤其是性染色体的异常可能是导致男性不育的主要原因。 Y染色体长臂AZF微缺失也被认为是引起男性生精障碍的另一个常见的遗传病因。有关Y染色体微缺失频率各地区报道不尽相同，缺失率从1%到55%各不相同,7,。本研究中总缺失率是6.6%。大约10%,15%的无精症及5%,10%的严重少精症患者表现有Y染色体微缺失,8,，本研究中无精症患者缺失率5.1%(7/136)，严重少精症患者缺失率1.5%(2/136)，缺失率相对较低，这可能与病例数量偏少有关。9例AZF微缺失患者中，AZFc缺失率最高(55.6%)，这与文献报道相符。有报道显示，AZFa缺失较罕见，本研究中AZFa缺失率22.2%，与文献报道不 符,9,，提示AZFa区可能是宁夏地区不育男性Y染色体AZF区域微缺失的次热区。本研究中 AZFa、AZFb缺失者均表现为无精症，AZFc缺失者则表现为为无精症和严重少精症，与文献报 道一致。Taskiran等,10,认为，AZFa缺失表现为唯支持细胞综合征，并伴有睾丸体积缩小， AZFb 缺失表现为精子成熟障碍，主要停留在精母细胞阶段;Imken等,11,研究表明，AZFc缺失的病理表现从正常到无精子。Y染色体AZF微缺失的频率、位置及程度有所不同可能与 种族、地区性差异、遗传多态现象有关，AZF微缺失的区域不同，患者所表现的临床症状也 不同，所以在不同地区进行Y染色体AZF微缺失的检测具有重要的实际意义。 本研究中9例Y染色体微缺失患者中有5例伴有染色体异常，其中1例是46, XY (大Y)， 为AZFc缺失，临床表现为无精症;1例是46，XY (小Y)，为AZFc缺失，临床表现为无精症; 另1例是46，XY (小Y，Y染色体仅有着丝粒)，为AZFa+b+c缺失，临床表现为为无精症; 还有2例是46，XY (小Y，未见Y染色体异染色质区)，为AZFb+c缺失，临床表现为无精症 和46，XY (小Y)，AZFc缺失，严重少精症。本研究显示细胞遗传学异常时可检出分子水平 异常，两者有一致性，进一步证实男性不育与染色体异常和Y染色体微缺失密切相关。细胞 遗传学和Y染色体AZF缺失分析对辅助生育技术的应用具有指导意义。由于KS患者及AZF基因缺失的个体不能象正常人那样生育，必须通过辅助生育技术如ICSI而受孕，从而可能将 引起精子发生障碍的基因缺陷如AZF缺失人为地遗传给男性后代，因此在对生精障碍的患者 进行ICSI治疗之前有必要常规进行染色体分析和AZF基因缺失分析，对发现有缺失的患者， 应向其说明产生具有相同缺失的男性后代的危险性。 【参考文献】 ,1,Dada R, Gup ta NP, Kucheria K. 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