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坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中Calpains 和FoxOs 的差异表达及相关性分析

2017-11-18 18页 doc 44KB 38阅读

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坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中Calpains 和FoxOs 的差异表达及相关性分析坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中Calpains 和FoxOs 的差异表达及相关性分析 坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中 Calpains 和FoxOs 的差异表达及相关性分析 中国组织工程研究 第 16 卷 第 7 期 2012 –02 –12 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 12 2012 Vol16 No7 坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中Calpains和FoxOs的 差异表达及相...
坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中Calpains 和FoxOs 的差异表达及相关性分析
坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中Calpains 和FoxOs 的差异表达及相关性分析 坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中 Calpains 和FoxOs 的差异表达及相关性分析 中国组织工程研究 第 16 卷 第 7 期 2012 –02 –12 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 12 2012 Vol16 No7 坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中Calpains和FoxOs的 差异表达及相关性分析?? 巫荣华徐 曼赵攀峰刘 梅 The mRNA alteration and correlation of Calpains and FoxOs during gastrocnemius muscle atrophy induced by sciatic nerve injury and cardiotoxin injection Wu Rong-hua Xu Man Zhao Pan-feng Liu Mei Abstract BACKGROUND The calpain family members Calpains and FoxO transcription factors FoxOs play important roles during Key Laboratory of muscle atrophy Neuroregeneration Nantong University OBJECTIVE To investigate the different expression patterns and correlations of Calpains Calpain 1 Calpain 2 Calpain 3 and Nantong 226001 FoxO transcription factors FoxO1 and FoxO3a during gastrocnemius muscle atrophy induced by sciatic nerve injury and Jiangsu Province cardiotoxin injection China METHODS The gastrocnemius muscle atrophic models were established by sciatic nerve injury and cardiotoxin injection The Wu Rong-hua? mRNA level of Calpains and FoxOs were detected by real time quantitative PCR at 3 7 14 and 21 days after injury The linear Master Key Laboratory regression analysis was performed to conduct the correlations between Calpains and FoxOs of Neuroregeneration RESULTS AND CONCLUSION The expression level of Calpain 1 CAPN1 Calpain 2 CAPN2 and FoxO3a mRNA reached to Nantong University peak at 7 days after sciatic nerve injury and then decreased gradually the mRNA level of Calpain 3 CAPN3 and FoxO1 Nantong 226001 Jiangsu Province reached to peak at 14 days after sciatic nerve injury then declined After cardiotoxin injection the expression level of CAPN1 China CAPN2 and FoxO3a mRNA rapidly reached to peak at 3 days after cardiotoxin injection and then slowly went back down the wuronghua5 mRNA level of FoxO1 found its cli at 7 days after cardiotoxin injection while that of CAPN3 instantly got to its lowest point at 126com 3 days after cardiotoxin injection The result of linear regression analysis showed that there was a significant positive correlation Xu Man? Studying for between the expression of CAPN3 and FoxO1 mRNA r 0901 5 during gastrocnemius muscle atrophy induced by sciatic nerve masters degree Key injury And after cardiotoxin injection the strong positive correlation existed between the mRNA level of CAPN1 CAPN2 and Laboratory of that of FoxO3a r 0898 7 r 0937 4 respectively The present study indicated that the mRNAs alteration of CAPN1 and Neuroregeneration CAPN2 was similar in the two different muscle injury models while CANP3 displayed a different expression pattern Nantong University Nantong 226001 Jiangsu Province Wu RH Xu M Zhao PF Liu M The mRNA alteration and correlation of Calpains and FoxOs during gastrocnemius muscle China atrophy induced by sciatic nerve injury and cardiotoxin injection Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu 201216 7 1173-1179 xuman2011gmail com投稿赚钱 com投稿赚钱 com Wu Rong-hua and Xu Man were considered 摘要 as co-first authors 背景钙蛋白酶家族和 FoxO 转录因子在肌萎缩过程中发挥着重要的作用 目的观察钙蛋白酶家族成员及 FoxO 转录因子 FoxO1 和 FoxO3a 在心脏毒 素注射与坐骨神经夹伤致腓肠肌失功能损伤 Correspondence to Liu Mei PhD Professor 中表达的变化 Key Laboratory of 方法分别采用坐骨神经夹伤和心脏毒素注射建立大鼠腓肠肌功能损伤模型 于造模后的第371421 天取大鼠腓肠 Neuroregeneration 肌进行实时荧光定量 PCR 检测并采用线性回归法进行相关性分析 Nantong University Nantong 226001 结果与结论结果显示腓肠肌组织中的钙蛋白酶 ?钙蛋白酶 ?和 FoxO3a mRNA 在坐骨神经夹伤 7 d 达到高峰随后 Jiangsu Province 下降钙蛋白酶?和 FoxO1 mRNA 在坐骨神经夹伤后 14 d 达到高峰随后下降 钙蛋白酶 ?钙蛋白酶 ?FoxO3a mRNA China liumeintueducn 在心脏毒素注射后第 3 天达高峰随后逐渐下降FoxO1 mRNA 在心脏毒素注 射后 7 d 时达最高而钙蛋白酶? mRNA 在心脏毒素注射后 3 d 时表达显著下降随后逐渐恢复至正常水平线性回 归分析结果显示在失神经肌损伤过程中钙蛋白 Supported by 酶? 的表达与 FoxO1 呈正相关 r 0901 5 在心脏毒素注射肌损伤过程中钙 蛋白酶 ? r 0898 7 和钙蛋白酶 ? r 0937 4 表 Research Program of Education Ministry 达趋势与 FoxO3a 呈正相关可见在不同的肌损伤模型中钙蛋白酶 ?和钙蛋 白酶 ?的表达趋势相似而钙蛋白酶? 的 No208044 Priority 表达不同 Academic Program 关键词坐骨神经夹伤心脏毒素肌萎缩钙蛋白酶家族FoxO1FoxO3a Development of Jiangsu Higher doi103969jissn1673-8225201207009 Education Institutions PAPD Project of Innovation in 巫荣华徐曼赵攀峰刘梅 坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损 伤中 Calpains 和 FoxOs 的差异表达及相 Postgraduate of 关性分析[J]中国组织工程研究201216 7 1173-1179 com投稿赚钱 com投稿赚钱 Nantong University NoYKC09050 Received 2011-12-09 ? m-calpain calpain 2 CAPN2 是普遍存 Accepted 2012-01-04 0 引言 在的钙蛋白酶而在肌肉中特异性表达的 CAPN3 基 因 又 称 Ncl-1 p94 CAPN3 钙蛋白酶是存在于细胞中的依赖于钙离子 n-calpain 是最典型的组织特异性钙蛋白 的中性蛋白酶到目前为止至少14种哺乳动 酶[1-4] 钙蛋白酶在体内通过Ca2激活及自溶 物 的 钙 蛋 白 酶 已 被 报 道 其 中 钙 蛋 白 酶 而表现出蛋白水解酶的活性主要作用于细 ? μ-calpaincalpain 1CAPN1 和钙蛋白酶 胞骨架蛋白蛋白激酶和磷酸酶参与细胞信 ISSN 1673-8225 CN 21-1581R CODEN ZLKHAH 1173 CRTERorg 巫荣华等 坐骨神经夹伤与心脏毒素注 射导致腓肠肌功能损伤中 Calpains 和 FoxOs 的 南通 大 学神经再 号传递对维持动物的生长发育发挥重要作 时间及地点于2010-092011-09在南通 生重点实验室江 苏省南通市 [5] 用 大学江苏省神经 再生重点实验室完成 226001 造成肌肉组织损伤方法有多种包括机 材料 巫荣华?男 1987 年生福建 械物理和化学损伤等[6] 心脏毒素是从眼镜 实验动物健康成年雄性SD大 鼠135只体 省三明市人汉 族 2011 年南通 蛇毒腺中提取的一种毒素属于膜毒素主要 质量 180200 g由南通大学实验动物中心提 大学毕业硕士 主要从事失神 表现心脏毒性无磷脂酶A2活性心脏毒素与 供许可证号SYKX 苏 2002-0022 肌萎缩分子机制 的研究 膜上的受体结合后使膜产生小孔导致肌细 主要试剂 wuronghua5 2 [7] 126com 胞去极化及Ca 超载进而使肌功能受损 试剂 来源 并列第一作者徐 其病理改变主要是导致肌膜和肌纤维快速溶 曼?女1987 解[8] 而周围神经损伤常导致神经远端以及靶 Trizol reagent Invitrogen 公司 年生江苏省连云 港市人汉族南 2 First-Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas 公司 通大学在读硕士 组织损伤失神经后靶肌细胞Ca 通道活性 改 Conventional PCR Kit 主要从事神经生 变Ca2通道开放时间延长胞外Ca2 内流增 Fast EvaGreen Master Mix for Biotium 公司 物学研究 xuman2011 加既然两种损伤中都可以观察到肌细胞完整 qPCR and HRM gmailcom 性被破坏和Ca2超载那么肌细胞内依赖钙的 Cardiotoxin Sigma 公司 通讯作者刘梅 博士教授南通 钙蛋白酶家族成员CAPN1 2 3是否发生了 方法 大学 神经再生重 点实验室江苏省 变化其变化趋势是否一致是实验要探讨的 坐骨神经夹伤模型的建立实验动物 25 只 南通市 226001 liumeintu 问题 随机分为 5 组 假手术组夹伤 3714 educn FoxO家族是一类拥有保守的 Fork区域的 21 d 组每组 5 只夹伤组大 鼠行坐骨神经夹 中图分类号R318 文献标识码A 转录调控因子能够和TTGTTTAC序列相似性 伤术 采用复合麻醉剂 3 mgkg 腹腔注射麻醉 文章编号1673-8225 2012 07-01173-07 高或一致的序列结合主要参与DNA修复细 后在左侧股后部作纵行切口显露梨状肌下 收稿日期2011-12-09 胞分化凋亡和代谢[9] 已有的研究发现该家 缘至胫腓神经分叉处 的坐骨神经段距离梨状 修回日期2012-01-04 族 成 员 FoxO1 和 FoxO3a 主 要 在骨 骼 肌 中 表 肌下孔 05 cm 处用专用止血钳钳夹坐骨神经 3 20111020010WLM ?C 达有研究表明在人和小鼠中FoxO1基因调 次每次 10 s间隔 10 s挤压损伤的宽度为 控成肌细胞和脂肪细胞的增殖与分化参与骨 3 mm[14] 假手术组动物暴露坐骨神经不做损 骼肌的代谢促进肌肉萎缩[10-12] FoxO3a分 伤处 理术后常规饲养 该实验重复 3 次 别独立控制着两个骨骼肌蛋白分解系统泛素 心脏毒素注射致肌损伤模型的建立实验动物 蛋白酶体以及自噬溶酶体途径激活FoxO3a 20 只随机分为 4 组注射 371421 d 转录因子会通过自噬作用增加肌肉和其他种类 组每组 5 只将 10 μmolL 心脏毒素 150 μL 细 胞 中 的 蛋 白 质分 解 导 致肌 肉 萎 缩 的 发 注射至大 鼠左侧腓肠肌建立肌损伤模型[15] 生[1113] 这两个转录因子在心脏毒素注射和坐 采用复合麻醉剂 3 mgkg 腹腔注射麻醉后在 骨神经损伤导致肌损伤过程中是否也有着重要 左侧腓肠肌处用剪刀去毛备皮后注射心脏毒 作用与CAPNs家族成员间的关系如何也是 素右侧腓肠肌作为对照组注射等体积生理 实验要了解的问题因此实验也观察了它们在 盐水采用隔天注射至第 12 天后不再注射 两种不同肌损伤模型中表达的变化并进行了 术后常规饲养 该实验重复 3 次 相关性分析 大鼠坐 骨神经功能指数测定在造模后观察一 由于在坐骨神经夹伤和心脏毒素注射两种 般情况步态足趾与足跟溃疡 的发生发展 不同机制的肌损伤中腓肠肌中CAPNs家族成 以及恢复情况让大 鼠在足印行走箱 内行走 员及FoxO1 和FoxO3a 表达的差异尚未有报 进行足印测试 选取较清楚 的足印测量并根据 道因此实验拟检测注射心脏毒素以及坐骨神 Bain 公式计算坐骨神经功能指数 坐骨神经功 经夹致腓肠肌失功能损伤中CAPNs及FoxO1和 能 指 数 -383× EPL-NPL NPL1095× ETS FoxO3a表达变化的差异并分析它们之间的 -NTS NTS133× EIT-NIT NIT-88其中 相关性 PL后足跟至 前足趾之间距离 足印长 TS 第 1 个足趾至 第 5 个足趾之间的距离 足印宽 1 材料和方法 IT第 2 个足趾至第 4 个足趾之间的距离 足中 间三趾宽 E为 实验足N为正常对照足 设计分子生物学水平的随机对照动物实 大鼠腓肠肌组织取材分别于造模后 37 验 1421 d 麻醉动 物俯卧位固定自股骨内外 1174 PO Box 1200 Shenyang 110004 cnzglckfcom 巫荣华等 坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中 Calpains 和 FoxOs 的 CRTERorg 踝起点至跟骨结节止点完整取下损伤侧及对照侧的腓 常规PCR 鉴定 内参GAPDH 的PCR 反应总体积 [16] 肠肌剪去腓肠肌周围结缔组织称质量 计算腓肠 25 μL 其中cDNA 1 μL 反应条件为94 ?预变性 肌湿质量比 即心脏毒素注射或坐骨神经夹伤后腓肠肌 5 min94 ?变性25 s60 ?退火25 s72 ?延伸 湿质量与自身对照侧腓肠肌湿质量的相对比值 同时取 35 s循环24次最后72 ?延伸7 min PCR产物进行 75 mg 左右肌肉组织迅速置 1 mL Trizol 试剂中冰上匀 15琼脂糖电泳并记录结果 浆匀浆液于-80 ?备用 Real-time PCR按照Biotium公司的Fast EvaGreen 总 RNA 的提取将保存于-80 ?冰箱的样品匀浆液 Master Mix for qPCR and HRM说明书进行cDNA 于冰浴化开室温静置5 min按照Trizol 提取RNA 的 1 μL反应总体积为20 μL反应条件为96 ?预变性 步骤进行操作加入 30 μL RNase-free ddH O 溶解总 2 min95 ?变性15 s60 ?退火25 s72 ?延伸 2 RNA65 ?水浴促溶15 min核酸蛋白定量仪测定A260 35 s循环45次于每个循环在72 ?采集荧光数值 及 A280 值计算总 RNA 浓度RNA gL 40×A260×稀 为了检测每个反应的特异性循环结束后分析溶解曲 释倍数1 000 并鉴定RNA 的纯度 线分析条件为95 ? 15 s 60 ? 60 s 95 ? 反转录合成 cDNA 按Fermentas 反转录试剂盒说明 15 s 书操作进行取总RNA 2 μg 进行反转录反应反应在 主要观察指标各组大鼠腓肠肌CAPNs和FoxO1 05 mL 离心管进行体系含1 × Reaction Buffer 及FoxO3a mRNA的表达 _ 10 mmolL dNTP MixOligo-dT 引物RNase 抑制剂 统计学分析实验重复3次结果用x?s表示应 20 URT 酶200 UμL同时加入适量的DEPC 水使总 用Stata软件进行统计学分析组间数据比较采用t 检 体积为20 μL轻轻混匀稍加离心置42 ? 1 h 验应用回归分析方法进行相关分析P 005为差异 72 ? 5 min 合成的cDNA 分装后置-20 ?保存备用 有显著性意义 引物设计采用Primer 5 软件按照GenBank 登录 的序列 GAPDH NM_0170083 CAPN1 NM_ 2 结果 0191522 CAPN2 NM_0171162 CAPN3 NM_ 0171171 FoxO1 NM_0011918461 FoxO3a NM_ 21 实验 动物数量分析 实验共纳入135只大鼠均 0011063951 设计常规PCR 和Real time PCR 引物 进入结果分析 由上海Invitrogen 公司完成引物合成 22 坐骨神经功能指数分析结果 将夹伤不同时间的 引物序列 大 鼠足迹实验作为评估坐骨神经功能恢复指标每只 大鼠 每个时间点在足印行走箱内行走3次取其中清晰 Gene name Sequence 5-3 Position 的4 组 足迹 对照足4 个夹伤足4个 进行统计如图 1可 见随着时间的推移大鼠的坐骨神经功能逐渐恢 GAPDH Sense CCG CTA ACA TCA 315-335 for general PCR AAT GGG GTG 复 Antisense ATTG GGG GTA 767-787 GGA ACA CGG AA GAPDH Sense CCT TCA TTG ACC 177-199 3 6 9 12 15 18 21 for real time PCR TCA ACT ACA TG 0 Antisense CTT CTC CAT GGT 369-389 GGT GAA GAC -20 I -40 CAPN1 Sense GTG GAA CAA AGT 990-1010 F S GGA CCC CTA -60 2 Antisense AAG GGC GTC 1107-1125 -80 y -0086 9x 4416 9x-91555 2 AGG TGT AAG G -100 R 0871 1 r 0933 3 P 002 CAPN2 Sense TAC CGA GAG ATC 2257-2276 Days after nerve injury GAC GTG GA Antisense TTC CAG CCG AAC 2418-2436 Figure 1 The sciatic functional index SFI values of rats at CAA ACA C different time points after sciatic nerve injury 图 1 大鼠坐骨神经夹伤后不同时间点的坐骨神经功能指数 CAPN3 Sense CAT TGT CCC CTC 1966-1985 CAC TTA CG Antisense GCT CCT TGT TGC 2126-2144 TGT TTG C 23 大鼠腓肠肌湿质量比 取每组大鼠术侧及健侧腓 FoxO1 Sense TGG CTA TGG TAG 1842-1860 GAT GGG T 肠肌 称其质量湿质量比 术侧质量健侧质量结果 Antisense TCC AAG GTA TCT 1955-1973 CCG TCC A 见图 2a神经夹伤后腓肠肌逐渐萎缩 夹伤721 d FoxO3a Sense GCA CTA CGG CAA 1714-1732 组与 对照组比较差异有显著性意义 P 005 夹伤 CCA GAC A Antisense ACA TCA TTG GGT 1859-1877 14 d 组 与 对 照 组 比 较 差 异 有 非 常 显 著 性 意 义 CGT TGC G P 001 随后逐渐恢复由图2b可见心脏毒素注 ISSN 1673-8225 CN 21-1581R CODEN ZLKHAH 1175 CRTERorg 巫荣华等 坐 骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中 Calpains 和 FoxOs 的 射后腓肠肌湿质量比在第3天没有显著改变第7天 其中3 d表达量最高FoxO1 mRNA表达逐渐上升在 出现萎缩现象注射14 d组与对照组比较差异有显著 7 d时表达最高随后下降而CAPN3 mRNA在3 d时 性意义 P 005 随后逐渐恢复 表达显著下降随后恢复至正常水平 Ctrl 3 d 7 d 14 d 21 d Days after nerve injury a Sciatic nerve injury a Sciatic nerve injury Ctrl 3 d 7 d 14 d 21 d Days after cardiotoxin injection b Cardiotoxin injection b Cardiotoxin injection Ctrl Control group Ctrl Control group a b P 005 P 001 vs control group a b P 005 and P 001 vs control group Figure 3 Expression of Calpain 1 Calpain 2 Calpain 3 FoxO1 and FoxO3a mRNA in sciatic nerve injury Figure 2 The wet weight ratio of the gastrocnemius muscle of model and gastrocnemius muscle atrophy model gastrocnemius muscle atrophy model induced by induced by cardiotoxin injection sciatic nerve injury and cardiotoxin injection 图 3 坐骨神经夹伤模型和心脏毒素注射致腓肠肌损伤模型 图 2 坐骨神经夹伤模型和心脏毒素注射致腓肠肌损伤模型 中腓肠肌湿质量比 中 CAPN1CAPN2 CAPN3FoxO1FoxO3a 的 表达情况 24 cDNA质量的鉴定结果 用常规PCR来鉴定cDNA 26 失神经肌损伤过程中CAPN 家族基因和FoxO1 的质量 结果未给出 发现各样品间在总RNA用量一 FoxO3a表达的相关性 时反转录和PCR效率基本一致且GAPDH在实验过 CAPN与FoxO1基因的关系 以相对FoxO1 mRNA的 程中变化差异无显著性意义 P 005 可以作为 内 表达情况和失神经肌萎缩过程中CAPN的表达变化做回 参 归分析发现FoxO1 mRNA的表达与失神经肌萎缩过 25 各 组 大 鼠 腓 肠 肌 CAPNs 和 FoxO1 及 FoxO3a 程中CAPN3 的表达正相关 r 0901 5P 005 而 mRNA的表达 采用实时荧光定量PCR进行检测以取 与CAPN1和CAPN2 的表达不存在线性相关性见图 材时间点作为横坐标以目的基因 内参基因 4 CAPN1GAPDHCAPN2GAPDHCAPN3 GAPDH CAPN与FoxO3a基因的关系 以相对FoxO3a mRNA FoxO1GAPDH FoxO3aGAPDH 的比值作为纵坐 的表达情况和失神经肌萎缩过程中CAPN的表达变化做 标代表基因的表达量统计分析结果见图3 由图3a 回归分析发现FoxO3a mRNA的表达与失神经肌萎缩 可见在神经夹伤早期 3 7 d 腓肠肌组织中的 过程中CAPN的表达不存在线性相关性 P 005 见 CAPN1CAPN2和FoxO3a mRNA表达趋势一致即 图5 神经夹伤后表达逐渐升高至7 d时达到峰值随后 27 心脏毒素导致肌损伤过程中CAPN 家族基因和 逐渐下降CAPN3和FoxO1 mRNA 的表达先升高 FoxO1FoxO3a表达的相关性 14 d时表达达到高峰随后下降而在心脏毒素注射 CAPN 与FoxO1基因的关系 以相对FoxO1 mRNA的 模型 图3b 中与对照组相比CAPN1 CAPN2和 表达情况和心脏毒素诱导的肌萎缩过程中CAPN的表达 FoxO3a mRNA在3 d表达升高 P 005 随后下降 变化做回归分析发现FoxO1基因 mRNA的表达与心 1176 PO Box 1200 Shenyang 110004 cnzglckfcom 巫荣华等 坐骨神经夹伤与心脏毒素注射导致腓肠肌功能损伤中 Calpains 和 FoxOs 的 CRTERorg 脏毒素诱导的肌萎缩过程中CAPN的表达不存在线性相 关性 P 005 见图6 y 4932 8x-3964 2 y 1407 5x-041 y 1841 6x-0155 6 l R2 0564 2 r 0751 1 P 005 R2 0321 8 r 0567 3 P 005 l 2 e l e R 0812 7 r 0901 5 P 005 v e v 16 e 16 v 16 e l l e A l A N A N R 12 N 12 R 12 m R m 1 m 1 O 8 1 8 O 8 x
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