仔猪大肠埃希氏菌、C型产气荚膜梭菌的灭活及脱毒方法研究

仔猪大肠埃希氏菌、C型产气荚膜梭菌的灭活及脱毒方法研究 仔猪大肠埃希氏菌、C型产气荚膜梭菌的灭 活及脱毒方法研究 安徽农业科 学,JournalofAnhuiAgri.Sei.2010,38(20J:10702—10703.10728责任编辑王强责任校对卢瑶 仔猪大肠埃希氏菌,C型产气荚膜梭菌的灭活及脱毒方法研究 刘泽文,邓均华,杨克礼,梁望旺,伍锐,段正赢,周丹娜,田永祥,徐涤平 (湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉430064) 摘要[目的]研究仔猪大肠埃希氏茵病,c型产气荚膜梭茵病二联灭活疫苗的质量及产品的安全性.[方法]对大肠埃希氏茵和c型 产气荚膜梭茵浓缩茵液,用不同浓度甲醛溶液经不同灭活时间,灭活温度进行了灭活和脱毒试验.[结果]大肠埃希氏茵培养物在37, 38?条件下用0.4%的甲醛溶液灭活48h,可以使细菌全部灭活;C型产气荚膜梭茵培养物在37—38?,采用0.5%,0.8%的甲醛溶液 进行灭活和脱毒7—14d,或者采用2次灭活和脱毒方法,7d可以达到完全灭活和脱毒.[结论]在37,38?条件下,用0.4%的甲醛溶 液对大肠埃希氏茵培养物灭活和采用0.5%一0.8%的甲醛溶液对c型产气荚膜梭菌进行灭活和脱毒,可以达到理想效果. 关键词大肠埃希氏茵;c型产气荚膜梭茵;灭活;脱毒 中图分类号S858.28文献标识码A文章编号 0517—66l1(2010)20—1O702—02 InactivationandDetoxificationofEscherichiacoliandC-typeClostridiumwechii L】 【UZe-wenetal(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary.HubeiAcademyofAgriculturalScience,Wuhan.Hubei430064) Abstractf0biectivelInordertoassurethequalityandsecurityofEscherichiacoliandC—typeclostridiumwechiicombinedvaccine. JMethod}ThedifferentinactivetemperatureandtimeweretestedonEscherichiacoliandClostridiumwechiiindifferentconcentrationforma1. dellvde.1Resuh]Escheriehiacoliwaskinedin0.4%formaldehydeat37—38 ?for48h.Clostridiumwechiiwasinactivedandlosingvim— lencein0.5%一 0.8%formaldehydeat37—38oCfor7—14d.iConclusioniItcangetbettereffec ttoEscheriehiacoliin0.4%formalde— hydeat37—38?for48hand0.5%一 0.8%formaldehydeat37—38oCfor7—14dtoC.typeClostridiumwechii. KeyEscherichiacoli:C—typeClostridiumwechii;Inactivation;Detoxification 仔猪红痢和黄痢是新生仔猪最常见的2种传染病,致病 菌均属于肠道菌,多发生于出生后l周内的新生仔猪,发病 急,死亡快,有些甚至在生后3d内全窝死亡,发病率可达 4o%,50%,死亡率可高达100%,给养猪业造成了巨大的经 济损失.目前国内预防仔猪大肠埃希氏菌病和C型产气 荚膜梭菌病已有获得批准并上市应用的单苗,虽然其临床效 果较好,但2种单苗因需要分别免疫而使其使用受到一定限 制.笔者在参考国内外相关研究的基础上J,将大肠埃希氏 菌和c型产气荚膜梭菌接种适宜培养基增菌培养,浓缩,灭 活和脱毒后按一定比例制备成仔猪大肠埃希氏菌病,C型产 气荚膜梭菌病二联灭活疫苗.经实验室安全免疫效力试验 表明,二联苗接种试验动物后安全,无不良反应,子代能够获 得坚强的免疫力,并且2种细菌抗原按比例配合在一起,未 产生免疫干扰现象,与2种单苗的免疫力无差异,实现了简 化免疫程序的目的.为了保证仔猪大肠埃希氏菌病,C型产 气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的质量及产品的安全性,笔者根 据制苗菌株的免疫原性及毒力,参考相关灭活疫苗所使用的 灭活剂及灭活工艺,对灭活剂,灭活方法,灭活时间和灭活 检验方法进行研究. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试验菌种.大肠埃希氏菌(C83549,C83644,C83710 和C83920菌株),c型产气荚膜梭菌(C59—2,C59—37和C59— 38菌株),均由中国兽医药品监察所鉴定,保管和供应. 1.1.2主要培养基.大肠埃希氏菌培养基为改良Minca琼 脂和改良Minca汤;c型产气荚膜梭菌培养基为厌气肉肝汤 和肉肝胃酶消化汤. 基金项目 作者简介 收稿日期 湖北省科技厅引导项目(2006AA201C25);湖北省农业科技 创新中心资助项目(2007-620-001-03)资助. 刘泽文(1969一),男,湖北赤壁人,副研究员,从事畜禽疾病 诊断与预防研究.通讯作者,研究员,E.mail:liuzwen2004 @sina.tom. 2010-03.12 1.1.3试验小鼠.l6—18g昆明小鼠,由湖北省实验动物 研究中心提供. 1.2菌液制备 1.2.1大肠埃希氏菌液制备.4种纤毛抗原菌株分别采用 带有搅拌装置的反应罐通气培养.培养基灭菌后冷至37? 左右接种种子液(按8000ml培养基接入一个扁瓶培养物计 算),并加入0.1%消泡剂,培养温度为36,37?,搅拌速度 为600r/min,通气量>l:1.可采用连续通气培养法,于第l 代通气培养7h,取样纯检合格,平板凝集反应达”++++” 即收获,并按加入培养基总量的3%一5%留有种子,然后加 入培养基,通气培养6,7h,如此循环,连续通气培养,最多 不超过3代.将纯粹检验合格的4种菌液浓缩至200×10. cfu/ml,调pH值为7.0,分装成250ml/瓶,密封. 1.2.2C型产气荚膜梭菌液制备.用培养罐或玻璃瓶静置 培养,按容量装入70%培养基.培养基灭菌后,冷却至37? 立即接种.培养基如经存放,在临用前煮沸驱除O,,按培养 基总量的l%,2%分别接种各菌株种子液,35—36?培养 16,20h.将各菌液浓缩并离心,使浓缩菌液中含3200 MLD(小鼠)/ml,调节pH值为7.0,分装成250ml/瓶,密封. 1.3大肠埃希氏菌液灭活方法的试验 1.3.1灭活剂及灭活时间对大肠埃希氏菌菌液灭活效果试 验.分别按菌液总量的0.1%,0.2%,0.3%,0.4%和0.6% 加入甲醛溶液,放37,38?温箱灭活,分别于lO,24和48h 进行灭活检验. 1.3.2温度对大肠埃希氏菌液灭活效果试验.每瓶中按菌 液总量加入0.4%的甲醛溶液,然后分别置29,30,34—35 和37,38?灭活,于灭活后12,24和48h进行灭活检验. 1.4C型产气荚膜梭菌液灭活和脱毒方法的试验 1.4.1灭活剂含量及灭活时间对C型产气荚膜梭菌灭活和 脱毒效果试验.分别按浓缩液总量的0.4%,0.5%和0.8% 加入甲醛溶液,放37,38?温箱灭活和脱毒,并于灭活后5, 38卷2O期刘泽文等仔猪大肠埃希氏茵,c型产气荚膜梭茵的灭活及脱毒方法研究10703 7,10和14d进行灭活和脱毒检验. 1.4.2温度与时间对c型产气荚膜梭菌液灭活和脱毒效果 试验.按浓缩菌液总量的0.5%加入甲醛溶液,然后分别置 28—29,34,35,37,38和40?灭活和脱毒,分别于灭活后 7,14和20d进行脱毒检验. 1.4.3两次灭活对c型产气荚膜梭菌液灭活和脱毒的效果 试验.先按浓缩菌液总量的0.3%加入甲醛溶液,在37?脱 毒4d后,然后加入0.2%甲醛溶液继续脱毒,3d后进行脱 毒检验. 1.5灭活和脱毒检验方法 1.5.1大肠埃希氏菌的灭活检验按《中国兽药典》将灭活 到期的菌液接种改良Minca汤2支,0.2ml/支,置37?培养 5d,经观察和检验无菌生长判为合格. 1.5.2C型产气荚膜梭菌的灭活检验.按《中国兽药典》将 灭活和脱毒到期的浓缩菌液,接种肉肝胃酶消化汤2支,接 种0.2ml/支,置37?培养5d,经观察和检验无菌生长判为 合格. 1.5.3C型产气荚膜梭菌的脱毒检验.将脱毒到期的浓缩 菌液离心,取上清各静脉注射体重l6—2Og小白鼠4只,0.2 ml/只,观察24h,均健活为合格. 2结果与分析 2.1大肠埃希氏菌灭活方法的试验结果 2.1.1灭活剂浓度及时间对大肠埃希氏菌菌液灭活效果的 影响.由表1可知,在大肠埃希氏菌各菌株培养物中加入 0.1%的甲醛溶液,灭活48h还有细菌生长,0.3%,0.4%和 0.6%的甲醛溶液可以在24h使其灭活. 表1灭活剂含量对大肠埃希氏菌的灭活效果 Table1TheinactivationeffectofEschefic~acoliatdifferentinacti. vatorcontent 注:”+”表示有菌生长,灭活检验不合格;”一”表不无菌生长,灭活检 验合格.下表同. Note:+standsforhavingbacteriagrowthandunqualifiedinactivationtest; 一 standsfornobacteriagrowthandqualifiedinactivationtest. Thesameasbelow. 2.1.2温度及时间对大肠埃希氏菌液灭活效果检验.由表 2可知,除菌液中加入0.4%的甲醛在37,38?24h和34, 35?48h可使培养物完全灭活外,其他条件均不能完全 灭活.争,’ 之.2C型产气荚膜梭菌灭活和脱毒检验结果 2.2.1灭活剂含量及灭活时间对c型产气荚膜梭菌脱毒效 果检验.由表3可知,在37,38?条件下,0.4%的甲醛溶 液10d可使培养物完全脱毒,0.5%和0.8%的甲醛溶液只 需要7d即可使培养物完全脱毒. 表2温度和时间对大肠埃希氏菌液灭活的效果 Table2TheinactivationeffectoftemperatureandtimeonEscherichia 表3灭活剂含量及时间对C型产气荚膜梭菌的脱毒效果 Table3Theeffectsofinactivatorcontentandtimeonthede~xifica. tionofC-typeClostridiumwl~2hii 注:脱毒效果用”小鼠存活数/攻毒总数”表示.下表同. 2.2.2温度及时间对C型产气荚膜梭菌脱毒效果的影响. 由表4可知,甲醛含量在0.5%时,C型产气荚膜梭菌浓缩液 在28,29和34,35?脱毒7d可使部分小鼠致死,28,29 ?脱毒20d,34,35?脱毒14d以上,37,38?脱毒7d以 上可完全脱毒,不能致死小鼠. 表4温度及时间对C型产气荚膜梭菌的脱毒效果 Table4Theeffectsoftemperatureandtimeonthedetoxificationof C-typeClostridiumwechii 2.2.32次脱毒对c型产气荚膜梭菌的脱毒效果的影响. 在37,38?条件下,分2次加入甲醛溶液对C型产气荚膜 梭菌浓缩液毒素脱毒,发现第1次用0.3%甲醛溶液灭活4d 后,可致死全部小鼠,第2次再加0.2%甲醛溶液灭活3d后, 可完全脱毒,注射脱毒液小鼠全部存活. 3结论与讨论 3.1试验结果表明,大肠埃希氏菌培养物的灭活效果受甲 醛溶液含量,灭活温度和灭活时间的影响较大,当甲醛溶液 含量过低时,需灭活时间则长,而当甲醛溶液含量或温度较 高时,灭活时间则相对缩短.虽然试验结果中加入0.3%甲 醛溶液灭活24h,0.6%甲醛溶液灭活12h,经检验无细菌生 长,但较高含量的甲醛溶液可能破坏抗原活性,对免疫动物 反应也会加大,而低含量甲醛溶液及较短时间灭活会增加安 全风险.因此,采用37,38?条件下用0.4%的甲醛溶液对 大肠埃希氏菌各菌株浓缩菌液灭活48h比较合理. 3.2c型产气荚膜梭菌培养物的脱毒影响因素较多,包括 甲醛含量,pH值,灭活时间和灭活温度等,但脱毒时间较长, 是制约该疫苗规模化生产进度的关键问题之一.笔者从脱 毒时的甲醛溶液含量,脱毒温度,脱毒时间以及1次脱毒和2 (下转第10728页) 10728安徽农业科学2010生 1一中果皮 果皮 3—胚乳 十皮 内果皮 图2峨眉桃叶珊瑚果实横切面 Fig.2CrosssectionofAucubaomeinensisFangfruit 注:1为薄壁细胞;2为果肉细胞;3为导管;4为石细胞;5为纤 维;6为外表皮细胞. Note:1.Parenchymacell;2.Fleshcell;3.Vessel;4.Sclereld~5.Fi— her;6.Outerepidermiscells. 图3峨眉桃叶珊瑚果实粉末 Fig.3PowderofAucubaomeinensisFangfruit 2.4薄层色谱鉴别取峨眉桃叶珊瑚果实粉末3g置于 100nd圆底烧瓶中,加入80%乙醇25,80?水浴加热回流 1h,过滤,滤液作为供试品溶液.精密称取桃叶珊瑚苷纯品 (纯度>90%)30mg,置于50ml容量瓶中,加水溶解,稀释至 刻度,制成0.54mg/m~的对照品溶液.照薄层色谱法试 验,吸取上述溶液各5LLl,点于含0.5%羧甲基纤维素纳为粘 合剂的硅胶G薄层板上,以甲醇一三氯甲烷一石油醚一乙酸 乙酯(3.5:2:1:4)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以Epstal显 色剂,于105qC加热数分钟,结果供试品在与对照品相同的 位置上出现了相同颜色的斑点,见图4,表明峨眉桃叶珊瑚果 实中含桃叶珊瑚苷,比移植RZ=0.48. (上接第10703页) 次脱毒进行比较,发现c型产气荚膜梭菌培养物在37—38 ?,采用o.5%,0.8%的甲醛溶液进行灭活和脱毒7,14d, 或者采用2次脱毒方法,第2次灭活甲醛溶液含量为0.5%, 灭活7d比较合适. 参考文献 [1]斯特劳B?E.猪病学[M].赵德明,张中秋,沈建忠,译.北京:中国农业 出版社,2O0O. [2]中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程[S]. 注:1为桃叶珊瑚苷纯品;2,6为峨眉桃叶珊瑚果实样品. Note:1,pureaucubin;2,6,fruitsamplesofAucubaomeinemis Fang. 图4峨眉桃叶珊瑚果实薄层色谱 Fig.4TLCofAucubaomeinensisFangfruit 3结论与讨论 通过对峨眉桃叶珊瑚果实的植物来源,性状,显微鉴别 特征的研究,确定了其主要的显微组织特征为外果皮薄,南 一 系列不规则细胞组成;中果皮肉质,内含大量石细胞;内果 皮内侧有大型维管束散在;胚乳细胞类多边形,内含大量油 滴及糊粉粒.粉末特征与组织特征相符. 在对峨眉桃叶珊瑚果实进行薄层色谱鉴别时,采用文 献中的甲醇一氯仿一石油醚一乙酸乙酯(2:2:4:1)展开剂, 但是效果不理想,通过调整后效果较好.显色时将温度从室 温缓慢上升至105?较直接于105?的环境中显色效果好, 斑点较清晰. 参考文献 [1]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第二册)[M].北京:科学 出版社,2OO2:1111. [2]康桢,吴卫华,王俊杰,等.桃叶珊瑚苷及其苷元的药理研究进展[J]. 中国中药杂志,2007,32(24):2585—2587. [3]XUEHY,JINLJ,JINI,eta1.Neumproteetionofaucubininn1arydia— beticencephalopathy[J].SciChinaSerC-LifeSci,2008,51(6):495— 502. [4]啪尧青,贺前锋,曹慧,等.杜仲皮中桃叶珊瑚苷的提取及纯化[J].中 南大学:自然科学版,2OO5,36(1):60—64. [5]汪程远,张浩,张承平,等.生地黄中环烯醚萜苷类的纯化分离工艺 [J].医药导报,2OO3,22(1o):780. [6]李发荣,杨建雄,李宝林,等.太白参中佻叶珊瑚苷的分离鉴定和提取 工艺[J].中草药,2003,34(9):802—803. [7]董可,魏屹,邓欣茹,等.峨眉桃叶珊瑚不同部位桃叶珊瑚苷的含量比 较[J].西北药学杂志,2008,23(5):274—275. [8]国家中医药管理《中华本草》编委会.中华本草第5册[M].上海:上海 科技出版社,1997:734—735. [9]马柏林,梁淑芳,张康健.薄层色谱分离和分光光度法测定桃叶珊瑚甙 [J].分析化学研究简报,20O0,28(3):346—348. 20oO. 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