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添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培养的影响(可编辑)

2017-09-26 38页 doc 73KB 73阅读

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添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培养的影响(可编辑)添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培养的影响(可编辑) 添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培养的 影响 to Athesissubmitted ZhengzhouUniversity Master forthe of degree cultureimmatureinvitro Theeffectof oocytes byadding HMGtomedium follicularfluidor HuanXia By Sun Supervisor:Prof(Lijun and C...
添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培养的影响(可编辑)
添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培养的影响(可编辑) 添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培养的 影响 to Athesissubmitted ZhengzhouUniversity Master forthe of degree cultureimmatureinvitro Theeffectof oocytes byadding HMGtomedium follicularfluidor HuanXia By Sun Supervisor:Prof(Lijun and Cultivate Obstetrics Gynecology Medical TheSecondClinical College 2012 April 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人 或集体已经发或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者:融疋 日期:洲 年 6月ff日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者: 同期:砂,x年6月‘,同 摘要 添加卵泡液或HMG对人未成熟卵母细胞体外成熟培 养的影响 研究生夏欢 导师孙丽君 郑州大学第二临床学院生殖医学中心 河南郑州450014 摘要 vitro 大多数的体外受精(胚胎移植 in ovarian 超排卵 con们lled 成熟卵母细胞,但约有15,20,卵母细胞未达到成熟状态,这部分未成熟卵在卵 胞浆内单精子显微注射 instracytoplasmissperminjection,ICSI 中去颗粒细胞 后常被丢弃,有研究显示裸卵和带颗粒细胞的卵在体外培养均可获得成熟卵母 细胞,在此后的培养中其受精率、卵裂率及胚胎的各项指标皆相似,证实了未 成熟裸卵母细胞可以进行体外成熟培养。因此充分利用ICSI脱颗粒细胞后的这部 分未成熟卵母细胞,使之培养成熟,将会增力HICSI周期的胚胎数量,患者的助孕 vitro maturation,IVM 成功率也能得到一定的提高;虽然近lO多年来,WM in 技术的应用得到了迅速的拓展,但该技术目前还处于探索阶段,仍然存在成熟率、 受精率、卵裂率、可利用胚胎率较低和种植率低等问。解决这些问题关键在 于IVM培养液的成分。尽管国际上已有公司研发了人未成熟卵母细胞体外成熟 的培养液系统,但所用的培养液可能还缺少卵子成熟所必须的某些物质,仍摆 脱不了成功率低、不稳定等缺陷,本课题就此展开研究,旨在建立一套有效的 人卵母细胞体外成熟培养系统,对开发新的IVM培养系统,改善 IVM的临床结局 有重要意义。 摘要 目的 本课题X4IVF患者COH后的未成熟卵母细胞进行研究,探讨商品化的IVM培 养液中添加不同成分对未成熟卵母细胞的体外成熟、受精和胚胎发育的影响, 旨在建立一种有效的人卵母细胞体外成熟培养方案。 方法 收集265枚未成熟卵母细胞,未成熟卵母细胞中155枚为MI期,另110枚为GV 期。患者来源于2011年3,11月期问到郑州大学第三附属医院 接受ICSI的助孕 患者,助孕指征均为男方因素而行ICSI的不孕患者。 配制IVM培养液:A组:商品化的IVM培养液,未添加任何成分;B组 激 素组 :添加含0(075 养液中;C组 成熟卵泡液组 :50,基础IVM培养液与50,人成熟卵泡液配成。 在进行ICSI操作过程中,把脱颗粒细胞后观察到的未成熟卵母细胞,置于 事先配制好的IVM液中。分别观察各组24h和48h成熟情况,成熟后进行ICSI 操作,并对此后形成的胚胎进行评分,最后进行统计分析。 本课题的开展已获郑州大学第三附属医院伦理委员会的批准。每位患者均 被事先告知并签署知情同意书,然后进入本研究。 2 检验,Fischer 所有数据采用SPSSl6(0统计软件包处理。计数资料采用Z 的精确检验。检验水准为a O(05。 结果 1一般情况 共采集到未成熟卵母细胞265枚。未成熟卵母细胞中155枚为MI期,另 110枚为GV期,进行体外培养后,24h后成熟的卵母细胞共126枚成熟率为 47(5,,48h后成熟的卵母细胞共165枚成熟率为62(3,,成熟的卵母细胞均行 ICSI授精。 2比较三组培养液对未成熟卵母细胞体外成熟影响 三组培养液培养未成熟卵母细胞,24h的成熟率比较,差异均无统计学意义 U 摘要 计学意义 尸 0(05 。A组与B组未成熟卵母细胞48h成熟率比较,差异无统 计学意义 尸 0(05 。 三组培养液对MI期卵母细胞进行体外培养后24h成熟率两两比较,差异均 差异有统计学意义 尸 0(05 。 三组培养液对GV期卵母细胞进行体外培养后24h成熟率两两比较,差异均 差异有统计学意义 尸 O(05 。 3不同时期未成熟卵母细胞的体外培养成熟的情况 期 30(9,,50(O, 比较明显增高,差异有统计学意义 P O(05 。 4 IVM中应用三组不同培养液对受精、卵裂和可利用胚胎形成的影响 C组未成熟卵母细胞体外培养后卵裂率、可利用胚胎率 91(3,,66(7, 较B 组 71(0,,40(9, 高,差异有统计学意义 P O(05 ; C组未成熟卵母细胞体外培养后卵裂率、可利用胚胎率 91(3,,66(7, 较A 组 67(6,,36(O, 高,差异有统计学意义 尸 O(05 ; B组未成熟卵母细胞体外培养后卵裂率、可利用胚胎率 71(O,,40(9, 较A 组 67(6,,36(0, 高,差异均无统计学意义 尸 0(05 。 结论 1 添加卵泡液行体外成熟培养,可以提高未成熟卵母细胞的成熟率和发育 潜能。 2添加HMG比单纯的商品化IVM培养液培养效果要好。 3 MI期卵母细胞比GV期卵母细胞体外培养成熟率高。 关键词 未成熟卵母细胞 体外培养 激素 卵泡液 III Abstract Theeffectofcultureimmatureinvitro oocytes by follicularorHMG adding fluid tomedium HuanXia Postgraduate LiJunSun SupervisorProfi Medicine Clinical of Center,Second Reproductive College 450052 ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,China Abstract The ofin vitro majority programs controlled ovarian conventionallyadopt hyperstimulation 4 1 can Canobtain10to1 mature about5, 20,of usually oocytes(However oocytes that notreachmature ofwhichareoftendiscarded(Studieshadshown stage,part denuded and with cellscouldbeculturedtoreachmature oocyteseggs granulosa theresultsweresimilartofertilization rateandavailable stage,and rate, cleavage rate(Theseconfirmsthattheimmaturedenuded canbematuredin embryo oocytes full ofthis oftheimmature afterICSIto vitro(Takingadvantagepart oocytes culturethemtomatureCanincreasethenumberof inICSI andthe embryos cycles rateinthese canalsobeen theIVM pregnancy patients improved(Although inthe 10 isstillatthe technologyexpandedrapidly past years,IVMtechnology isstilllowinthematuration exploratorystage(It rate, fertilizationrate,cleavagerate, rateandotherissues(Thetosolvethese liesintheIVMculture planting key problems medium internationalhave some composition(Nowcompaniesdevelopedsystems ofhuman in themedium immature vitromaturationculture oocytes medium, but stillcouldnot thedefectsofthelowSuccessrate(Ouraimstoresearch escape study theseissues( objectives Weaimsto theeffectonimmatureafterCOHinIVF explore oocyte processby thedifferent tocommercialmediumofimmatureinvitro adding components oocytes IV Abstract in mature maturationandthenestablishaneffectivehuman vitro oocyte system( Methods Inthis collected265immaturein216ICSI study,we oocytes cycles(These ICSIintheThirdAffiliated of University patientsaccepted HospitalZhengzhou MarchtoNovemberin2011(AndICSIindicationswerea11malefactor( from mediumof medium:GroupA basis IVM : commercial Preparing?M mediumof 0(075IU,mlofFSHand0(075IU, B hormonegroup :add IVM;Group mlofLHtothebasismediumof follicular of C mature fluid :mixture IVM:Group follicularfluid( 50,basismediumofIVMand50,mature andobserved(The InICSI were of cells granule process,theoocytesstripped IVMfluidandobservedin immaturewere tothe of oocytesplaced priorpreparation each at24hand48h(If hadbeen ICSIandthen group theymatured,theyoprated were observed were thefinalstatistical fertilization,theembryosscored(Lastly analysed( ethicsthe and This hadbeen thecommitteeof of study approvedby hospital obtainedthe patientsagreement( Z 16(0statistical Was datausedthe2test, applied(Counting Spss package testlevelWas0【 0(05( Fisher’Sexacttest(The Results situation 1General In216ICSI were35(9士5(4 old(Obtainedimmature patients,averageage years 0 26 matured were265:155inMI and11 GV IVM, 1oocytes oocytes stage stage(By rate amaturerateof47(5,and165 maturedat48hwihamature at24hwith oocytes of62(3,( 2Theeffectonimmatureinvitromaturationthreedifferent oocytes by medium: no differenceinmaturationrateinthethree At Was 24h,there significant in rate 48h,maturationgroupC 74(7, wassignificantly groups P 0(05 (At difference was thanin A 53(4, andgroupB 57(3, ,the statistically higher group in wasno differencethematurationrate significant significant P O(05 (There betweenAand group GroupB P 0(05 ( V Abstract AtMI maturation oocytes,48h Cwas stage rate 81(7, in group significantly than highergroupB 62(2, P 0(05 ( AtGV maturation Cwas stageoocytes,48h rate 62(9, in group significantly than highergroupA 36(8, P 0(05 ( 3Theresultofthe differentimmatureinvitro period oocytes maturation: AtMI maturation oocytes,24h、48h stage rate 59(3,, 77(4, were than GV significantlyhigher stageoocytes 30(9,,50(0, P 0(05 ( 4 Theresultoffertilization rateand rate,cleavageavailablerate embryo afterIVMinthree groups In C group rate,available cleavage embryo rate 91(3,,66(7, was than significantly higher groupB 71(0,,。40(9, and groupA 67(6,,36, P wereno differencebetweenB O(05 (Theresignificant and group groupA P O(05 ( Fertilizationratehadno differenceinthethree significant groups( Conclusions 1 follicularfluidlineinvitro Adding maturationcould the improve maturationrate and of immature developmentalpotential oocytes( 2 Theeffectofculture hormoneswasbetterthan adding the commercializationIVMmediumculture( 3 ThematurationrateofMI Was thatof oocytes GV stage highel"than stage in vitroculture( oocytes words Key immature vitro oocyte;in fluid maturation;gonadotropin; follicle VI 缩略词表 缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称 ?F(ET Invitro transfer fertilization??embryo 体外受精一胚胎移植 ICSI Intracytoplasmicsperminjection 卵胞浆内单精子注射 COH Controlledovarian hyperstimulation控制性 超排卵 ?M Invitromaturation 体外成熟培养 EGF factor Epidermalgrowth 表皮生长因子 MI I Metaphase 第一次减数分裂中期 MII II Metaphase 第一二次减数分裂中期 GVBD Germinalvesiclebreakdown 生发泡破裂 OMI Oocytematurationinhibitor 成熟抑制冈子 MPF M-phase factor promoting 成熟促进冈子 PCOS Ovarian PolycysticSyndrome 多囊卵巢综合征 GDF一9 Growth differentiationfactor-9 生长分化因子(9 BMP(15 Bone morphogeneticprotein 骨形态发生蛋白(9 AREG Amphiregulin 双调蛋向 HMG Human menopausal gonadotropin 人绝经期促性腺激素 VII 目 录 论文部分 前日U 言…………………………………………………………………………………………(1舌…………………………………………………………………………………………( 材料与方 法………………………………………………………………。3 结 果…………………………………………………………………………………………(7 讨 论………………………………………………………………………………………((1O 结 论………………………………………………………………………………………(17 参考文 献………………………………………………………………(18 附图 未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞及胚 胎……………………(2l 综述部分 卵母细胞与卵泡细胞之间的相互作用在IVM中应用………………22 参考文 献………………………………………………………………(32 附图 卵母细胞与卵泡细胞之间的分子机制………………………40 附录部分 1 个人简 介………………………………………………………………(4 攻读硕士学位期间发表的学术论 文…………………………………((42 致 谢………………………………………………………………………………………((43 HU鬲 添加卵泡液或HMG对人未成熟卯母细胞体外成熟培 养的影响 研究生夏欢 导师孙丽君 郑州大学第二附属医院生殖医学中心 河南郑州450052 (j?-(1一 月I】吾 vitro 首例体外受精一胚胎移植 in fertilizationand embryotransfer,IVF(ET 诞 生的婴儿距今已30多年,此后辅助生殖技术特别是IVF技术受到了全社会极大的 关注【I】。目前已有数以十万计的IVF婴儿降生,?F的妊娠率已达到30,(50,, 该项技术已经在大部分国家得到开展。 ovarian 现今,大多数?F方案常规采用控制性超排卵 controlled 约有15,20,卵母细胞未达到成熟【2】,这部分未成熟卵母细胞在卵胞浆内单精子 显微注射 instracytoplasmissperminjection,ICSI 中去颗粒细胞后仍常常被丢 弃;有文献报道人卵巢中任何阶段的未成熟卵母细胞在合适的体外培养条件下, 都有成熟并发育到囊胚的潜在能力【4巧】。另有研究显示裸卵和带颗粒细胞的卵在 合适的体外培养条件下均可获得成熟的卵母细胞,并在此后培养中受精率、卵 裂率及胚胎的各项指标皆相似,证实了应用未成熟裸卵母细胞进行IVM的可行性 【3】。若能充分利用这部分未成熟卵母细胞,将会增加IVF周期的可移植胚胎和冷 冻胚胎的数量,提高累积妊娠率和患者的助孕成功率【6】;应用这部分未成熟卵母 细胞,不仅可以避免伦理学上的限制,为研究卵母细胞的发育动力学提供很好 的模型,还可能解决了供卵来源缺乏的问题。 卵母细胞体外成熟 invitro 熟培养进行研究【兀。而Cha等【8]利用IVM技术,成功的在1991年获得第一例经IVM 前言 后的临床妊娠。2000年在我国由陈子江等[9】通过IVM技术获 得我国首例临床妊 娠。近10年来,因为临床辅助生殖技术的进步以及生殖生物学对卵母细胞成熟 机制的深入研究,IVM技术的应用得到迅速的拓展,但IVM技术目前还处于探索 阶段,仍然存在成熟率、受精率、卵裂率、可利用胚胎率和种植率低等问题。 因而临床妊娠率仍然不能令人满意 约20,一35, [10-II】。?M成功与否的影响 因素很多,比如是否使用人绝经期促性腺激素 human menopausalgonadotropin, HMG 、人绒毛膜促性腺激素【12(131,子宫内膜的准备情况【14】,取卵时卵泡的直径 大小‘15】、培养液成分及培养时间长短等等【21。而在诸多的成功因素中,IVM培 养液的成分至关重要。?M早期的培养液一般包括TCMl99,胎牛血清,孕马血 清促性腺激素,牛绒毛膜促性腺激素 PMSG 。目前,国际上已有公司研发了人 未成熟卵母细胞体外成熟的培养液系统,并已于2005年商品化,但所用的培养 液可能还缺少卵子成熟所必须的某种物质,仍摆脱不了成功率低、不稳定等缺 陷。 本课题以到郑州大学三附院生殖中心接受ICSI技术助孕治疗的不孕患者为 研究对象,收集COH后的未成熟卵母细胞,观察在商品化的IVM培养液中添 加不同成分对未成熟卵母细胞的体外成熟、受精和胚胎发育的影响,旨在建立 一套有效的人未成熟卵母细胞体外成熟培养系统。 2 材料与方法 1材料与方法 1(1 材料 1(1(1研究对象 集265枚未成熟卵母细胞,未成熟卵母细胞中155枚为MI期,另110枚为GV 期,患者来源于2011年3,11月期间到郑州大学第三附属医院所接受ICSI助孕 者,助孕指征均为男方因素而行ICSI的不孕患者。 本课题的开展已获郑州大学第三附属医院伦理委员会的批 准。每位患者均 被事先告知并同意进入本研究。 1(1(2分组 实验中 1 按IVM培养液中添加的不同成分分为三组: A组:未添加任何成分 n 88枚未成熟卵母细胞 B组:添加HMG n 82枚未成熟卵母细胞 C组:添加成熟卵泡液 n 95枚未成熟卵母细胞 2 按不始培养时未成熟卵状态分为两组: GV组 n 110枚未成熟卵母细胞 MI组 n 155枚未成熟卵母细胞 1(1(3 主要仪器与设备 1 超净工作台:丹麦K(SYSTEMS产品,型号IVF(L26 2 C02培养箱:丹麦K(SYSTEMS产品,型号IVF(L26 日本Nikon产品,型号2000H,配DIC系统 7 4 体式显微镜:日本Olympus产品,型号SZX 5 巴氏吸管:美国Sigma产品 $6143 3 材料与方法 10-35SMICB Injection针 试验所用的试管、移液管及培养皿均来自于美国Falcon公 司。 1(1(4试剂 1 IVM卵母细胞培养液:美国SAGE公司生产 2 Quinn’s(1020:美国SAGE公司产品 3 Quinn’s(1023:美国SAGE公司产品 4 Quinn’s(1026:美国SAGE公司产品 5 人血清白蛋f兰I HSA ::美国SAGE公司产品 6 7,PVP Quinn’s :美国SAGE公司产品 7 透明质酸酶:Sigma公司产品 8 人绝经期促性腺激素 HMG 75u,支:珠海丽珠公司产品 1(1(5 IVM培养液的配制和不同培养基的制备 取卵前一日准备 1 A组应用商品化IVM液 Sigma,USA 不添加任何成分。 2 B组IvM卵母细胞培养液配制方法: ?将l安醅的75IUFSH署175IU ?取1009lQ加入9ml的IVM培养液中,配成B组IVM培养液。 3 C组IVM卵母细胞培养液配制方法: ?收集ART超排卵治疗中患者 排除免疫性不孕症患者 的成熟卵泡液, 3000 0(22Llm过滤器过滤,封121后置于冰箱冷藏备用。 ?IvM卵母细胞培养液5ml力1]人成熟卵泡液5ml配成c组IVM培养液。 1(2方法 1(2(1控制性超排卵 前一月经周期黄体中期不始使用GnRH(a 注射用醋酸曲普瑞林,天津博福 一益普生制药有限公司 0(05mg,d至注射HCG同。垂体完全降调节后月经D3天 4 材料与方法 用量,当最大卵泡直径达18 mm时注射HCG,注射HCG后36h于阴道B超介 导下取卵。 1(2(2未成熟多19母细胞的收集及观察 取卵后4h用透明质酸酶去除颗粒细胞,在倒置显微镜下对去除颗粒细胞的 卵母进行观察。未成熟裸卵判断方法: 1 GV期卵:有GV,胞核大,含有核膜 和单个折光的核仁,规则或不规则的胞浆,中心稍变黑并呈颗粒状,为GV期 卵。 2 MI期卵:无PBl也无GV胞浆圆形,浅色,有时有小颗粒,为MI期 卵。 1(2(3未成熟卯母细胞的体外成熟培养 将未成熟的卵母细胞 GV,MI期卵母细胞 随机置于以下添加不同成分的 IVM培养液中培养 1 A组:单纯商品化IVM卵母细胞培养液 IU,mL 2 B组:添加含0(075FSH及0(075IU,mLLH的HMG的商品 化IVM培养液 数C02培养箱培养过夜后使用。 1(2(4体外成熟的判断 对放入A、B、C三组IVM培养基的未成熟卵母细胞分别在24h及48h倒置显 微镜下进行观察判断:以是否排出第一极体为,排出第一极体的为MII成熟 卵,对MIIO J即时进行ICSI操作。 1(2(5 ICSI操作方法 1 将1(21(tl精子悬液加入ICSI微滴的中央,孵育数分钟后,部分精子可游 到液滴的边缘。 2 装好ICSI固定针、注射针。 3 用ICSI注射针轻压精子尾部使精子制动后,由精子的尾部吸入精子到 ICSI注射针内,操作过程中需避免伤及精子颈部。 4 将卵子微滴调至视野中央,并用显微固定针固定住卵母细胞,调节显微 5 材料与方法 镜使ICSI注射针与卵母细胞呈最清晰状态,并调整卵母细胞的极体使其位于12 点或6点的位置。ICSI注射针对准卵母细胞的J下中3点位置,随即将精子推至 注射针尖端处,并垂直穿过透明带及卵母细胞胞浆膜进入细胞浆内,回吸部分 细胞浆使细胞浆膜破裂,然后将回吸的细胞浆连同精子注入细胞浆内,最后退 出ICSI注射针,精子留于细胞浆内。 1(2(6受精卵和胚胎的评价 1(2(6(1受精卵评价 于ICSI操作后16(20h观察受精情况:未受精 无原核 、正常受精 双极 体和双原核 和异常受精 一个或多个原核 。’ 1(2(6(2胚胎的评价 速度正常的前提下,形态学评分标准为: I级:细胞大小均匀,形状规则,透明带完整,胞质均清晰,无颗粒及多 ‘ 核现象,碎片 5,。 II级:细胞大小略不均匀,形状略不规则,透明带完整,胞质可有颗粒, 碎片 20,。 III级:细胞大小明显不均匀,可有明显的形状不规则,胞质可有颗粒现象, 碎片 50,。 ?级:细胞大小严重不均,胞质可有严重颗粒现象,碎片芝50,。 I级与II级胚胎为优质胚胎,III级胚胎为可利用胚胎,?级胚胎为不可利 用胚胎。 1(2(7统计分析 的精确检验。检验水准为a O(05。 6 结果 2 结果 2(1 一般情况 共采集到未成熟卵母细胞265枚。未成熟卵母细胞中155枚 为MI期,另 110枚为GV期,进行体外培养后,24h成熟卵母细胞126枚成熟率为47(5,, 48h共成熟卵母细胞165枚成熟率为62(3,,成熟卵均行ICSI授精。 2(2 比较三组培养液对未成熟卵母细胞体外成熟影响 三组培养液培养未成熟卵母细胞,24h的成熟率比较差异,均无统计学意义 B组 57(3, 高,差异有 意义 Z2 9(07,P 0(05 ,C组48成熟率 74(7, LL 后,差异无统计学意义 p 0(05 。 三组培养液对MI期卵母细胞进行体外培养后24h成熟率两两比较,差异均 差异有统计学意义 Z2 4(97,P 0(05 。 三组培养液对GV期卵母细胞进行体外培养后24h成熟率两两比较,差异均 差异有统计学意义 Z2 4(93,P 0(05 。 表l 三组培养液进行体外培养成熟卵母细胞情况比较 7 结果 续表1 2(3未成熟多|l母细胞所处时期对体外成熟的影响 尸 O(05 。 表2 MI期与GV期卵母细胞体外成熟率的比较 2。4三组培养液对IVM成熟卯受精、卯裂和可利用胚胎形成的影响 C组未成熟卵母细胞体外培养后卵裂率、可利用胚胎率 91(3,,66(7, 较B C组未成熟卵母细胞体外培养后卵裂率、可利用胚胎率 91(3,,66(7, 较A B组未成熟卵母细胞体外培养后卵裂率、可利用胚胎率 71(0,,40(9, 较A 组 67(6,,36(O, 高,差异无统计学意义 P O(05 ; 三组未成熟卵母细胞体外培养成熟正常受精率、异常受精率两两比较,差 得卵裂数及可利用胚胎数少,故在此合并后进行统计学分析,不单独进行计算。 8 结果 表3三组培养液体外培养成熟ICSI后的受精、发 育情况比较 A 47 2 1 1 44(7, 6 34(0, 25 67(6, 9 36, B 47 19 40(4, 12 25(5, 22 71(O, 9 40(9, 9 讨论 3 讨论 第一例IVF(ET获得妊娠并成功分娩的方案是自然月经周期【l6|,但使用COH 促使多个卵泡生长是目前常规IVF的主流;即先应用2(3周的促性腺激素释放激 素激动剂 GnRH-a 使得垂体降调节成功后,再根据个体化调节外源性促性腺 激素 如FSH或HMG等 的剂量,目的是制造超生理的激素环境进而使多 个卵泡同时生长;最后通过注射HCG用来模拟体内的LH峰,最终激发卵母细 胞的成熟。由于卵母细胞群的不均一性,导致采集得到的卵母细胞并不处于同 一时期。大部分得到的卵母细胞为成熟卵母细胞 MII期卵 ,大约有15,为未 成熟卵母细胞 处于GV期或MI期 【21。另外,在IVF助孕中, 有的患者由 于对超促排卵反应差,仅有单个或两个卵泡发育而取消周期;还有一些患者取 卵后得到的卵母细胞大部分或全部均未成熟,导致助孕结局很差。如果能够把 这些未成熟卵母细胞体外培养成熟并加以利用,就会增加可利用胚胎和冷冻胚 胎的数量,从而提高累积妊娠率,使这些患者的助孕成功率也有所提升【6】,在国 外已有报道对于来源COH周期中未成熟卵母细胞经体外培养成熟后行ICSI并 进行胚胎移植已有健康胎儿分娩”181。近几年辅助生殖体外培养技术得到进一 步的发展,因此将IVF周期中获得的未成熟卵母细胞进行体外培养成熟并加以 利用的可能性也越来越大。 未成熟卵母细胞体外培养成熟后形成的胚胎常发生卵裂延缓或停滞,胚胎 质量欠佳(导致妊娠率低,移植胚胎发育潜能在此起着关键作用,而卵子的质量 与移植胚胎的发育潜能密切相关。通常经IVM培养后的卵母细胞质量较差,而 未成熟卵母细胞的成熟过程直接影响卵母细胞质量的好坏。卵母细胞的成熟一 般分为细胞核的成熟和细胞质的成熟,通常细胞核成熟的表现包括:卵母细胞 vesiclebreak 减数分裂的重新启动、生发泡的破裂 germinal down,GVBD 和排 出第一极体,最终卵母细胞静止在第二次减数分裂的中期 MII期 。胞质的成 熟是胞浆为受精和胚胎的发育所做的准备,其过程较为复杂,通过生化分子和 细胞改变,以保证胞浆内的双极纺锤体和线状排列的染色体形成,这样才能支 持正常受精和胚胎的发育。核成熟不能确保胞质的成熟,胞质的成熟控制着核 成熟,这两个过程密切相关。此外越来越多的文献指出卵膜表面在细胞成熟过 程中也发生了修饰和改变,即为膜成熟【l9】;在自然发育的卵母细胞中,胞核、 10 讨论 胞质与胞膜的成熟是高度统一的,但是经过体外成熟培养后,胞核、胞质与胞 膜通常不能完全同步成熟。只有应用有效的体外成熟培养系统才能使胞核、胞 质与胞膜同时成熟进而支持正常受精和胚胎的进一步发育。 尽管经过多年的发展,IVM仍然存在这些问题: 1 卵母细胞的IVM成熟率 较低; 2 成熟后卵母细胞的体外受精率较低,这是因为经过一段时间的体外培养, 皮质颗粒的释放因而使得透明带变硬,精子的进入受到阻碍,而这种变化可能 还会使胚胎的孵化受到影响,最终导致不能着床; 3 可利用胚胎形成率与妊娠率 较低,这可能与体外培养的卵母细胞成熟后的发育潜能降低有 关。 3(1 未成熟卵母细胞的体外发育 卵丘细胞是卵母细胞的发生过程中紧密包绕的多层颗粒细胞。它对调节卵 母细胞的发育起着重要的作用,颗粒细胞与卵细胞之间传递物质是需要通过缝 隙连接完成,有研究显示在培养体系加入缝隙连接抑制因子,发现卵母细胞的 细胞核成熟不被影响,但影响到细胞质的某些因子,使进入卵母细胞的精子无 法形成雄原核,且由颗粒细胞分泌的谷胱甘肽的浓度也大幅度下降。颗粒细胞 在FSH和LH的刺激下,可分泌一些可溶性的营养物质,并清除一些不利于胚 胎发育的抑制物质,从而使卵子的细胞核与细胞质同步成熟。卵冠丘复合物的 超微结构显示,在卵母细胞的细胞膜 卵黄膜 上,有着许多朝着透明带 ZP 突起的微绒毛。卵丘细胞与卵母细胞的接触可以通过这些突起的微绒毛,通过 ZP微绒毛传达信号给卵母细胞,提供某些营养物质,同时也作为激素、生长因 子等多种物质的介质,使这些物质对卵母细胞产生作用。 本研究共采集到未成熟母细胞265枚,进行体外培养后,24h成熟126枚 养环境中完成核成熟。可能是因为通过透明带的微绒毛与卵母细胞质膜间隙连 接进入卵母细胞或直接被吸收,体外培养液中某些刺激核成熟的信号可以通过这 种方式传达到卵母细胞f2们,另外我们在进行ICSI的过程中,用透明质酸酶剥脱 颗粒细胞时如为未成熟卵母细胞通常都会残留部分颗粒细胞,这部分残留的颗 粒细胞在未成熟卵母细胞的体外培养过程中发挥了一定作用。 3(2 FSH、LH对未成熟卵母细胞体外成熟及发育潜能的影晌 讨论 在培养液中添加FSH和LH是目前大多数IVM所会采用的方法,这是由 于在体内卵母细胞成熟过程中它们所发挥的重要的生理作用。人体内的窦前卵 泡、窦卵泡和排卵前卵泡的发育和成熟过程中FSH和LH都发挥了重大作用。 排卵前卵泡要形成LH受体必须要有FSH[21】作用,近几年已有报道小引22】和人 类卵母细胞、受精卵和种植前胚胎中,出现FSH和LH受体的mRNA,表明 Gn在调节卵子成熟过程中,对重新启动并完成减数分裂具有潜在的作用【2习;卵 子在体外成熟时对FSH有依赖性,它不仅有利于受精及胚胎发育,还可以促进 颗粒细胞扩展;LH是体内诱导卵母细胞最终成熟的重要环节,使卵子恢复减数 分裂,LH峰可以诱导颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙连接减少,从而阻止抑制 因子进入卵母细胞,使减数分裂恢复,LH还可以促进卵子受精后的胚胎发育。 此外有研究证实LH作用于卵丘细胞上是间接的,LH受体高度表 达在壁颗粒细 胞和外部的卵泡膜细胞,而卵母细胞和卵丘细胞LH受体表达很少或根本没有 LH受体,因此卵母细胞与卵丘细胞直接暴露于体外的LH的培养液中是无法响 应LH的【241。说明LH要发挥它的作用通常需要通过壁颗粒细胞,LH作用于壁 颗粒细胞,壁颗粒细胞释放的因子通过旁分泌途径到达卵丘细胞上【251。有研究 表明,小鼠排卵前LH通过刺激壁颗粒细胞生产和释放表皮生长因子 EGF 的 些LH释放的双调蛋白和EREG可以使卵丘扩展与卵母细胞成熟【261,这些研究 表明LH执行它的能力需要通过刺激壁颗粒细胞分泌EREG和双调蛋白,这些分 泌因子反过来作为LH旁分泌的介质为LH服务。 B组的GV期卵母细胞成熟率要高于A组GV期卵母细胞,虽然差异无统计学 意义,但可以看出添加激素后的IVM培养液对GV期卵母细胞的成熟率提高是有 帮助的,可能是因为GV期卵母细胞体外成熟的培养条件要求高,单纯的IVM培 养液培养不能得到很好的体外成熟环境,激素的添加似乎能够得到较为满意的 效果。 B组的48成熟率不如C组高可能是因为B组仅添jJl:lGn而没有成熟卵泡液中所 含有的自然促成熟因子有关,此外Accardo等【27】研究提示Gn需要通过卵丘颗粒 细胞才能有效的发挥其作用,由于本研究所收集到的未成熟卵母细胞脱去了大 部分的卵丘颗粒细胞故使得Gn的促卵母细胞成熟作用减弱。 B组卵裂率、可利用胚胎率均要高于A组提示激素对卵母细胞的发育潜能的 提高也具有一定作用,本研究在ICSI脱颗粒的过程中卵母细胞未完全脱去所有颗 12 讨论 粒细胞,有部分未成熟卵母细胞残留着少许颗粒细胞,这些少量残留在卵母细 胞上的卵丘颗粒细胞通过Gn的刺激分泌雌激烈28】等物质,从而促进卵子RNA和 蛋白质合成【29】进而提高卵母细胞的发育能力。 3(3 成熟卵泡液对未成熟卯母细胞体外培养后发育潜能的影响 成熟卵泡液是一种淡黄色、清亮的液体,它是卵泡在发育和成熟的过程中由 激素和自循环中渗出的液体以及其他一些蛋白质、糖和细胞因子等物质积聚于 卵泡细胞周围的颗粒细胞的间隙中形成的【30】,随着卵泡的继续发育,卵泡液逐 渐增多,卵泡液中含卵子生长发育所需的多种生长因子、蛋白质、类固醇激素 和促性腺激素等其它物质,对卵子的成熟和排出起着重要的营养和调节作用。 添加卵泡液有利于提高原核形成率【311,卵泡液中含有成熟抑制因子维持卵母细 胞于成熟停滞状态,促使胞质及核成熟的同步化。 卵子体内成熟过程的调控是非常复杂的,卵母细胞成熟的分子机制主要为 蛋白质的磷酸化和去磷酸化;最早在青蛙卵中发现成熟促进因子 M(phase promotingfactor,MPF 能够激发成熟分裂的恢复。目前已经知道MPF是由 p34cdc2和cyclinB组成的,在生发泡破裂时MPF可以被激活,说明MPF在卵子成 熟过程中可以诱导蛋白质的磷酸化和去磷酸化,这对卵子的成熟起着重要作用。 本研究提示C组卵母细胞48h成熟率显著高于其余两组,这可能是因为卵泡液中 含有激素和MPF[32】。MPF通过透明带的微绒毛进入卵母细胞或被直接吸收,另 外它还可以通过残留的部分颗粒细胞把刺激信号都传给卵母细胞从而提高其核 成熟率。 本研究发现应用C组培养液后其卵裂率及可利用胚胎率均显著高于另外两 组,可能是因为卵泡液中含有天然的促成熟物质和成熟抑制因子维持卵母细胞 于成熟停滞状态,成熟抑制因子可以通过抑制细胞核的成熟过程,使细胞质先 进行一定的蛋白质合成,一段时问后MPF再促进细胞核的成熟,这种抑制与促 进成熟的物质共同作用下,最终促使胞质、胞核的成熟同步化,从而提高卵母 differentiationfactor 子9 growth 9,GDF9 或骨形态蛋白15 bone morphogenetic protein 于提高卵母细胞发育潜能,此外,国内李春艳等首次针对PCOS患者,观察从她 13 讨论 们体内获得的未成熟卵母细胞体外成熟后的GDF(9表达情况【34】,首先他们在 PCOS患者中采集未成熟卵母细胞。经体外成熟培养后,再进行免疫组化实验比 较不同成熟度的卵母细胞及这些卵母细胞周围颗粒细胞中的GDF 一9表达差异, 进行免疫组化实验后发现其GDF(9表达的出现差异,结果显示经体外培养后成 熟的卵母细胞GDF(9的表达最高,而体外培养后仍处于未成熟的状态的卵母细 胞中表达则较低。说明人类卵母细胞的体外成熟可能与GDF(9有关。研究证实 5,因此在体外培养液中添加成熟卵 成熟卵泡液中通常含有天然的GDF9和BMPl 泡液可能有利于提高卵母细胞的发育潜能,这与本研究结果相符。 熟率无差别,卵泡液中天然的促成熟因子可以显著的提高MI期卵的成熟率,对 于MI期卵母细胞应优先选择添加有成熟卵泡液的IVM培养液进行体外培养。 C组GV期卵母细胞成熟率比其余两组高,这是因为成熟卵泡液中除了含有 适量的天然激素,另外在人类IVF周期中卵泡液中含大量的表皮生成因子 EGF 和家族成员双调蛋白【35】,已有研究证实EGF样生长因子在各种哺乳类动物的卵 母细胞体外培养液中占有重要地位【36】,它的添加能够提高IVM的培养效果,以 71,EGF可以直接作用于 往有研究认为这是因为在卵母细胞上存在EGF受体表达【3 卵母细胞【38。391,而目前大多数人认为EGF样生长因子对卵母细胞的细胞核和细胞 质成熟的影响都是间接依赖卵丘细胞【401(在实验过程中,由于未成熟卵母细胞都 残留部分颗粒细胞,这些在卵泡液中的EGF样生长因子对GV期卵母细胞成熟率 发挥作用,这与I(Ben(Ami等【41】于艮道的相符。 本研究人成熟卵泡液取自输卵管因素?F周期LH峰后的成熟卵泡,其 中含有卵母细胞自然成熟所具备的全部成分和因子,故体外成熟效果好。对成 熟卵泡液的成分进行深入的研究,进一步明确其促卵母细胞成熟机制,对开发 新的IVM培养液,改善IVM的临床结局有重要意义。 3(4不同时期未成熟卵母细胞体外成熟及发育潜能的差异 本研究发现MI期卵母细胞的48h成熟率均高于GV期卵母细胞,说明MI期卵 母细胞体外培养效果要优于GV期卵母细胞,可能是因为M1期卵母细胞更接近成 熟对体外培养环境的要求要低于GV期卵母细胞,目前所用的IVM培养液可能更 适合用于MI期卵母细胞培养,对于GV期卵母细胞体外培养需要进一步探索适合 14 讨论 它的培养体系。目前IVM培养液需要进一步改进其成份,或者分成两个不同阶段, 分别对GV期及MI期卵母细胞进行培养,以利于不同发育期卵母细胞的体外成 熟。因此,MI期卵母细胞比GV期卵母细胞体外培养成熟率高,对常规IVF中尤 其是卵巢反应低的患者所获得的未成熟卵母细胞进行体外培养时应首选MI期卵 母细胞。 三组中MI期的卵母细胞24h成熟率均高于GV期,可能是因为GV期卵母细 胞与MI期卵细胞相比,成熟过程中要多出生殖泡破裂时间,在体外进行培养成 熟需要更长的时间。 本研究的培养结果显示MI期卵母细胞体外培养成熟时间要少于GV期,经 MI期培养成熟的卵母细胞其成熟率和卵裂率也较经GV期培养成熟的卵母细胞 高,这与滕晓明[421等结果相符,提示卵母细胞培养成熟时间越短,发育潜能越好, 对常规IVF中尤其是卵巢反应低的患者所获得的MI期卵母细胞进行常规的IVM 培养,较GV期卵母细胞更好, 以期提高卵的周期利用率,可以增加可利用胚胎 及累积妊娠率。 3(5未成熟卵母细胞体外成熟后受精方式的选择 本研究受精方式均采用ICSI受精,这是由于不成熟卵母细胞经体外培养后由 于体外培养的时I’日J较长,其透明带变硬,采用常规IVF受精其精子不容易穿透, ICSI受精方式则避免了这一情况的出现,而另一研究证实体外培养成熟的卵母细 胞在经ICSI受精后形成的胚胎的染色体与体内成熟卵子经ICSI和IVF后得到的胚 胎相比,结构异常的发生和非整倍体率均无增加,因此体外培养后的卵母细胞 通常采用ICSI受精【431,本研究结果显示三组受精率未见明显差异,提示经ICSI 受精的体外培养成熟的卵母细胞,不因为培养液所添加的成分的不同,而影响 受精率,ICSI可能是体外培养成熟的卵母细胞较好的受精方式。 综上所述,本研究提示IVM的培养过程中,培养液的添加成分至关重要,其 中卵泡液内含有卵母细胞自然成熟所具备的某些成分和因子,但这些卵泡液内 含有的生长因子由于来自促排卵后,故其含有生长因子的浓度可能并不是最适 宜体外培养的浓度,我们需要对此进一步研究,对卵泡液的成分进行深入的研 究,进一步明确其促卵母细胞成熟机制,对开发新的IVM培养液,改善IVM的临 床结局有重要意义。未成熟卵母细胞体外成熟培养虽然添加激素不及添加卵泡 15 讨论 液效果好,但由于目前卵泡液的使用可能存在交叉感染的风险,限制了临床的 应用,而添加激素比单纯的商品化IVM培养液培养效果要好,因此在临床上值得 推广。另外,MI期卵母细胞比GV期卵母细胞体外培养成熟率高,对常规IVF中 尤其是卵巢反应低的患者所获得的未成熟卵母细胞进行体外培养时应首选MI期 卵母细胞。 目前,虽然IVM应用前景可观,但是仍然不能如常规的IVF(ET技术一样广 泛应用于临床上,这与多种因素有关如:COH的促排方案、卵子的采集时间、 因此,进一步深
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