精子DNA碎片对IVFET结局预测价值研究

精子DNA碎片对IVFET结局预测价值研究 1 分类号: 密级: 学位类别: 科学学位口专业学位团 学校代码: 学号: 学科门类:医学 又洱酱科史峥 .广硕士学位 ’ 论文目:精子碎片对.结局预测 价值的研究 .一级学科:临床医学 二级学科:妇产科学 论文作者:张帅 指导教师:张云山教授 天津医科大学研究生院 二。一三年五月2 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外,论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名: 逯竺 日期: 年月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定, 即:学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文,并编入有关数据库。 保密口,在??年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密团。 请在相对应的方框内打??,,’ 学位论文作者签名: 建.擎 日期: 年皇月了日 导师签名:孕坦生日期:年妒日3 天津医科大学硕士学位论文 中文捅要 近二十年来,由于环境污染、饮食习惯改变、精神压力等诸多因素影响, 不孕症发病率在全球范围内逐年增加。世界卫生组织调查研究表明,发达国家 中约有%%的夫妇受到不孕症困扰,而发展中国家一些地区不孕症的人数约 占总人数的%。据不完全统计,中国育龄夫妇中不孕症患者约占%%【, 且呈逐年增加趋势。有学者指出,人类自然生育能力正遭受严 重威胁和损害, 不仅表现在不孕症患者数量的急剧上升,还表现在不孕症病因的多样性、复杂 性等方面,且某些不孕症的病因还尚未被完全阐释,即所谓不明原因不育。传 统的药物和手术方法已经不能满足患者对生育的要求,辅助生殖技术的出现给 部分不孕症夫妇带来了希望。 目前我国的不孕症发病率约为/%,其中%是由男方因素引起的。 现在已知的可引起男性不育的病因有生精机制缺陷、先天性双侧输精管缺如、 精索静脉曲张、免疫性因素、染色体畸变、性功能障碍、隐睾、感染、外伤、 肿瘤、放化疗、内分泌疾病等【】。但临床医务人员必须面对这样一个事实,仍有 约%的男性不孕患者无法找到明确病因,即不明原因性不育。一直以来,精 液常规是用于判断男性生育力最基本的临床指标。但是近年来,随着辅助 生殖技术及实验室检测技术的快速发展,精液常规分析已经不能作为预测男性 生育力的最佳指标,况且约有%的男性不育患者其精液常规检查是正常的【引, 因而有必要探讨新的男性不育评价指标。近年来,随着分子生物学技术发展, 使得精子检测方法也逐渐完善成熟,因此成为近几年的研究热点,并 且认为是一个新的评价精液质量和预测生育能力的指标。众所周知,精子细胞 核遗传物质完整性不仅对维持男性正常生育能力至关重要,同时它还关系到子 代健康【。由此可知,对精子核碎片状况进行研究显得十分重要。虽然目 前对精子碎片化的研究正处于初步探索阶段,而且其具体发生机制也尚未 完全明确。但现有的一系列研究结果显示【,刀,其在辅助生殖技术领域中仍有较 大的预测价值。本研究采用精子染色质扩散实验对例接受体外受精 的男性进行精子碎片检测,分析了对受精率、卵裂率、优质胚胎 率、生化妊娠率、临床妊娠率的影响,以评价对结局的预测价值。 目的:本研究拟通过探讨精子对体外受精 ,? 受精率、卵裂率、优质胚胎率和妊娠结局的影响,评价精子对结局的4 天津医科大学硕士学位论文 预测价值。 方法:采用改良精子染色质扩散实验对例接受?男方进行 精子检测,并根据精子值将上述患者分为:组.%、 组.%%、组%,根据单因素方差分析统计方法 分析各组受精率、卵裂率、优质胚胎率和妊娠结局差异。 结果:与组比较,组和组正常形态精子率、精子前向活动力%、 卵裂率、优质胚胎率均降低. 组,. 组,与组比较, 组正常形态精子率、精子前向活动力%、卵裂率、优质胚胎率均降低 .;与组比较,组和组受精率均降低. 组,. 组,与组比较,组受精率降低.;、、三组问生化 妊娠率、临床妊娠率差异无统计学意义.。 结论:精子碎片率升高不仅会导致精子前向活动力下降,还可导致 受精率、卵裂率、优质胚胎率下降,但对临床妊娠结局无明显影响。 关键词: 精子染色质扩散实验精子碎片 男性不育 体外受精受精率 临床妊娠率 5 此 ,也,, .%. %%. ,%~ % ’ 、? .. .., ’ ’.%~ %,% . ,,撕, ,,,,,, .%, ..% ... 6 天津医科大学硕士学位论文 . ’... .,,,. .: ?.: , : .%, .% 茎%, %. ,,,. :, % 【. ,. , ,% .; , . ,. ;, .,, ,..7 天津医科大学硕士学位论文 :,? ,, , .8 天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要??? 缩略语 前言? 日舌? 研究现状、成果? 研究目的、方法? 对象和方法 .研究对象.研究方法.统计学方法? 结果 .三组一般资料和部分精液常规参数比较? .三组患者受精结局的比较讨论 .精子碎片化的主要机制.用于检测精子碎片的主要方法 .精子碎片对.结局的影响讨论 结论? 参考文献发表论文相关情况说明附图? 绢;述? 精子碎片化在男性不育中的研究进展综述参考文献致谢?9 天津医科大学硕士学位论文 缩略语 ? 徽 体外受精.胚胎移植 卵胞浆内 单精子注射 辅助生殖技术 控制性超促排卵 卵泡刺激素 黄体生成素 雌二醇 孕酮 子宫输卵管造影 促性腺激素 促性腺激素释放激素 .促性腺激素释放激素激动 剂 人绒毛膜促性腺激素 人输卵管液 国际单位 胚胎移植 碎片率 秒分钟 毫升10 天津医科大学硕士学位论文 “.微升 原核 精子染色质扩散实验 精子染色质结构分析 末端转移酶介导末 端标记法天津医科大学硕士学位论文 刖舌 研究现状、成果 随着医疗技术的发展,虽然临床医生根据一些必要的辅助性常规检查即可 对大多数男性不育患者做出明确的病因诊断,但仍有约%的男性不育患者无法 找到明确的病因,即不明原因性不育。近年来,有学者提出,精子细胞核 碎片率异常升高可能是某些男性患不明原因性不育的病因。即虽然这些患者的 精液常规检查基本正常,但精液中存在较高比例的结构损伤、碎片率增加 的精子。众所周知,精子细胞核的状况对人类生殖非常重要,即精子 结构和功能的完整性不仅对维持男性生育能力至关重要,还关系到子代的健康。 有研究指出,精子结构损伤比例高可导致男性生育力下降,甚至不育。即 虽然某些受损的精子有可能在受精时形成原核,发生早期的卵裂并最终发 育成正常胚胎,但这种损伤的精子比例如果在%以上,就可能导致卵子 受精率明显下降而成为男性不育的重要因素【,有时尽管胚胎能够成功着床, 但大多数在早期会发生自然流产而最终导致妊娠失败。 因此,精子碎片 化成为近年来男性不育研究领域中的热点,特别是随着不明原因性男性不育 的 患者不断增多,国外部分生殖中心已在男性不育患者中常规开展精子检测, 并用于预测体外受精.胚胎移植.结局。但是由于所用检测方法不同, 不同研究人员所得出的结论存在较大差异。目前临床上常用的检测精子的 方法有:?末端转移酶介导的末端标记法年由 ,:该方法子 】等首先提出,它是一种直接检测精子损伤的方法;?单细胞凝 胶电泳 ,:又称为彗星实验 , 它是一种在单细胞水平上检测真核生物细胞损伤的方法。该方法由 ?在年首先提出,其后经过研究人员的不断改进,逐渐成为当今形式的一 种快速、灵敏、简便的检测精子损伤的方法;?精子染色质扩散实验 ,原理 ,:法首先由百等在年提出【 为精子细胞经过酸变性、去掉核蛋白后,其就会从染色体上解离扩散,如 果精子核的没有损伤不形成碎片,就会扩散形成特征性的光晕。 相反,如果精子核内受损生成碎片时,就不会产生这种特征性的光晕,因天津 医科大学硕士学位论文 此可根据光晕的有无和大小判断精子的碎片率水平;?精子染色质结构分 仇】 析 :法已被当前世界范围内大多 数男科实验室所认可,并用来评估男性生育力情况及预测体外受精和妊娠结局 的关系。它的原理为:受损的精子经过酸性溶液作用后容易变成单链,吖 啶橙 ,与双链结合可发出绿色荧光,而与单链 结合发出红或黄色荧光,然后可通过流式细胞仪进行结果分析引。法被称 为检测精子碎片率的金标准;?吖啶橙染色法,;?断裂的荧光原位杂交法 ,.。由于检测方法较多,以及 不同研究人员的选择倾向不同,以上各种检测方法在国外生殖中心均应用较多。 但由于上述检测方法因原理及判断标准不同而各有优缺点,这也可能是不同研 究人员得出不同结论的一种解释。在年于美国召开的一次《男科学》学术总 指出法、法、法和法是目 结会议中,等【 前公认的优先选择方法。但由于前三种检测方法大都存在操作步骤复杂、耗时 长、所需试剂和仪器设备昂贵等缺点,在一定程度上限制了它们在临床上的开 展。而法是新的检测方法,法首先由缸等在年提出, 后来在年将其方法进行了改进,形成一种试剂盒,采 用瑞士染色法进行染色,在普通光学显微镜下即可观察结果。与其它检查方 法 相比,检测的结果组内差异、组间差异相对较低,并且操作简单、费用低 廉,现在正被国内外越来越多的实验室人员所认可和使用。 研究目的、方法 研究目的:.熟悉、掌握精子碎片的检测方法一精子染色质扩散实验法, 为本中心工作人员临床上常规开展精子检测提供理论基础和实践指导;. 通过精子染色质扩散实验对本中心接受?的男性精子进行精子碎片 分析,并根据精子值的大小参考国外研究分为组,根据单因素方差分 析统计方法分析各组受精率、卵裂率、优质胚胎率和妊娠结局的差异,用 于预测男性精子对妊娠结局的影响。通过分析实验结果,使临床医生能够 更加全面的评估男性生育能力,并指导患者进入试管婴儿周期前的准备治 疗, 进而增加患者获得成功妊娠结局的几率和减少患者的经济负担。 研究方法:采用计算机辅助精液分析仪,按照标准进行精液常规分析;采 天津医科大学硕士学位论文 用苏木素.伊红染色、评分标准进行精子形态学分析旧;按照标准 【】配制人输卵管液,进行上游法处理精液;采用精子染色质扩散实验 对例接受的男方进行精子检测,并根据精子值将上述 患者分为:组.%、组.%%、组 %,根据单因素方差分析统计方法分析各组受精率、卵裂率、优质胚胎 率和妊娠结局的差异。对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 研究对象 选取年月年月期间就诊于天津市中心妇产科医院生殖医学 中心所符合纳入标准的例体外受精.胚胎移植助孕初筛患者为研究对象,年 龄.岁,平均..岁,不育年限平均.:.年。纳入标准: 常规体外受精,新鲜精液标本。 夫妇染色体显带技术检查均为正常核型,男性检查包括男性第二性征、阴 茎、阴囊、精索、输精管、附睾、睾丸等均无异常。 单纯由女性输卵管因素导致不育。 女方年龄岁,助孕次数次。 卵子数?枚。 排除标准: 重度少弱精子症患者。 由于例因各种临床因素取消移植,共计例进入胚胎移植周期, 平均年龄..岁,平均不育年限..年。 研究方法 .主要仪器与试剂 彩色多普勒超声诊断仪 、促性腺激素释放激素激动剂瑚.达必佳,德国辉凌/达菲林,法国益普生 促性腺激素:注射用重组人促卵 瑞士雪兰诺公司 泡激素? 尿促性素 丽珠集团丽珠制药厂 人绒毛膜促性腺激素 丽珠集团丽珠制药厂 取卵负压泵 美国公司 取卵针 美国公司 胚胎移植管 美国公司对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 美国公司 培养箱 日本成茂公司 显微操作系统 深圳博瑞德生物科技公司 包被有%低熔点琼脂糖的载玻片 .%琼脂糖溶液 深圳博瑞德生物科技公司 深圳博瑞德生物科技公司 .%过氧化氢的醋酸溶液 深圳博瑞德生物科技公司 .%十二烷基硫酸钠的. 缓冲液 .%瑞氏色素、.%吉氏色素的甲醇 深圳博瑞德生物科技公司 溶液 深圳博瑞德生物科技公司 ./磷酸盐缓冲液,值.. 深圳博瑞德生物科技公司 .%氯化钠、%吐温溶液 移液器 德国公司 . 加样枪头 德国公司 %无水乙醇 国产分析醇 医用注射器 国产 .实验溶液剂培养液的配制 以下所配溶液均在规定日期内使用, 使用前观察有无沉淀、变色等形状改 变, 所有溶液均使用蒸馏水配制。 人类输卵管液 . 氯化钠 . 氯化钾 .硫酸镁? . 磷酸二氢钾 . 碳酸氢钠 . .葡萄糖 . .乳酸钠液%/ . 丙酮酸钠 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 . 二水氯化钙 第一步:用 上述培养液中加入酚红,青霉素和硫酸链霉 素。 第二步:用/盐酸调节至.。 。 第三步:用纯净水定容至 .精液处理及精液常规分析 一精液标本采集时间:?取卵日前最后一次排精,禁欲天,手淫 法收集新鲜精液于取精杯内,立即放置于?恒温箱内,完全液化后充分混匀 精液标本。上泳法处理精液用人输卵管液按照标准配制,将制备 后精液均分为两份,一份按照标准行精液常规分析;采用苏木素.伊红染 色;按照评分标准行精子形态学分析;另一份用配制调精 子浓度~/用于精子碎片检测,并根据值将上述患者 分为组.%、组.%、组%。 上泳法精子处理步骤: ?在试管中加入精液,然后在精液上方轻轻 加入. 液;?将试管倾斜,孵育小时;?取出最上层的. 液体,加入. 液;离心分钟,弃去上清液;?重悬精 子于. 液中,?孵育。优化分离后的精子悬液分成份,一 份迅速进行精液常规分析及精子形态学检测,另一份进行精子碎片的检测。 二精子形态学检测及精液涂片制备:?用不掉屑的纸巾,用力擦干净磨砂 载玻片的两面;?用中硬度铅笔,在载玻片的磨砂处标记上鉴别信息例 如编号、日期;?根据精子浓度,取~的精液滴在载玻片的一端。用第二 张载玻片沿第一张载玻片的表面拖拉精液滴;?涂片经空气干燥后,染色。 染 秒。.把 色具体步骤:.将涂片浸入到三芳基甲烷固定液 涂片垂直竖立在吸水纸上,以除去多余的溶液;.将涂片浸入快速染液嗜酸 性氧杂葸秒,快速染液嗜酸性硫氮杂苯秒;.用流水浸洗~ 次,以除去多余的染剂。.用吸水纸除去载玻片上多余水分。 三精子涂片的观察 使用倍油镜和倍目镜检测已染色的精子涂片, 将滴折射率?与细胞约.和玻璃..折射率相近的液体, 加在镜头与未封片的载玻片或盖玻片之间时,获得清晰的图像。分别记录精 子 正常形态率和畸形精子数,畸形精子指数畸形精子数/计数精子总数。 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 精子染色质扩散实验操作步骤依照 四精子碎片的检测 试剂盒使用说明书如下: .试剂及室温准备将易熔凝胶管置于。孵育分钟,待完全融化后,将 易熔凝胶管置于。待用从。转移至 需平衡至少后方可使用。 检测前将室温调整至。左右将检测室温控制在。是必须的, 以保证反应体系的可靠性与稳定性。 .标本准备 以生理盐水调整液化的新鲜精子浓度至./。 .检测方法 取精子浓度./的待测标本 ,加入已熔化的易熔凝胶管注意 ?持续保温,充分混匀,?孵育待用。 将包被载玻片置于~。冰箱遇冷后取出,迅速于载玻片包被区域加入 。 步骤制备的精子悬液 迅速非常重要盖上盖玻片勿对盖片施压,尽量避免产生气泡,置 ?冰箱,使其凝固。 从冰箱中取出载玻片,小心移去覆盖在上面的盖玻片,方法:沿盖玻片下端 向前轻轻推动盖片,直至盖片另一端稍稍超出载玻片宽度;捏住盖片的突出 端, 沿载玻片平面轻轻地抽走盖片注意:在移动盖玻片的过程中,盖玻片始终紧 贴于载玻片平面滑动,切不可将盖玻片向上抬离凝胶平面。 将载玻片立即垂直浸入盛有反应液的反应池内,~?准确反应。 取出载玻片,用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体勿接触标本区; 将载玻片立即垂直浸入盛有反应液的反应池内,~?准确反应。 取出载玻片,用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体勿接触标本区; 将载玻片水平浸入大量的纯化水中,期间换水~次。 取出载玻片,用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体勿接触标本区, 将载玻片垂直浸入盛有%乙醇的反应池内,。 取出载玻片,用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体勿接触标本区, 将载玻片垂直浸入盛有%乙醇的反应池内,。 取出载玻片,用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体勿接触标本区, 将载玻片垂直浸入盛有%乙醇的反应池内,。 空气中自然干燥;染片,每张载玻片以瑞氏染液~滴覆盖,稍等片刻 对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 再缓慢加入瑞氏缓冲液滴,以洗耳球轻轻吹打混合染液注意勿破坏染 液形成的表面张力,室温后以流水轻轻冲洗染片。 自然干燥或吹干。 注意事项:使用中注意防止试剂挥发和过度携带污染,反应液、反应液可 重复使用~次;%、%、和%乙醇可反复使用次。已使用过的试剂 不要与未使用过的试剂混合,反复使用几次后再更换新的试剂。可将盛有试剂 的反应池加盖后直接置~?保存,使用前平衡至室温即可。精液中的各类圆形 细胞在经过变性等过程后,形态结构会发生较大改变,很容易与失去尾部结构 的精子相混淆。因此,在计数精子过程中,如果发现细胞体积很大且无精子尾 部特征,则不要将其计入精子之列。若片中精子光晕均较小且颜色较浅,则可 能是因为瑞氏染液染色不充分或瑞氏染液失效所致,可酌情复染;若片中精子 头部与光晕均深染且分界不清,则是因为瑞氏染液染色过度所致,可酌情脱色。 高倍显微镜下观察个精子,计数存在碎片的精子数量。 .结果观察与计算: 精子碎片判定标准:根据标准分级:.大光晕,晕轮?精 子头横径;.中光晕:介于大小光晕之间;.小光晕:晕轮精子头横径/; .无光晕;.退化精子。大光晕、中光晕精子为完整精子,小光晕、无 光晕和退化精子为损伤精子。 .控制性超促排卵及?体外受精.胚胎移植 按常规..长 进行,即从前一月经周期第日起皮下注射.行降调节,达降调节标准 后,同时加用促性腺激素诱导卵泡发育,当个主导卵泡直径三时, 停用.和,根据患者具体情况当晚肌注 ~ 不等, 后在阴道超引导下行穿刺取卵术。取卵当日采用常规方法授精,授 精后~ 观察受精情况。授精 和 观察卵裂情况。见个原核 和第极体为正常受精,见?个、或为异常受精。根据改良的 方法对胚胎进行评级,即受精 胚胎中卵裂球数目?个,细胞大小均匀 或略不均匀,形状规则或略不规则,碎片%为或级胚胎,定义为优质胚 胎;细胞大小明显不均,有明显的形状不规则,胚胎有颗粒现象,碎片占~% 为级胚胎;细胞大小严重不均匀,胞质有严重颗粒现象,碎片%为?级胚 胎,定义为不可移植胚胎;~级胚胎为可移植胚胎,?级胚胎为不可移植胚 胎。采卵后 移植~个胚胎,黄体支持采用黄体酮 /肌肉注射,剩天津医科大学硕士学位论文 对象和方法 余有发育潜能的胚胎行冷冻保存。 .观察指标计算 精子【小光晕精子无光晕精子退化精子 /】%;受精率受精胚胎数/获卵数%;卵裂率卵裂数/? 受精数%;优质胚胎率优质胚胎数/卵裂数%;后 测定血 /确定为生化妊娠, 后超检查宫腔内见妊娠囊确定为 清芝 临床妊娠。统计学方法 采用 .统计软件进行数据分析,计量数据符合近似正 态分布者以均数标准差表示,多组间均数比较采用单因素方差分析, 组间两组比较采用检验;偏态分布者以,表示,组间比较 采用秩和检验;生化妊娠数、临床妊娠数的比较采用四格表卡方检验, .为差异有统计学意义。结果 天津医科大学硕士学位论文 结果 耋口卜 .三组患者一般资料和部分精液常规参数比较 共计例患者进入周期,其中组例,组例,组例。 与组比较,组和组正常形态精子率、精子前向活动力【%】均降低, 、组间差异有统计学意义.,、组间差异无统计学意义.; 与组比较,组正常形态率、精子前向活动力【%】降低,差异有统计 学意义.。组患者的不育时间、禁欲天数、体积、浓度、圆形细胞数 等差异无统计学意义.。 、、三组一般资料及部分精液常规参数的比较夏士 见表 表 表续表 ? 注:卑.表示与组相比; .表示与组相比; .三组患者 受精结局的比较 与组比较,组和组受精率均降低,差异有统计学意义.: 与组比较,组受精率降低,差异有统计学意义.;与组比较, 组和组卵裂率、优质胚胎率降低,、组间差异有统计学意义., 、组间差异无统计学意义.;与组比较,组卵裂率、优质胚胎 率降低,差异有统计学意义.;、、 组间生化妊娠率、临床妊娠 天津医科大学硕士学位论文 结果 率差异无统计学意义.。 、、三组受精率、卵裂率、优质胚胎率、生化妊娠率、临床妊娠率的比较 士见表 注:木.表示与组相比; 撑.表示与组相比;讨论 天津医科大学硕士学位论文 讨论 .精子碎片化的主要机制 近年来,精子碎片化逐渐成为男性不育研究领域的热点问题,特别是 随着不明原因性男性不育患者的不断增多,国外部分生殖中心已在男性不育 患 者中常规开展精子检测,并用于预测结局。一方面,由于所用检测方 法不同,不同研究人员所得出的结论存在较大差异。另一方面,由于目前对精 子发生碎片化的机制尚未完全弄清。因此,对于精子碎片化是否影 响受精率、胚胎发育、临床妊娠率等尚存争议【 。目前,众多研究表明【,,,, 许多环境因素和疾病均可诱发精子链的损伤、断裂,具体包括:有害射线 辐射、空气污染、环境毒素、吸毒、吸烟、精索经脉曲张、生殖道感染、激 素 水平异常、睾丸温度过高、高热、肥胖等。然而以上众多因素导致精子发 生碎片化的机制主要包括以下种: ?氧化应激 ,是指发生在需氧机体内的一种病理性效 应。一系列研究表明,氧化应激与人体许多疾病状态有关【,包括男性不 育、衰老、动脉粥样硬化、癌症、肝脏疾病、风湿性关节炎、艾滋病、毒素及 农药化学制品暴露等。据此可知,一部分男性不育症可能是伴随着身体其它疾 病出现的。年等【首先提出,人类精子对氧化应激特别敏感,并推 测其可能与男性不育相关。即精子暴露于过量的活性氧分子环境中,可造成其 细胞质膜中多聚不饱和脂肪酸的过氧化,引起多聚脂肪酸中双键的破坏,而这 些双键对于维持精子膜的流动性又是必不可少的。因此,氧化应激可导致精子 细胞膜结构受损,并且还能够引起两种严重的“连锁反应”:一方面,引起精子细 胞膜结构受损,精子细胞的代谢功能受到抑制、甚至丧失,促进精子细胞凋亡, 引起精子细胞核碎裂、核碎片增多等;另一方面,精子细胞膜的结构破坏, 就会导致精子核直接暴露于精浆中活性氧类物质中主要是精浆中白细胞 产生,导致精子遭受正面攻击而引起大范围的单链、双 链断裂、破坏,引起精子遗传物质结构受损、功能缺陷而导致男性不育。近年 来,国内外众多研究表凋】,男性不育患者中精子碎片率指数与精液 中水平呈明显正相关,并且对上述患者施以精索静脉曲张结扎术后,精子 碎片率指数显著下降,其接受的助孕结局也明显改善。 天津医科大学硕士学位论文 讨论 ?精子发生过程中的染色质组装异常:精子作为男性的配子生殖细胞,其 染色体和数量仅为体细胞一半,这是精原细胞进行染色质组装、平均分配 到两个精子细胞的结果。然而,精子核染色质的组装过程容易受到机体内外环 境有害因素干扰而出现异常,进而导致精子遗传物质方面缺陷。正如早期研究 所指出,随着精子发生进程的开始,精子细胞核就会发生一系列复杂的结 构和生化功能方面变化,尤其在精子发生周期中期时,伴随着核组蛋白被鱼精 蛋白替代,精子核凝集程度大大增加,进而形成精子超螺旋结构。然而在 超螺旋无限制的折叠压缩过程中,就不可避免地引起双链之间存在 扭曲应力幽 。正因如此,为了能够减少精子双链间扭 曲应力的不利影响,以便促进鱼精蛋白与链的黏合附着,链需要在 其特定位点进行“解链”以及后来的酶修复连接使之恢复正常结构。因此, 有研究 人员认为,精子碎片的出现是精子发生过程中一种正常生理现象,而且受 精后卵母细胞对其有一定的修复作用,其对预测结局的预测作用十分有限 ?。但也有学者指出,精子染色质包装的过程十分精细复杂,很容易被来自内 外环境的各种有害因素所干扰,甚至引起精子单链不能正常修复超过其 修复能力,进而导致精子双链碎片的产生和染色质结构的破坏,而且, 这一现象已在动物研究中证实【,。 ?精子异常凋亡:细胞凋亡,又称为程序性细胞死::: ,是真核生物有核细胞的一种主动性生理性过程【?,它是细胞在一定 生理、病理条件下发生的以细胞核碎裂为主要表现的细胞死亡。早期研究人 员 即已发现,凋亡细胞的核内能被内源性核酸内切酶分解为一些分子量较小 的双股寡核苷酸片段。而后来,研究人员在其建立的动物实验模型中【】, 人工 敲除小鼠端粒酶催化亚基基因以诱导其进入细胞凋亡应激状态,发现其精子 碎片率程度是其实验前的倍。研究人员推测,小鼠精子碎片率显 著增加可能与其凋亡应激状态有关。因此,由于精子发生碎片化机制的复 杂性、多样性,且男性个体之间存在遗传方面的差异性,也就导致其抗氧化能 力不同,进而导致不同程度的精子功能受损和生育力下降。例如,等采用 法对例接受的男性精子进行检测,并根据检测结果分为 %组和%组,结果显示两组之间的受精率、卵裂率并无明显差别 ‘。另外,等【】采用法直接检测例接受的男性精子 序列的完整性,结果表明增多并不影响体外受精与临床妊娠率结局。而天津 医科大学硕士学位论文 讨论 等【恃有不同观点,他们指出精子受损、碎片增多在不明原因性不 育男性患者中的比率较高,可能为男性不明原因不育的一种解释。这与 等研究结论存在着一致性,即他们认为精子碎片增高会导致男性生育力出 现异常,同时还指出精子碎片比例如果在%以上,就可能是男性不育的 重要因素】。另外,我们还可以从等【】的研究结果中找到更有力的论据 支持,即他们应用法对例/的患者进行检测分析后,结果 表明精子与正常受精率、胚胎质量、着床率呈显著的负相关。而 等【】研究认为,之所以上述研究人员得出不同结论,其原因可能是他们大都 采 用对精液标本原液包括形态正常、异常精子和凋亡精子、圆形细胞等行 检测,即如果对上泳法处理后制备精子行检测,其检测结果则与真实 水平比较接近。另外,等研究结果还显示,男性精子.%时, 其受精率约为.%组的.倍。由此看来,检测精子在预测 结局方面,应该有其重要的临床意义。 .用于检测精子碎片的主要方法 目前,用于检测精子的方法主要有:末端转移酶介导的末端标 记法. 、单细胞凝胶电泳 ,、精子染色质 扩散实验 ,、 精子染色质结构分析,、吖啶橙染色法, .、断裂的荧光原位杂交法 ,?等。上述检测方法因原理及判断标准不同而各有优缺 点,这也可能是不同研究人员得出不同结论的一种解释。正如上面所述, 法可对精子的断链直接进行检测,其原理为:精子断裂是以其脱氧 核苷酸链中的 , ~磷酸二酯键打开而产生 一磷酸基团和 一羟基为 特征的一种损伤形式,并且在适当条件下具有一定的修复能力断链的两端可 重新连接,因此可利用末端转移酶将一段预先标记好的核苷酸连接到断裂 片段的 端,然后在光镜下或荧光显微镜下观察精子断裂的情况。 与其它方法相比,该方法不需要经过对的变性过程,简单便捷,而且能同 时检测单链和双链的断裂情况,因此能够真实的反映出精子 的损伤程度。而法则是根据精子损伤后可出现不同大小的 讨论 天津医科大学硕士学位论文 片段,经过去污剂和裂解液处理后,精子细胞核内的碎片、大部分蛋白质 以及其它细胞成分就会渗出细胞膜进入裂解液,然后损伤的片段在电场力 的作用下就会向阳极迁移,从而形成特征性的“彗星”样拖尾,用荧光染料染 色后 在显微镜下进行观察,根据彗星的头尾长度和荧光强度来评估精子细胞的 损伤程度。而和法利用酸变形和去掉核蛋白而间接反映精子染色质 的包装情况来了解其核的完整性。法中如果精子核的没有损伤, 就会扩散形成特征性的光晕。相反,如果精子核内受损时,就不会产生特 征性的光晕,因此可根据光晕的有无和大小判断精子的碎片率水平。而 法现被称为检测精子碎片率的金标准,其原理为:损伤后的精子 经过酸性溶液作用后容易变成单链,吖啶橙与单链结合可发出红或黄色荧 光,而与双链结合可发出绿色荧光,然后可通过流式细胞仪进行结果分析。 目前国外研究中,等研究认为,法和法检测 结果均与法检测的金标准方法有很强的相关性,即采用以上 种方法对不育男子精子碎片检测的结果与对捐赠精子的检测结果有显著差 异,而用法检测精子碎片在不育男子精子与捐赠精子之间没有显著 差异。同时还指出,法还存在容易出现染色模糊、易褪色,混杂染 色等问题,因此可导致检测结果波动大、检测结果偏高等缺点。因此,从目前 临床应用的情况来看,法与法的相关性不大‘。 指出 而最近在美国召开的一次《男科学》学术总结会议中,等 法、法、法和法是目前公认的优先选择方法。但由于前三 种检测方法大都存在操作步骤复杂、耗时长、所需试剂和仪器设备昂贵等缺 点, 在一定程度上限制了它们在临床上的开展。而法是新的检测方法, 法首先由矗等在年提出,后来在年缸将其方法进行 了改进,形成一种试剂盒,采用瑞士染色法进行染色,在普通光学显 微镜下即可观察结果。与其它检查方法相比,检测的结果组内差异、组间 差异相对较低,并且操作简单、费用低廉,现在正被国内外越来越多的实验室 人员所认可和使用。因此在本研究中,我们采用法对例接受的男 性精子进行检测,并根据和等分组标准分为 .%、.%、%三组,除外例因各种临床因素 取消移植外,共计例进入周期,比较分析了各组之间的受精结局,并评 价了其对.结局的预测价值。另外,我们还采用等研究方法在讨论 天津医科大学硕士学位论文 行检测前预先对精液行上游法处理,能够在一定程度上降低精浆凋亡精子 及圆形细胞的干扰,使检测结果更加接近实际水平,降低假阳性率。 在实验方法建立过程中,我们参考了国内外众多研究人员的方法建议,并 严格按照标准进行试剂的配制、保存,实验过程尽可能地避免不利因素的 干扰。首先,将检测室温控制在?,以保证反应体系的可靠性与稳定性。 早期的预实验结果表明,室温温度过高或过低均会影响实验的裂解过程及结 果 的准确性。再次,反应液、在使用中要防止试剂挥发和过度携带污染,且反 应液和至多使用~次后,需要进行更换新的反应液。且使用过的试剂避 免与未使用过的试剂混合。最后,在载玻片用不同浓度的乙醇进行脱水前, 需 用大量纯化水进行次的洗涤,持续分钟,以利于后面的染色过程。另外, 我们还参考国内陈泯燕等【研究将试验的染色时间适当延长调整为分钟,并 用洗耳球对染色液进行吹打混匀,以保证染色效果的均匀性。 .精子碎片对结局的影响 本研究显示,随着的升高,、、 组精子前向活动力和正常形态 精子率依次降低,且组与、两组问差异均有统计学意义。这与等?】 研究结论相一致,他们认为弱畸形精子症患者精液中通常具有较高水平的活 性 氧类物质 ,,之所以精子与精子活力、形态表 现出负相关性,可能与两者均是精液的潜在氧化攻击对象有关,即精液中 达到一定浓度时,可同时引起精子和膜脂质结构的破坏。另外,国内 万艳等研究认为,还可能与精子损伤导致编码.酶的基因发 生改变、酶变性,水解反应释放能量障碍有关。同时,等【】认为, 精子细胞核内的含量经历一个由少到多的过程,即含量较少时,精子 损伤断裂的区域主要为非蛋白编码区,此时并不会引起精子功能的明显下 降,如果精子损伤的断链不能被及时修复,精浆中有害因素如就 会进一步导致精子的蛋白编码区基因受到破坏,从而导致不同程度的精子 】认为,精子染色质中会导致其结构稳定性的显著 功能缺陷。等【 降低,并可能引起受精过程中雄性原核形成受阻导致受精率降低。另 外,等酬认为如果精子表达微管的基因受损时会导致受精卵卵裂停滞、卵 裂率降低,甚至会使胚胎碎片数量增多进而影响胚胎质量。本研究显示,随着 值的升高,、、 组受精率、卵裂率、优质胚胎率呈逐渐下降趋 天津医科大学硕士学位论文 讨论 势,且组与、两组间的差别均有统计学意义。这与等研究结论 相一致,即精子与其受精能力、胚胎卵裂率、优质胚胎率之间呈负相关性。 另一方面,本研究并未得出与等完全一致的结论,即未显示,, 组间生化妊娠率、临床妊娠率的差异有统计学意义,这可能与本研究样本例 数不够大有关。其次也可能与对精子受精能力、胚胎分裂功能的影响要远 大于受精后胚胎植入及妊娠结局的后续影响等有关【。应该注意的是,胚胎植 入母体子宫内膜后能否正常生长发育取决于诸多因素,例如,母.胎之间的免疫 耐受状态、血液营养供应、环境暴露、母体情绪应激变化等【】,所以我们的研 究结果没有显示出精子与生化妊娠率、临床妊娠率的相关性。天津医科大学硕士学位论文 结论 结论 :口己 从目前众多的研究来看,精子碎片是精子发生过程中的一种正常产物, 其含量占全部精子核遗传物质的比例较小。如果此过程受到外界有害因素干扰, 则可导致精子碎片含量急剧增多,进而导致精子碎片化而导致男性 不育。一方面,从理论上讲,精子细胞核的状况对人类生殖过程至关重要,如 果精子核遗传物质结构遭到破坏,对于生殖结局肯定有负面影响。但另一方面, 精子损伤程度对生殖结局的影响可能与所设定的精子碎片截点值有 关。因此,精子碎片化程度对于受精结果、结局的影响作用究竟有多大仍 是一个值得探讨的问题。而这需要更多研究人员的努力和探索。 综上所述,我们的研究显示,精子影响精子活力和结局,尤其 当%时会导致受精率、卵裂率和优质胚胎率显著降低。因此,对精 液常规检查正常的男性不育患者进行精子检测对指导男性不育的治疗有极 其重要的临床意义。因此,对于不明原因性男性不育患者应该常规检测精子, 根据精子值的高低,再决定是否给予适当的抗氧化治疗及具体治疗方案, 经过抗氧化治疗后再次检测精子,使患者的精子处在或接近正常 界值范围内,再安排患者进入试管婴儿周期,以期增加患者获得成功妊娠的 几 率,从而有助于减少患者在就诊过程中的经济、心理方面的负担和压力。 参考文献 天津医科大学硕士学位论文 参考文献 乔杰,苏萍.生殖工程学【】.北京:人民卫生出版社,,:. ., , 【】: 【】. ,,:?. 潘天明,朱积川,李江源.男科实验室诊断技术】.北京:人民军医出版, ,:?. : , 】 . 】. ,,:?. : , 】 , . ,,:. . , , 【】 , .. ,, :?. ., 【】 , , , 【】. ,,:. . 】? , , , 】. ,,: .. .】 , . ,,:. , , 【】 , . : . 【】. ,,: :. . 【】. , , , 【://..../// . . 【 , , ,天津医科大学硕士学位论文 参考文献 : 】. ,, :. , 】】 .】. ,,:?. . 几, , , :【., ,:. , 】, . 】. ,,:?. , ? 。, . 【】. , ,:?. . 【 】【】. .:?. : 【】世界卫生组织.人类精液检查与处理实验室手册】.第版.北京:人民卫 生出版社,:.. . 】 , 【 ?. ,,: .】 , , , 】. ,,:.., . 【 】 ,. ,,:?. 】 , . : . . , ,: 】 , , ., 【】. ,,:?. . 】 , , .,,:. 参考文献 天津医科大学硕士学位论文 , 【】 . 】. , ,:. , 【】 , , .: . . ,,: ., , 【】 ,. ., ,:. , 【】【】 ,,... 】. 】 , : . 】. , , ., , , 【】 : . ,, :. . , , 【】 , 曲 %. ,, . 】 , , , 【】 . . , : ? . , ., 【 , ? ? , .,, :. 】 , ’ , . 诵 【】. ,, .. ., , 】 ,天津医科大学硕士学位论文 参考文献 . . , :?. , , 】 , . : 阴. ,, :?. ,】 , , .. . ,, : 【】 , , .: .:?. ,, . 】 , ,.,跚 , ,. ,,:?. . 【】 , : 【】 , ,:?. ,】 , , . . ,,:. 【陈泯燕,黄国宁,王亚平,等.精子碎片与体外受精结局的关系】.生 :.. 殖与避孕,, ., ,? ,., , 】 】万艳,苏萍./一酶一影响精子运动的重要因素【】.生殖与避孕, ,:. . 】, : . ,,: ..参考文献 天津医科大学硕士学位论文 . : ,】 . ,,:. , , 】 . , :【】.,, , 】 ., ,. :?. 【会妍,张帅,张云山.胚胎移植前宫腔内灌注在.中的应用及 提高种植率和妊娠率的有关机制】.生殖与避孕,,:?.天津医科大学硕士学位 论文 发表论文和参加科研情况说明 发表论文和参加科研情况说明 在学期间发表论文情况: 张帅,孟啸寅,卓胜楠,崔志英,崔险峰,张云山.精子碎片对 ?结局的影响.天津医科大学学报,,:. 张帅,张云山.精子碎片化在男性不育中的研究进展.山西医药, ,,:?. 王会妍,张帅,张云山.胚胎移植前宫腔内灌注在中的应用及 提高种植率和妊娠率的有关机制.生殖与避孕,,:?.天津医科大学硕士学位 论文 附录‘ 附录 图 实验精子图组×天津医科大学硕士学位论文 附录 图 实验精子图 组×天津医科大学硕士学位论文 附录 图 实验精子图组×综述 天津医科大学硕士学位论文 综述 皇刁孓比 精子碎片化在男性不育中的研究进展 张帅综述张云山审校 摘要:目前对精子碎片的研究正处于初步探索的阶段,且其具体机制 尚未完全弄清。但现有的一系列研究结果显示,其在辅助生殖技术领域中仍 显示 出了巨大的预测价值。本文就近年来关于精子碎片的发生机制、检测技术有 关问题的研究现状,以及精子碎片率增加对辅助生殖结局的影响综述如下。 男性不育 精子染色质扩散实验 关键词: 精子碎片 近年来,不育症的发病率在世界范围内呈逐年上升趋势。我国目前的患病率 约为%%,其中%是由男方因素引起的。现在已知引起男性不育的病因有生 精机制缺陷、先天性双侧输精管缺如、染色体畸变、精索静脉曲张、免疫性 因素、 性功能障碍、隐睾、感染、外伤、肿瘤、放化疗、内分泌疾病等。但临床医 务人 员必须面对这样的一个事实,即仍有约%的男性不育患者无法找到明确的病因 ,即不明原因性不育。随着近年来辅助生殖技术及实验室检测技术的快速发展, 精液常规分析已经不能作为预测男性生育力的最佳指标,而精子碎片化与男 性不育关系成为近几年的研究热点。众所周知,精子细胞核遗传物质完整性不仅 对维持男性正常生育能力是至关重要的,同时它还关系到子代的健康髓。由此可 知,对精子核碎片状况进行研究显得十分重要。虽然目前对精子碎片的 研究正处于初步探索的阶段,而且就其具体发生机制也尚未完全弄清。但现有的 一系列研究结果显示,其在辅助生殖技术领域中仍显示出了巨大的预测价值。本 综述回顾近年来国内外有关精子碎片方面的文献,分析了精子碎片发生 机制、检测技术有关问题的研究现状,以及精子碎片率增加对辅助生殖结局 的影响。 精子碎片种类和形式 从种类来源而讲,精子碎片包括核碎片和线粒体碎片。有相关 研究表明口不育男性的精子细胞核内存在较高水平的碎片率,且与临床妊娠 率、分娩率呈负相关,并且等研究显示,不育男性患者精子细胞质 内存在高发的线粒体损伤;而从碎片形式来讲,精子碎片包括综述 天津医科大学硕士学位论文 单链碎片和双链碎片。迄今为止,研究人员已经认识到的链损伤形式随,郇 包括,全基质模式 、碱基缺失形成无碱基位点、碱基修饰碱基 氧化、烷基化等、交联等。一般情况下,单链碎片较双链碎片更为常见, 且在一定条件下,如果单链碎片不能及时被修复,某些单链碎片会进一 步破坏形成双链碎片,进而会造成断链之间和蛋白质的相互缠绕 而形成较大的“碎片,这既反映出了碎片的产生是一个动态、循序渐进 的过程,也标志着精子损伤的严重程度存在着差异性,其对男性生育能力造 成的影响也有所不同。 精子碎片化的发生机制 .精子细胞核结构特点 作为男性的配子生殖细胞,精子是一种单倍体,故其含量仅是体细胞的 一半。在正常状态下,精子细胞除了合成少量功能蛋白外,基本上处于休止状 态。 与体细胞的核蛋白主要是组蛋白不同口,精子的核蛋白主要为鱼精蛋白,后 者是一种富含精氨酸和半胱氨酸的碱性蛋白。由于精子核带有负电荷,能够 与带正电荷的精氨酸基团之间形成特殊的氢键;另外,半胱氨酸之间可形成 分子 间二硫键而有利于染色质丝的排列稳定。由于以上原因,使得精子核染色质 的密 度要明显高于体细胞,精子头部体积“适当缩小”,生化性质也比较稳定,以 致 能够满足精子穿透卵细胞的能力。然而,也正是以上因素,导致精子细胞核 自身修复能力以及应对内外界环境有害刺激的能力大大降低阳。另一方面,从生 精细胞分化、产生出功能正常的精子是一个很漫长的过程,且受到多种因素的协 调控制,如果机体暴露于某些有害因素环境中,也就更容易造成精子发生过程中 的遗传物质损伤和结构功能异常。 .精子碎片化的发生机制 精子碎片化发生的机制尚不完全清楚,但目前的研究表明,主要与精子 发生过程中遭受有害刺激因素后而引发的氧化应激有关,另外,还与精子发生过 程中异常的染色体组装、精子的异常凋亡有关。 ..氧化应激 氧化应激 ,是指发生在需氧机体内的一种病理性效 应 】。正常情况下,氧气通过参与机体细胞内一系列“生物转化作用”而形成各 种各样的氧化产物某些具有较强的氧化性,同时机体细胞内存在具有一定抗氧