【doc】非特异性免疫复合制剂对德国镜鲤免疫功能的影响

【doc】非特异性免疫复合制剂对德国镜鲤免疫功能的影响 非特异性免疫复合制剂对德国镜鲤免疫功 能的影响 一 26一中国饲料2011年第g期 非特异性免疫复合制剂 对德国镜鲤免疫功能的影响 天津市水产养殖病害防治中心杨凯李娜 天津市水产研究所孙志景冯守明 天津市大港区水务局渔苇管理所窦华杰 [摘要】以红细胞C3b受体花环率,白细胞吞噬率及人工感染死亡率为评价指标, 研究并比较了非特异免疫复合 制剂与单一非特异免疫物质对德国镜鲤免疫效果.结果明投喂复合免疫制剂试 验鱼的白细胞吞噬率均高于单一非 特异免疫物质试验组(P<0.05)及对照组(P<0.05),其红细胞c3b受体花环率显 着高于对照组(P<0.05);人工感 染死亡率则低于单一非特异性免疫物质试验组及对照组. [关键词】非特异性免疫制荆;C3b受体花环率;白细胞吞噬率;非特异免疫;德国镜 鲤 [中图分类号】$963.73【文献标识码】A【文章编号]1004-3314(2011)08-0026--04 [Abstract]isstudywasconductedtocomparetheeffectsofanon-specificimmunecomplexpr eparationandtwo kindsofsinglenon-specificimmunematerialonimmunityofcommoncarp(Cypr/nuscarpio. specularis】accordingtoleu- coeytephagocyticrate,redcellC3breceptorsaggregatesrateanddeathrateofcommoncarpin fectedartificially.Theresults showedthat:theleucocytephagocyticrateofcommoncarpfednon-specificimmunecomple xpreparationwashigherthan thatofcommoncarpfedsinglenon— specificimmunematerial(P<0.05)andthecontrolgroup(P<0.05).eredcell C3breceptorsaggregaterateofcommoncarpfednon— specificimmunecomplexpreparationwasalsosignificantlyhigher thanthatofthecontrol(P<O.05).Theartificialinfectiondeathrateofnon-specificimmune complexpreparationwaftsig- nificanflylowerthanthatofcommoncarpfeededsinglenon— specificimmunematerialorthecontro1. [KeyWOrds】 non-specificimmunepreparation;redcellC3breceptorsaggregaterate;leucocytephagocyti crate;non- specificlmr/lune;commoncarp(Cyprinuscarpio-specularis) 德国镜鲤(Cyprinuscarpio.specularis)是1984 年从联邦德国引种到我国,经济价值较高,国内消 费和出口量逐年增加(韩娜和金峰.2006).然而, 德国镜鲤在原产地欧洲的饲料,水环境等养殖条 件优良.引入我国后,对我国的肥水,粗饲料的养 殖条件不适应,导致其抗病力很低,易患病,养殖 风险较大(刘明华等,1995).随着人民生活水平及 国际市场准人标准的提升,水产品做到无公 害,无残毒,在鱼类养殖过程中运用非特异免疫技 术,提高鱼体抗病力,进而对疾病进行预防控制, 成为了实现鱼产品的健康养殖生产的关键技术 (陈昌福等,2004;刘红柏等,2004).目前,在德国 镜鲤养殖中,关于单一种类非特异性免疫物质的 基金项目:天津市科委项目(07JCYBJC11900;07JCZD— JC04400) $通讯作者 功能研究及应用技术比较多(张玲和孙修勤, 2004),而将不同种类非特异性免疫物质进行科学 配伍形成复合制剂的研究鲜见报道.为此本试验 对非特异性免疫复合制剂对德国镜鲤的非特异免 疫效果进行研究.以期为非特异免疫复合制剂在 水产养殖中应用提供理论参考. 1材料与方法 1.1材料非特异性免疫物质包括维生素C磷 酸脂盐,B一葡聚糖及非特异性免疫复合制剂(天 津市水产研究所研制,主要原料8一葡聚糖,大黄, 黄芩,黄柏,维生素C磷酸酯).将上述三种非特 异性免疫物质添加到正常鲤鱼商品饵料中制成试 验饵料,添加量为1g/ks饵料.原料均为粒度过 8O目筛的粉剂. 1.2方法 1.2.1室内小水体投喂对比试验试验设3个试 验组及1个对照组,3个试验组分别为:维生素C 2011年第8期中国饲料一27一 组),非特异性免疫复合制剂组(C组).取4个水 族箱,每个水族箱中放养25尾德国镜鲤.连续充 气,每天投喂鲤鱼商品饵料3次,每天换水2次, 换水量为总水量的1/3,待鱼摄食稳定后.试验组 分别投喂3种非特异性免疫制剂饵料,对照组继 续投喂普通商品饵料,试验周期为30d,日投饵 量为:前10d,按鱼体重的10%投喂,接下来10 d,按鱼体重的8%投喂.后10d,按鱼体重的5% 投喂.每天监测水族箱水的理化指标.保持水质稳 定,试验期间水族箱水主要理化指标为:溶解氧 7.1,7.5mg/L,水温23,27?.试验结束后,每 个水族箱中取10尾鱼进行白细胞吞噬率和红细 胞Cb受体花环率的测定,10尾鱼进行嗜水气单 胞菌人工感染试验. 1.2.2室外池塘投喂对比试验试验周期3个 月,试验池为半精养德国镜鲤养殖池塘.试验池 投喂非特异免疫复合制剂饵料,对照池投喂普通 商品饵料,其他养殖及管理方法相同,每10d监 测一次试验池水的主要理化指标.试验结束后,每 个池塘各取鱼l0尾.测定白细胞吞噬率和红细胞 C受体花环率. 1.3非特异性免疫指标的测定 1-3.1白细胞吞噬率鱼尾柄取血O.3mL.放人 肝素处理过的离心管中,加0.3mL金黄色葡萄 球菌悬液(6x10cell/mL),置28?培养箱中保温 30min,每隔10min摇一次,取出后1500r/rain 离心5min.弃去上清液.取表层制成血涂片.自 然干燥,甲醇固定3min,姬姆萨染液染色,奥林 帕斯BH2显微镜下观察(x400).每份血样镜检 计数两片,连续计数100个白细胞,计算白细胞 吞噬百分率,后取平均值.计算式如下: 白细胞吞噬率/%=(吞噬了菌的白细胞数/观 察记录的白细胞总数)xl00 l_3.2红细胞C受体花环率鱼尾柄取血0.5 mL,放人肝素处理过的离心管中,加等量生理盐 水(O.85%)稀释后,用生理盐水洗涤两次(2000r/ rain,5min),然后,配制成红细胞悬液(1.25xl0 cell/mL).取50L红细胞悬液等体积的致敏酵 母(1.25x10ce|l/mL)混匀.20clC水浴30min后. 加入0.25%戊二醛溶液50l,混匀.取细胞悬液 一 滴推片,干燥,甲醛固定,姬姆萨染液染色,奥林 帕斯BH2镜检(x400).以一个红细胞结合两个或 两个以上酵母菌者为一个C3b受体花环.计数 200个红细胞,计算花环百分率. 1.4嗜水气单胞菌人工感染试验取4个水族 箱,分别放养室内试验结束后的对照组,投喂维生 素C磷酸脂盐,B一葡聚糖和复合制剂的德国镜 鲤,每箱放养1O尾鱼,试验组编号与室内投喂试 验相同.采用肌肉注射感染法进行嗜水气单胞菌 人工感染试验,经预试验,确定注射菌悬液浓度为 3.0~10CFU/mL,每2.5g鱼体重注射0.O1mL菌 悬液.水温26?,连续充气,每天换水一次,换水 量为总水量的1/3,计数鱼死亡数,72h后,计算 其死亡率. 1.5数据处理用SPsS13.0统计软件的成对t 检验,对投喂不同饵料的德国镜鲤非特异免疫指 标的差异性进行比较. 2结果与分析 2.1室内小水体试验试验结束后.检测并比较 各组德国镜鲤的白细胞吞噬率和红细胞C3b受体 花环率.结果见表1. 表1室内投喂非特异免疫制剂 德国镜鲤和对照鱼非特异免疫指标 注:同列数据屑标罕母不l司表不差异显着(尸<0.05). 由表1可以看出.A组,B组和非特异性C组 白细胞吞噬率和红细胞C3b受体花环率均显着高 于对照组(P<0.05),并且C组白细胞吞噬率均 高于A组和B组.另外,C组德国镜鲤的红细胞 C3b受体花环率高于A组,低于B组,三者差异不 显着. 2.2嗜水气单胞茵人工感染试验结果见表2. 由表2可以看出,肌肉注射嗜水气单胞菌72h 后,A组,B组和非特异性免疫复合制剂C组的死 亡率均低于对照组(死亡率100%),且C组死亡 率最低. 2_3室外池塘投喂对比试验室外投喂非特异 免疫复合制剂试验结束后,试验组和对照组德国 镜鲤养殖结果以及抽样检测鱼体白细胞吞噬率和 红细胞Cb受体花环率结果见表3. 一 28一中国饲料2011年第8期 表2室内投喂非特异免疫制剂 德国镜鲤和对照鱼嗜水气单胞菌人工感染结果 由表3可以看出.试验组白细胞吞噬率显着 高于对照组(P<0.05),而红细胞C3b受体花环 率虽然高于对照组,但差异不显着(尸>0.05).另 外,试验池生产结束时的鱼成活率达到97%,平 均规格1.15kg/尾.平均亩产613.5kg,对照池鱼 成活率为92%,平均规格1.05k尾,平均亩产 531kg,试验池养殖效果优于对照池. 表3室外投喂非特异 免疫复合制剂对比试验结果 3讨论 非特异免疫制剂的应用是实现健康养殖的关 键技术,到目前为止,未见有关德国镜鲤非特异性 免疫复合制剂的研究报道.有关单一非特异免疫 (葡聚糖,壳聚 物质研究表明,微生物源的多糖类 糖和脂多糖)可以显着提鱼类的溶菌酶活性和白 细胞的吞噬作用,从而增加鱼体非特异性免疫能 力,然而,微生物多糖不具备增加鱼体抗应激能力 的作用(徐海华等,2007;Bauln等,1996);中草药 及其提取物(大黄,黄芩,黄柏,大蒜,枸杞和金银 花等)对鱼类的非特异性免疫力具有明显的提高 作用,同时具有明显的抑菌作用,然而,其抗应激 作用不明显(刘红柏等,2O04;简纪常和吴灶和, 2002:ChenChangfu等,2000);营养因子类抗应激 物质(维生素C,维生素E)可以显着提高养殖鱼类 的抗应激能力.增强鱼体抗病力,但是其非特性免 疫作用不明显(梁萌青等,2005;蔡中华等,2001). 与人类等高级哺乳类动物相似,有颌鱼类包 括大多数海洋鱼类的免疫系统都具有先天性的或 称为非特异性的免疫系统(聂品,1997),以及获得 性的或称为特异性的免疫系统(Feng等,2009), 存在于淋巴组织或循环血液中的白细胞是参与这 些反应的主要细胞.白细胞中的吞噬细胞通过对 体内异物代谢产物的吞噬作用来参与鱼类的先天 免疫(冯守明等,2008;周永灿等,2003).例如,当 细菌,病毒等病原侵人机体进入血液后,这类白细 胞即可以通过胞吞作用将病原颗粒吞噬.另外,红 细胞表面受体也可以通过黏附作用达到鱼体对病 原生物的非特异免疫作用(冯守明等,2008;蔡完 其和轩兴荣,2003),因此,多数学者将自细胞吞噬 率及红细胞C3b受体花环率可以非特异鱼类非特 异性免疫力的评价指标(冯守明等,2008;蔡完其 和孙佩芳,1995).根据上述学者的研究结果,本文 将红细胞c3b受体花环率,白细胞吞噬率作为德 国镜鲤非特异性免疫评价指标. 室内小水体及室外池塘投喂试验结果显示 (表l,表3),在相似养殖条件下,投喂非特异性免 疫复合制剂德国镜鲤的白细胞吞噬率均显着高于 对照组,同时高于投喂维生素C磷酸脂盐和B一葡 聚糖的德国镜鲤.红细胞花环率显着高于对照组. 与投喂维生素C磷酸脂盐和B一葡聚糖的德国镜 鲤的红细胞花环率无明显差异,这表明该非特异 免疫复合制剂可以有效的提高的德国镜鲤白细胞 吞噬能力及红细胞受体黏附能力.非特异性免疫 效果显着优于单一物质.对提高德国镜鲤的非特 异性免疫能力具有明显作用. 室内嗜水气单胞菌人工感染试验显示(表 2),投喂非特异性免疫复合制剂德国镜鲤的人工 感染死亡率明显低于对照组以及投喂维生素C 磷酸脂盐和B,葡聚糖组;同时,室外池塘投喂复 合制剂德国镜鲤的成活率高于对照池;上述结果 表明,该非特异免疫复合制剂可以明显提高德国 镜鲤的抗病力,同时能够有效地提高德国镜鲤的 养殖效果. 4 本研究在前人研究成果的基础上,将不 同类型的非特异免疫制剂进行科学配伍,形成鱼 类非特异免疫复合制剂,通过比较不同试验组德 国镜鲤的红细胞C3b受体花环率,白细胞吞噬率, 嗜水气单胞菌人工感染死亡率以及室外养殖试验 效果,表明该复合制在提高德国镜鲤的非特异性 免疫能力及养殖效果方面具有明显作用. 参考文献 【1】蔡完其,孙佩芳."四大家鱼"对暴发性流行性鱼痛的抗病力的种问差 2011年第8期中国饲料,29一 (上接第25页) 顾小根(1986)研制的防治奶牛隐性乳房炎的中草 药制剂TC一16,对防止干奶期乳房炎的发生和治 疗具有一定的效果.木村直美等(2003)用复方黄 连组方(黄连,蜂胶,制乳香,制没药)和复方大青 叶组方(大青叶,五倍子,制乳香,制没药)制成的 中药乳头药浴剂.经63例252个乳区的临床试验 证明对奶牛隐性乳房炎均有较好的疗效. 中药内服,西药乳室注射和肌肉注射法对奶 牛隐性乳房炎均有疗效,但乳室注射操作不方便, 对乳头,乳管也有刺激,肌肉注射会产生应激反 应,因此,中药内服具有疗效最佳,使用方便,价格 低廉的优点. 由此可见.中草药在治疗奶牛乳房炎方面有 较大潜力.目前,已经有多种产品出现,一些中草 药制剂及提取物制剂已经在奶牛乳房炎的防治方 面发挥了重要作用.有的治疗效果与青霉素等抗 生素相当,有的效果还优于抗生素.由于中草药治 疗乳房炎是通过提高机体非特异性免疫功能和抗 菌功能来实现的.因此,开展中草药防治奶牛乳房 炎不但是可持续畜牧业发展的要求,也是人们提 高生活质量和对绿色食品消费的要求. 参考文献 【1】杜爱芳,蔡渭明,胡松华,等合成鱼腥草素对奶牛乳房炎致病菌的抑茵 作用U]中国兽医科技,1997,27(3):37,38. 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