申克孢子丝菌酵母相的体外药物敏感性研究

申克孢子丝菌酵母相的体外药物敏感性研究 申克孢子丝菌酵母相的体外药物敏感性研 究 论着2011年9月第24卷第9期医学信息 申克孢子丝菌酵母相,的体外药物敏感性研究 胡志敏朱帆 【摘要】目的:检测申克孢子丝茵酵母相对7种抗真茵药物的体外敏感性.方法: 应用美国临床与化研究所(CLSI)颁布的M27一A2方 案检测l5株临床分离的中克孢子丝茵对伊曲康唑,特比萘酚,氟康唑,酮康唑,咪康 唑,两性霉素B及5一氟胞嘧啶的体外最小抑茵浓度(MIC).结果: 特比萘酚对中克孢子丝茵酵母相的体外敏感性最高,几何平均值为0.144,其次为 酮康唑0.710.氟康唑与5一氟胞嘧啶的敏感性较差.分别为16和 15.47.结论:特比萘酚对中克孢子丝茵酵母相有较高的抑茵活性.至于是否具有较 好的体内治疗效果,需要进性体内体外抗真菌的相关性研究. StudyofInVitroAntifungalSusceptibilitiesofYeast— likeFormsofSporothrixschenckiitoSevenAntifungalAgents HuZhiminZhuFanl Dept.ofBiologyofPathogenic,BasicMedicalScienceCollegeofWuhanUniversity,Wuhan430071,China 【Abstract】0bjective:Todeterminetheantifungalsusceptibilitiesoftheyeast— likeformsofSpomthfixschenckii:Methods:15clinicalisolatesofSporo. thrixschenckiito7drugsusingamicrodilutionmethod.Thesusceptibilitywasapprovedbyth eCommitteeofIntemationalLaboratoryStandards(CILS).Results :TheMICsofTerbinafineweresignificantlyhigherthanothersfortheyeast— likeforms.Conclusion:TerbinaflnehaveasignificantinhibitionagainstSpomthrix schenckiiinvitro. 【Keywords]Sporothfixschenckii;microbrothdilutionmethod;Terbinafine 【中图分类号】R379【文献标识码】A【文章编号】1006—1959(2011)09—0024 —01 申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)为侧孢霉双相型真菌,所致孢子 丝菌病为人,畜共患慢性感染性疾病.该菌在自然界为腐生寄生菌.申 克孢子丝菌体外药敏试验的检测方法多采用CLSI颁布的液基稀释法. 由于抗真菌药物体外药敏试验是评价抗真菌药物抗真菌活性的重要手 段,笔者参照M27一A2方案检测申克氏孢子丝菌酵母相对7种抗真菌药 物的MIC值. 1材料与方法 1.1实验菌株:受试菌株共15株,均来自湖北省感染性皮肤病』}缶床 研究中心真菌菌种保藏库.所有菌株均分离自武汉市第一医院皮肤科门 诊皮肤孢子丝菌病患者.标准菌株:ATCC22019模式株,近平滑念珠菌 ATCC22019及克柔念珠菌ATCC6258质控株. 1.2实验药物:检测药物包括伊曲康唑(ITZ),氟康唑(FCZ),特比 萘芬(TSF),两性霉素B(AMB),5一氟胞嘧啶(5一Fc),咪康唑(MCZ)和 酮康唑(KTZ).均购自Sigma公司,所有药物均在有效期内.两性霉素B 纯度为80%,其余均为100%.5一氟胞嘧啶,氟康唑用灭菌蒸馏水配成 1280~g,"mL,其余药物用二甲基亚砜(DMSO浓度100%)溶解,配成 1600~S/mL的贮备液,一2O?保存备用. 1.3实验用培养基:?RPMI1640培养基:缓冲液为三氮吗啉丙磺 酸(MOPS).均购自Sigma公司.按M38一A方案配制,0.2m滤器滤过 灭菌,4?保存.每次使用前校对pH值,控制在(7.0?0.1).用于药敏 试验.?马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)及脑一心浸液琼脂培养基 (BHI)均按照经典方案配制J. 1.4实验操作 1.4.1药物稀释:药物用RPMI1640培养基稀释至2倍实验浓度, 氟康唑,5一氟胞嘧啶的终质量浓度为0.12564tLg/mL,伊曲康唑,咪康唑, 酮康唑的终质量浓度0.0316p~g/mL,两性霉素B终质量浓度0.0158g/ mL,特比萘芬终质量浓度分别为0.0042IXg/mL.将稀释的药物按浓度由 高到低依次加入微量药敏板(96孔酶标板)101列中,每孔IOOIXL.第 11,12列分别加入100,200~L培养基(药物用DMSO稀释者含同浓度的 DMSO).一20?保存备用. 1.4.2菌悬液制备:将受试菌株和质控菌株转种于PDA斜面培养 基上(35?,7d)活化2次后转种子BHI试管斜面培养基上(35?,7d) 活化2次,以保证其纯度和活力.获得灰白色酵母样菌落生长.挑取 BHI试管斜面培养基上灰白色酵母样菌落,接种于装有2mLO.85%生理 盐水的无菌玻璃小瓶中制成混悬液,用血细胞计数板将菌悬液终浓度 调至(0.4,5)x10cfu/mL左右. 1.4.3接种:取制备好的药敏板于室温下溶解,从1l1列依次加人 100p~L菌悬液,11列为生长对照,12列为阴性对照.同时取10txL划线接 种于沙氏固体培养基平皿用于菌落计数. 1.4.4培养及MIc值的判定:菌悬液(0.4,5)×10cfu/mL参照 M27一A2方案进行接种,将96孔反应板封边,35?温箱孵育,第5d观察 记录结果.每株菌重复试验1次.结果判定的前提是阴性对照培养基清 晰,11列生长良好,将每孔生长情况与11列对比,特比萘芬,两性霉素B 及伊曲康唑的MIC值定义为100%受抑制;氟康唑,酮康唑和氟胞嘧啶为 50%受抑制.唑类药物:终点判断可以不含药生长对照孔为准,将不生长 或生长不明显或明显少于生长对照孔的孔定为MIC终点.将沙氏固体 培养基平皿置于35?培养,5d记录菌落数. 1.5质量控制:按M27一A2方案要求,以近平滑念珠菌 ATCC22019,克柔念珠菌ATCC6258进行重复测定,MIC处于质控范围之 内.每次试验均以此2株菌为对照. 2结果 申克孢子丝菌大部分菌株在96孔板的圆孔中呈贴壁生长,所有菌 株3d时生长对照L均出现可见性生长,5d可出现较明显的梯度变化. 所有菌株在药敏板中生长终点清晰,少有拖尾现象.特比萘酚对申克 孢子丝菌酵母相的MIC值最低为0.06g/mL0.5S/mL,几何平均值为 0.144,其次为酮康唑0.25Ixg/mL1Ixg/mE(0.71);氟康唑的MIC值最 高4IXg/mL64g/mL(16),其次为5一氟胞嘧啶8Ixg/mL64p.g/mE(15. 47).结果见下. 表1申克孢子丝菌酵母相微量液基法实验结果(n=15 3讨论 申克孢子丝菌体是一种菌丝腐生相和酵母寄生相的双相真菌.饱和 碘化钾是治疗皮肤型孢子丝菌病的经典药物,但作用机制至今不清楚,并 且具有耐受性差等副作用.近年来,新型抗真菌药物不断问世,免疫受损 的机体感染播散型孢予丝菌病的报道逐渐增多,如何选择高效敏感的抗 真菌药物对于有效治疗孢子丝菌病具有重要意义.我们参照M27一A2 方案进行改良:?该菌生长较缓慢,酵母相培养均需5d才能达到指数生 长期J,因此,我们将试验条件改为酵母相置于35~C孵育5d后判读结 果_4jJ.?增加接种菌量:接种菌的终浓度增加至104—10CFU/ mL,6j.?将96L板置于5%CO2环境中震荡培养,以利于酵母相生 长J.检测结果显示,在临床常用的7种抗真菌药物中,特比萘酚对申 克孢子丝菌酵母相的体外抑菌活性最高,而氟康唑的敏感性最低. 申克孢子丝菌的菌丝或孢子多经破损的皮肤侵入宿主体内后,转化 为酵母细胞形式引起皮肤,皮下组织及器官感染.用酵母相做药敏试验 要完成受试菌株由菌丝相向酵母相的转换,此过程既繁琐又耗时,但是, 应用酵母相进行体外药敏试验更符合病原菌的致病状态,能够更加客观 地反映抗真菌药的临床疗效.有关体外药敏试验结果与临床疗效的相关 性研究较少,目前尚无定论. 参考文献 [1]王端礼.医学真菌学.2005,5(1):493—495. [2]CasaliAK,HamdanJS.Effectsofthreeazolederivativesonthelipids ofdifferentstrainsofSporothrixschenckii[J].CanJMicrobiol,1997,43 (12):1197—1202. 『3]KohlerLM,HamdanJS,FerrariTC.Successfultreatmentofadissemi— natedSporothfixsehenekiiinfectionandinvitroanalysisforantifungal susceptibilitytesting[J].DiagnMierobiolInfoctDis,2007,58(1): 117—120. [4]KohlerLM,SoaresBM,deAssisSantosD,etalInvitrosusceptibility ofisolatesofSporothrixschenckiitoamphotericinB,itraeonazole,and terbinafine:comparisonofyeastandmyeelialforms[J].CanJMicrobi- ol,2006,529(9):843—847. 『5]TrillesL,Fernandez—To~esB,DosSantosLazeraM,eta1.InvitroaD— tifungalsusceptibilitiesofSpomthrixschenckiiintwogrowthphases [J].AntimicrobAgentsChemother,2005,49:3952—3954. [6]NakaiT,UnoJ,IkedaF,eta1.InvitroantifungalactivityofMicafungin (FK463)againstdimorphiefungi:comparisonofyeast—likeandmyce lialforms[J].AntimicmbAgentsChemother,2003,47(4):1376 — 138】 作者单位:430071湖北武汉大学基础医学院病原生物学系 作者简介:胡志敏,男,1979,,医学硕士生,主要从事临床真菌学研究;通讯作者:朱 帆,男,1970,,教授,博士生导师,主要从事神经病毒学研究 一 24—