用于治疗杜氏利什曼虫感染病雷西莫特脂质体

用于治疗杜氏利什曼虫感染病雷西莫特脂质体 文献翻译 用于治疗杜氏利什曼虫感染病雷西莫特脂质体 具体目标: 先前应用于治疗皮肤利什曼虫病的咪唑喹啉类药是toll样受体7/8激动剂。由于咪唑喹啉类药具有疏水性,一般不能系统地用于治疗内脏利什曼虫病。我们将论证雷西莫特脂质体,一种咪唑喹啉类药,可以系统地治疗内脏利什曼虫病。 方法, 利用水合作用把雷西莫特裹上一层薄膜,做成脂质体。然后把这种脂质体静脉注射给感染了杜氏利什曼虫病的 BALB/c小鼠 结果, FDA认可的雷西莫特,做成脂质体后在治疗内脏利什曼虫感染病上是很有前途的 关键词,给药 咪唑喹啉 内脏 疗法 前言, 有超过30种利什曼虫可以引起利什曼虫病。世界上大约有1200万人感染利什曼虫病,每年能导致大约有5万人死亡这种寄生虫感染病死亡人数超过了疟疾 依靠利什曼虫的哪一亚种可以感染病人并且发展成皮肤,硕大利什曼原虫、热带利什曼虫和墨西哥利什曼虫,、粘膜,巴西利什曼原虫,或者内脏利什曼虫病,内脏利什曼原虫、杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫,。最致命的是内脏利什曼虫病。内脏利什曼原虫,黑热病,和杜氏利什曼原虫是靠白蛉亚科昆虫传播的。根据前言所介绍的哺乳动物的宿主,杜氏利什曼原虫在皮肤里会被巨噬细胞吞噬而进入体内。因此,他们失去了鞭毛,成为无鞭毛体。杜氏利什曼原虫有能力在巨噬细胞的吞噬溶酶体里存活。于是他们急速增长,随后遍布于血管和淋巴系统。高比例的寄生虫最后将寄生于肝脏,脾脏,骨髓中。如果任由其发展,最后会导致死亡。 在过去的70年里,对于内脏利什曼原虫最常规的治疗方式是系统的注射锑制剂,比如葡糖酸钠或者葡甲胺锑制剂。锑制剂是剧毒的,有很多不利的副作用包括胰腺炎和心率失常。除此之外,一些杜氏利什曼原虫已经对锑制剂疗法产生抗药性,需要发展其他的治疗内脏利什曼原虫的化学疗法。这些疗法包括静脉滴注两性霉素B脂质体注射剂或者口服管制药物米替福新。两性霉素B是剧毒的,需要制成脂质体避免受过效应。而且,随着两性霉素B使用的增加,利什曼原虫已经出现了抗药性。米替福新在临床试验中有82%的治愈率。然而,这个药有致畸作用,他不能用于孕妇或者准备怀孕的妇女。除此之外,两性霉素B也是这样的,而且现在也出现了米替福新抗药性的菌株。由于药物抗药性的增长和目前的这些疗法的用途限制,现在有发展替代的治疗内脏利什曼原虫病方法的需求 一个替代传统疗法,它主要瞄准病原体也就是瞄准寄主——病原体的关系。通过增强宿主的免疫应答,病原体可以被有效的清除掉,同时减少潜在的发展的耐药性。这种策略不仅用于治疗伤寒、结核和真菌感染而且也可以用于治疗利什曼原虫病。以前的文献中也提到过聚糖类,非甲基化DNA,和其他的免疫佐剂能成功的治疗利什曼原虫感染。特别,FDA批准的toll样受体(TLR)7/8激动剂咪唑喹啉在临床试验中已经成功治愈皮肤利什曼病。此外,雷西莫特(图1),一个咪喹莫特衍生品和一个FDA批准分子局部用药,也有望用于治疗皮肤利什曼原虫感染。两个咪唑喹啉诱导干扰素-a(IFN-a),白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素 - 6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在巨噬细胞和单核细胞中产生。Buates 和 Matlashewski 表明雷西莫特通过诱导一氧化氮的产生来降低细胞内利什曼虫的数量对这种寄生虫还没有直接的影响。 因为雷西莫特具有疏水性不能直接体内注射,所以最近我们的团队遵从证明的,将雷西莫特封装在聚合物做成的药物输送载体中。相关数据在这篇手稿将会一一呈现。我们把雷西莫特封装于脂质体载体中去治疗内脏杜氏利什曼虫感染。它毒性会会通过测定一个细胞的生物活性来评定。此外,雷西莫特脂质体的功效测试在定量的杜氏利什曼虫感染了器官的小鼠模型中进行,测定它的细胞因子反应和肝酶水平。 材料与方法 材料, 所有试剂都是购买和使用未经变化的来自Sigma-aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯)除非另有注明。脂质体配方中的脂质膜都是购自Avanti Polar Lipids公司 (美国阿拉巴马州阿拉巴斯特)。水H 2 O是使用密理博(马萨诸塞州，比勒利卡,美国)超纯水整体水净化系统净化的。荧光和吸收性质的获得是与美国俄亥俄州立大学化学和生物化学系友好合作,通过FlexStation 3微孔板监测系统设备(美国利福尼亚州森尼维耳市)测得的。所有通过ELISA,酶联免疫吸附测定,实验细胞因子的试剂都是从BioLegend Inc公司(美国加利福尼亚州圣地亚哥)购买的。 实验动物 年龄在6 - 8周的BALB / c小鼠是购自杰克逊实验室(美国我巴尔港)。年龄在6 - 8周叙利亚金黄仓鼠从哈伦实验室(美国印第安纳波利斯)买来的。动物研究都是和美国俄亥俄州立大学动物保健和使用委员会机构的一致并且得到其的允许。 制备空的或装载雷西莫特的脂质体 脂质囊按照如下配置,三氯甲烷和甲醇9,:1比例作为溶液,然后在里面添加氢化大豆磷脂酰胺,1,2-二硬脂酰-锡-丙三醇-3-,磷脂-1-,丙三醇,,,甘油磷脂,绵羊羊毛,,D-α-维生素E,美国纽约法明德恩佐生命科学机构,。脂质溶液用BuchiR-200旋转蒸发仪,美国特拉华州NewCastle公司,处理。BuchiB-490旋转蒸发仪的水浴温度设为60?。脂质在60摄氏度水浴30分钟旋转蒸发即可成膜。然后再把脂质体冻融三次,然后挤出通过一个80纳米聚碳酸酯膜的阿凡提迷你型挤出机/加热块和过滤11遍然后通过一次性 PD-10 脱盐机。最后把蔗糖加到脂质体,150重量,,中然后冻干, 确定尺寸和把雷西莫特封装在脂质体中 脂质体的尺寸通过动态光散射,DLS,来测定。脂质体悬浮于水上和执行施胶的是使用Nicomp Submicron粒度测试仪型号370,圣巴巴拉,CA,USA,,这就要感谢美国俄亥俄州立大学药学院的罗伯特?李教授。封装雷西莫特在乙醇,1毫克/毫升,溶解3套空白脂质体和瑞喹莫德装载脂质体,并将所得溶液放入耐溶剂96孔板中,一次做三份.标准曲线包括加入到平板后雷西莫特在乙醇中的溶解。平板在激发波长260 nm,发射波长360纳米解读。该荧光读数空脂质体从那些被减去的瑞喹莫德加载脂质体和封装用测定比较与校正曲线的荧光读数。 感染和治疗 杜氏利什曼原虫,LV82菌株,的生长和培养是在只叙利亚种金地鼠体内.BALB/ c小鼠通过尾静脉注射感染1×10 7无鞭毛体。处理过的小鼠连续2周通过尾静脉注射100微升空脂质体,载有雷西莫特脂质体,7.6毫克每只小鼠雷西莫特,或SSG,500毫克/公斤,,阿尔伯特?大卫有限公司,加尔各答,印度,反复进行感染。2周后处死和注射感染过的小鼠。 组织学和用于处理的小鼠杜氏利什曼原虫单元 (LDUs)。 在脾脏和肝脏中的寄生虫负荷量进行按先前描述进行定量。简要地说,肝脏和脾脏的涂片用姬姆萨染色,赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,马萨诸塞,美国,,寄生虫负荷量用显微镜量化。LDU等同于每500个无鞭毛体在肝脏或脾脏繁殖的数量乘以肝脏或脾脏的重量,mg,.寄生虫负载量计数如先前描述进行。简言之,骨髓从BALB / c小鼠的股骨被除去。骨髓涂片用姬姆萨染色和骨髓的LDU的量化等同于脾脏和肝脏。肝脏和脾的切片固定在10,福尔马林24小时,并提交美国俄亥俄州立大学组织学中心用苏木和伊红,H,E,染色和进一步进行组织病理学分析。小鼠感染了杜氏利什曼原虫的器官组织切片,采用H,E染色,并由病理学家进行组织病理分析。肝肉芽肿的评价列举如下,,i,没有反应; ,二,发展繁殖中; ,三,成熟;和,四,空白.样品通过Olympus BX41光学显微镜成像,奥林巴斯,中心谷,巴拿马,美国,。 T细胞增殖和细胞因子的ELISA 如先前所述进行T细胞增殖。简言之,将5×10 5脾脏细胞分成四份添加到无菌96孔中,平底组织培养板中,并用反复冻融过的杜氏利什曼原虫抗原,20毫克/毫升,刺激脾脏细胞。增殖反应测定的采用如先前所述的阿拉马蓝测定法在37摄氏度条件下孵育72小时后收集上清液和然后分析上清液中IFN-γ和IL-10的产量。 测量肝转氨酶酶 血液收集在非肝素化离心管中,并使其在4摄氏度条件下凝块过夜。血清获得后提交俄亥俄州立 市大学的兽医医院血液学化验科,使用COBAS C501血清分析仪,美国印第安纳波利斯罗氏公司,分析血清中的氨基转移酶,ALT,和天冬氨酸氨基转移酶,AST,的含量。 细胞活力 巨噬细胞,RAW264.7; ,美国维吉尼亚州马纳萨斯市,美国型培养菌种集,依据制造商的指导方针进行培养。 杜伯克改良的伊格尔培养基,500毫升;宾夕法尼亚州匹兹堡费歇尔公司,中的补充 有胎牛血清,50毫升;美国巴拿马州匹兹堡 Hyclone 公司,和链霉素,10毫升;美国宾夕法尼亚州匹兹堡费歇尔公司,。巨噬细胞接种于96孔板,使其达到5×10 4个细胞/孔的浓度并可以融合。在细胞已相互附着后,除去培养基并用含有游离雷西莫特,装载有雷西莫特的脂质体,0.312,重量/重量,或空脂质体的培养基,或空白培养基替换。24小时后用MTT法检测细胞存活率。简要地说,每孔的介质都替换为新鲜的培养基,150毫升,和MTT溶液,20微升的5毫克/毫升溶液,。将该板培养直至紫色甲臜晶体已成型.然后解在异丙醇中。在560nm处测定吸光度和背景读数在670nm测量。把用雷西莫特,脂质体雷西莫特或空脂质体治疗细胞的活力与未经处理的细胞进行比较。 结果 脂质体制剂 我们挤压脂质薄膜形成雷西莫特脂质体。通过DLS测量,雷西莫特脂质体的直径y应在75.0?30.7nm。挤出后,脂质体放置在PD-10尺寸的排阻柱,以去除其他未包封的雷西莫特。然后把上述脂质体用冷冻保护剂,蔗糖,冻干。脂质体产量60.4,,而雷西莫特的包封率为7.0,,这样可以得到的脂质体每单位重量的载药量为1.1,。 杜氏利什曼原虫感染的治疗 被感染杜氏利什曼原虫和进行2周空脂质体感染,载有雷西莫特的脂质体或SSG的BALB / c小鼠作为阳性对照。处死小鼠并分析感染2周后小鼠体内的杜氏利什曼原虫含量。图2,a,表明,用雷西莫特脂质体处理过的小鼠的脾脏的LDU值均较用空脂质体处理的小鼠低,P?0.01,。用SSG处理过的小鼠,现行治疗标准,LDU数均比用空脂质体,P?0.0005,和雷西莫特脂质体处理过的低,P?0.003,。在图2,b,,可以注意到,用雷西莫特脂质体处理过的小鼠的肝脏LDU值均用空脂质体处理的小鼠低,P?0.05,。用SSG处理过的小鼠有较低的LDU值比用空脂质体处理的小鼠,P?0.005,或用雷西莫特脂质体处理的小鼠,P?0.03,。在图2,c,中,在用雷西莫特脂质体处理过的小鼠的骨髓中每200巨噬细胞无鞭毛体的数量均比对用空白脂质体处理过的低,P?0.05,,用SSG处理过的小鼠无鞭毛体的数量显著低于用空脂质体,P?0.005,或雷西莫特脂质体处理过的,P?0.03,。 T细胞的增殖和细胞因子 处死杜氏利什曼原虫感染过的BALB / c小鼠,并从中分离出脾细胞。将脾细胞用杜氏利什曼原 虫抗原冲激,72小时,图3,后测定其增殖情况。雷西莫特脂质体处理过的小鼠增殖与那些用空脂质体,P?0.01,处理相比表现出了较高的水平,而那些与用SSG处理的阳性对照物比用空白脂质体处理过有较高的增殖率,P?0.0005,,并显示与用雷西莫特脂质体,P?0.06,处理的小鼠相比有相似的显著增殖率。 用雷西莫特脂质体处理的小鼠的IFN-γ水平显著高于用空脂质体P?0.00005,或SSG,P?0.00005,处理的小鼠。用雷西莫特脂质体处理的小鼠的IL-10水平在统计学上也显著高于用空脂质体(P?0.0005)或SSG (P?0.005)处理的小鼠,图4,。 在体外生存能力，组织学和肝脏酶的活性 RAW巨噬细胞用不同剂量的雷西莫特培养,其范围是0.04至5微克/毫升,图5,。用雷西莫特或雷西莫特脂质体培养的巨噬细胞生存能力并没有显著不同。5微克/毫升的雷西莫特的增殖率比空脂质体高,P?0.05,.在两个最低浓度,0.07和0.03微克/毫升,用雷西莫特脂质体培养的巨噬细胞的生存能力比用空脂质体的高,P?0.05,。 肝脏ALT,图6a,和AST,图6b,酶分析显示出,ALT在雷西莫特脂质体,P?0.05,和SSGP?0.05,组都有呈现出显著低水平;然而,上述两组的AST水平无显著差异。此外,在组织学层面, 上,用空脂质体和雷西莫特脂质体处理的小鼠的肝脏和脾脏的炎症反应或毒性没有明显差异,数据未示出,。 讨论 免疫治疗在治疗内脏利什曼虫病上是一种很有前景的方法。此前有研究表明,TLR受体激动剂如CpG用来治疗内脏利什曼虫感染是具有可行性的。 15我们建议使用TLR7 / 8激动剂雷西莫特治疗内脏利什曼虫感染。以前的研究已经表明,一种类似的化合物,咪喹莫特,成功地治疗皮肤利什曼病27, 28。 不幸的是,通过全身给药,无论是咪喹莫特和雷西莫特在水性环境中都是高度不溶的。我们假设,将雷西莫特做成脂质体后,可用于TLR 7/8激动剂的静脉注射来治疗内脏利什曼虫感染。疏水性药物两性霉素B在制剂时已成功的封装于脂质体中,两性霉素b脂质体注射剂,。两性霉素b脂质体可以降低药物毒性和促进药物的全身递送。我们使用了两性霉素b脂质体注射剂类似的制剂,把雷西莫 特用脂质薄膜封装在脂质体中。脂质是通过挤出形成直径大约80纳米的颗粒,这是与两性霉素b脂质体注射剂大致相同的尺寸。 30这个小尺寸的脂质体可以有较长的循环时间和能大量渗透到如肝,脾这些利什曼原虫寄宿的组织。此外,雷西莫特脂质体是有可能被批准用于临床使用,由于我们使用了类似于FDA批准的两性霉素b脂质体注射剂的脂质体制剂和使用了FDA批准的雷西莫特的缘故。 我们以前制定雷西莫特体内应用的工作中使用电喷射微粒制粒,其直径大约是1微米。 22不幸的是,使用电喷射微粒制粒技术或乳液化学作出于两性霉素b脂质体注射剂粒子大致相同的粒径是困难的。以前的研究已经表明,脂质体制剂的粒径大于400纳米的是可以有选择性的被相当于寄生虫容器的骨髓吸收31,这里的骨髓相当于寄生虫容器32,里面的寄生虫可能有助于内脏利什曼虫感染治疗后的复发。今后的工作将研究雷西莫特最佳浓度脂质体制剂应用于肝,脾,骨髓的效果. 本研究中,我们把雷西莫特脂质体静脉注射到感染杜氏利士曼原虫2周后的小鼠体内。我们的结果表明雷西莫特脂质体治疗后,肝,脾和骨髓中的杜氏利什曼原虫的数量与空脂质体处理的小鼠相比显著下跌。作为阳性对照,我们使用了非常高剂量,500毫克/公斤,的SSG,传统剂量,300毫克/千克,。我们可以围绕耐药菌株的形成去开发一种瞄准宿主与寄生虫的关系的免疫疗法。这是有意义的,考虑到在如比哈尔邦,印度等地,已经报道,超过60,内脏利什曼原虫感染的患者使用锑治疗无效。Sane et al 15,表明, CpG 和米替福新在治疗内脏利什曼原虫感染表现出的协同效应可以降低利什曼原虫的载量。未来实验中会联用两性霉素B和雷西莫特,将它们做成脂质体的形式,在治疗利什曼原虫病耐药性上能更显著减少寄生虫载量。 进一步阐述雷西莫特脂质体治疗的特征,取出用利什曼原虫抗原培养的小鼠脾脏,测定其细胞增殖和细胞因子的产量。当与用雷西莫特或空脂质体处理的小鼠相比较,可以发现用利什曼原虫抗原培养的小鼠脾脏细胞的增殖量稍高,但这种差异并没有在用SSG处理的小鼠的脾细胞中观察到。 与用空脂质体或SSG处理的小鼠相比,用雷西莫特脂质体处理的小鼠脾细胞中IFN-γ的产量显著增加。 先前已有研究表明,用雷西莫特进行全身治疗可提高IFN-γ的产量,IFN-γ可以预防和治疗T淋巴细胞2,TH2,过敏反应。33由于用雷西莫特脂质体治疗可以诱导产生高水平的IFN-γ,我们推测这就是雷西莫特如何局部的减少利什曼原虫载量的原因。 IFN-γ对于清除内脏利什曼虫感染是十 分重要的,因为它已报道出, IFN-γ基因敲除小鼠是很容易受到感染的。 34此外,Scott et al. 35表明小鼠耐内脏利什曼虫感染品种与小鼠易感品种相比有大量的IFN-γ。另一方面,用雷西莫特脂质体处理小鼠离体脾细胞可以诱导产生高水平的IL-10。先前的研究表明雷西莫特可同时诱导产生IFN-γ和IL-10,36-38而 Boghdadi et al。 显示当用雷西莫特刺激感染了曼氏血吸虫的患者的外周单核血细胞能产生高水平的IFN-γ和IL-10。 由于C57BL / 6和BALB / c品系IL-10基因敲除小鼠具有很强的抗感染能力,所以IL-10已与增加内脏利什曼原虫感染的发病机制相联系。 40然而,先前的研究也表明,CpG可像雷西莫特那样提高单核细胞中的IL-10的产量。 41,42总体而言,似乎即使用雷西莫特脂质体处理小鼠来诱导IL-10的产生,寄生虫数量任然下降了,这可能与大大提高了IFN-γ的产量有关。 我们以前的研究已经表明,体外注射雷西莫特的饱和溶液0.1微克/毫升,这在刺激免疫细胞上是一种非常有效的佐剂。 28当用高达5微克/毫升的雷西莫特脂质体培养RAW巨噬细胞时,它细胞存活率没有表现出差别。因此我们得出这样的结论,用必要的浓度刺激宿主细胞,雷西莫特的剂量不影响巨噬细胞的生存能力。 Scott et al 43表明咪喹莫特,但不是雷西莫特,通过激活胱天蛋白酶和Bcl-2蛋白依赖性的细胞色素C诱导细胞凋亡.口服的雷西莫特已被用在丙型肝炎IIa期临床试验中;在试验中表现出无毒,只有两个病人因出现流感样症状离开了试验。 我们的组织学研究表明,用空脂质体处理的动物与用雷西莫特脂质体处理的动物相比较,其炎症和毒性反应没有差异。肝酶如ALT 和 AST的升高,表明肝脏有疾病或代表可能对肝脏有损伤。 45 虽然这些酶的水平增加可表示药物在肝脏中对寄生虫起作用了,而通常在血清中肝酶水平的降低是指示疾病的减少。 46与用SSG处理的小鼠相比,我们的雷西莫特脂质体剂型表现为同等的ALT水平,而与用空脂质体处理的小鼠相比ALT水平则显著降低,。可见用SSG或雷西莫特脂质体处理的小鼠ALT水平对于小鼠来说是在在正常范围内; 47然而,所有的组都表现出比正常值更高的AST水平,而来自用SSG或雷西莫特脂质体处理的小鼠样品和用空白脂质体处理的没有什么差异。以后做的研究失去证明被处理小鼠AST水平的提高是指示一个过程还是表明一个疾病的好转。然而,有趣的是,雷西莫特脂质体,与作为当前标准治疗的SSG对肝脏的作用是相同。 结论 总体而言,我们已经表明雷西莫特脂质体在治疗VL上是很有发展前景的。用雷西莫特脂质体治疗可以降低感染了杜氏利什曼原虫的小鼠的肝,脾和骨髓利什曼原虫寄生负的载量。而且,雷西莫特诱导从被感染的小鼠体内分离得到的脾细胞产生IFN-γ和IL-10,并产生抗原。在体外试验报道没有表现明显的毒性,用SSG或雷西莫特脂质体处理的小鼠与用空脂质体处理的小鼠进行比较,前者的肝酶的ALT水平降低。酶水平表明肝损伤减少,这可能是由于寄生虫的水平降的低,用SSG或雷西莫特脂质体处理的小鼠有相似的肝酶水平,表明雷西莫特脂质体制剂具有低的体内肝毒性。今后工作的进行将深入探讨用雷西莫特脂质体处理后被释放的全身细胞因子。 感谢 我们要为使用了他的 NiComp Submicron Particle Sizer Model 370仪器而感谢药学院药剂科的罗伯特?李博士,我们还要为使用了他的Buchi R-200 旋转蒸发仪和 Buchi B-490水浴感谢药学院药物化学科的卡尔?Werbovetz医生的。 资金的提供 这项工作是由卫生部资助的美国国家研究院的支持授予ARS和DARPA W911NF-10-1-0264授予KMA 透明度声明 无申报。 参考文献