瓜类枯萎病拮抗放线菌的筛选

瓜类枯萎病拮抗放线菌的筛选 瓜类枯萎病拮抗放线菌的筛选 北方园艺2006(4):177,179?植物保护? 瓜类枯萎病拮抗放线菌的筛选 杨宇,吴元华,郑亚楠 (沈阳农业大学植物保护学院,110161) 摘要:奉试验通过平板稀释法从辽宁省保护地瓜类作物根际土壤中分离出4椿对黄瓜枯萎病菌(Fu— sariumoxysporumsp.cucumarJnumOwem)有抑制活性的拮抗放线菌株,采用孢子萌发法,生长速率法 进行抑茵测定.结果表明:4茵株对黄瓜枯萎病菌孢子萌发及茵丝生长都有不同程度的抑制作用,其抑制 率在6O,7O左右.通过胚根接种盆栽试验结果表明;4菌株在田ii3可有效遗.控制黄瓜苗期枯萎病,其 中65号菌株防效最好,其发酵液1O倍液和5O倍液的防效分别述91_8和91.4.同时4种菌株代谢 物质均有促进黄瓜种子萌发与幼苗根系生长的作用. 关键词:瓜类枯萎病;拈抗放线菌;筛选;生物防治 中圈分类号:s432.43文献标识码:B文章缩号:1OO1一OOO9(2OO6)O4一O177一O3 瓜类枯萎病是瓜类作物的主要病害之一,全国各地均有 发生,病害常年损失率在1O,3O%左右.该病菌的厚垣 孢子可以在土壤中存活5,6a年,并通过土壤中存活的菌丝 和厚垣孢子周而复始的进行越冬,侵染,为害,传播.由于侵 染途径多样,从侵染到发病的时间相差很大,防治比较困难, 一 旦发病很难控制,生产上主要采取化学药荆防治.随着人 们对生态农业和环境意识的提高,化学防治的种种弊端已越 来越引起人们的关注,从微生物及其代谢产物中寻找控制病 原菌的生物农药成为新农药研究的一个重要方向[1].迄今 为止已发现有近百种微生物农药来自于放线菌的次生代谢 物[2],其中有多抗霉素,农抗120,武夷菌素,新生霉素,中生 菌素[3.'等环境友好型生物农药.本试验从辽宁省不同地 区瓜类作物根部分离放线茵,并从中筛选对致病菌有抑菌活 性的菌株,通过对筛选出的菌株进行进一步的测定与田同防 效试验,为防治瓜类枯萎病提供新的途径. 1与方法 供试土样来自辽宁省瓦房店,朝阳,丹东,确州等14各 地区的地瓜类作物根际土壤,供试靶标病原菌尖孢镰刀菌 CFu~riumoxysporum)分离自沈阳农业大学园艺学院,瓦 房店,怖州地区保护地甜瓜,黄瓜病株. 供试分离镰刀菌培养基为PDA培养基,对峙筛选试验 培养基为PSA培养基,分离放线菌为高氏1号培养基,放线 菌发酵采用玉米粉一大豆培养液培养基(大豆粉20g,玉米 粉5g,葡萄糖20g,碳酸钙5g,水1OOOmD. 1.1土样的顶处理与菌株的分离 将所采集土样分别取lOg并分别与1g碳酸钙混和均 匀,放入28?的温箱中培养一周左右备用.取处理后的土 样倒入lOOml无菌水中,置150r/mia的摇床上震荡20mia, 静置后用移液管吸取土悬液Iml加9ml无菌水中稀释至 1O,1O倍,将稀释好的土悬液同加有硅酸链霉素的 PDA培养基充分混合后制成平板,放入25?的温箱中培养 ?基金项目l辽宁省.十五科技攻关重点项目(2oo12o8oo1). 收稿日期t2006—01—23 4,6d.将平板上的单菌落移置于高氏一号斜面中保存并编 号. 1.2拈抗放线菌株的活性测定 对峙法测定:将尖孢镰刀菌用打孔器打出直径6mm的 菌饼接与PSA培养基平板中央.四周接4株放线菌,每处理 3次重复,于28"C下培养6d后测量抑菌带的大小,记录有拈 抗活性菌株的编号. 孢子萌发测定:取初筛抑菌效果好的菌株进行摇瓶发 酵.首先在无菌条件下,用刮铲刮下放线菌孢子,接入高氏 一 号培养基上涂抹均匀,置于28"C恒温培养箱中培养5, 6d,待菌落表面颜色变深,大部分孢子已成熟后,刮下孢子接 入装有lOOml液体培养基的250ml三角瓶中,于28?,160r/ m.m条件下振荡培养7d,用纱布滤除菌丝体,10O00r/min 离心20rain,除去孢子,取发酵滤液备用,将发酵滤液原液, 1O倍液分别同镰刀菌孢子悬浮液混合,取于0.2ml滴于凹 玻片上,以未接菌的发酵滤液为对照,保湿培养9h,观察记 录镰刀菌孢子萌发数量及萌发情况,计算萌发率.孢子萌发 抑制率的计算公式为;孢子萌发抑制率(%)一(对照萌发率 一 处理萌发率)/对照萌发率×100. 生长速率法测定:取菌株发酵液,用蒸馏水将待测样品 稀释成不同浓度,与定量的PSA培养基混合后倒入直径为 9cm培养皿内,制成5倍液,1O倍液,2O倍液,5O倍液及100 倍液5个浓度的带毒培养基平板,平板中央分别接入直径为 6mm的镰刀菌菌饼,每菌株重复3次,以未接菌发酵液为对 照,26"C培养5,6d,用十字交叉法测量菌落增长直径,求出 茵丝生长抑制率.茵丝生长抑制率的计算公式为:茵丝生长 抑制率()=(对照菌落直径一处理菌落直径)/对照菌落直 径×100. 1.3优势放线菌的田问防效测定 对黄瓜种子萌发的影响:将4株优势放线菌菌株5d发 酵液滤液,分别配制成1O,50,100倍液待用.每处理选取饱 满的山东密刺黄瓜种子25粒.将配制好的上清液各取5m1 分别装入培养皿中,然后将黄瓜种子均匀放置在皿中.重复 3次,设清水对照.置28"C下保湿培养24h后,记载萌发种 】77 ? 植物保护?北方园艺2006(4):177,179 子的主根长度,须根数目及单株鲜重. 对黄瓜幼苗生长的影响:每处理取山东密刺黄瓜种子 12粒,将4种供试菌株发酵滤液配制成5倍液浸种.24h后 取出种子在浓度为1×1O个/nil的尖孢镰刀菌孢子悬浮液 中浸种1h.将浸种后的种子取出分成2份,一份播于育种 钵内每钵24粒,重复3次,设置清水对照.待种子出苗后, 记录出苗情况.计算出苗率.另一份播于装有灭菌营养土的 花盆中,生长20d后,调查株高,叶面积,单株鲜重及病情指 数,计算相对防效.病情指数的计算公式为:病情指数=? (各级发病数×该级代表数)/(总株数×最高级代表值),相 对防治的计算公式为:防治效果()一(对照病情指数一处 理病情指数)/对照病情指数×100. 2结果与分析 2.1活性放线菌菌株的初筛结果 通过对瓜类作物根部放线菌的分离培养,从2O余种土 样中共分离到放线菌134株,经过与尖孢镰孢菌对峙培养结 果表明:有活性的菌株可产生抗生物质抑制尖孢镰刀菌菌丝 的生长,在有活性的放线菌一侧,镰刀菌的菌丝生长明显受 到抑制,菌丝边缘表现为停止生长或向上生长,边缘有整齐 的横截面,抑菌活性越高的菌株抑菌带越宽,根据抑菌带宽 度筛选出24,5O,65,85,120,124,210等7株优势放线菌.占 总分离菌的4.5. 2.z优势放线菌株对镰孢菌菌丝生长及孢子萌发的影响 表1优势放线菌对尖孢镰孢菌苗落生长直径的影响cm ?株及维虚2'5O858512o12'21OcK 5倍'2.o36.536.132.136.1z'.822.o55.5 10倍'7.636.835.832.536.'25.227.5 20倍'8.I37.o36.53'.836.727.831.5 5O倍49.'38.534.536.836.931.535.o lOO倍55.53'.836.537.737.434.837.5 菌落增长直径越大表明铼刀菌茵丝生长旺盛,菌落直径 越小则说明放线菌的抑菌活性越高,抑制菌丝生长的效果越 好.由表1看出,同一种放线菌的发酵液在培养基内的浓度 越高,菌丝生长直径越小,抑菌活性越大,124,210号的抑菌 活性最强,5O,65,85号次之,124,210两种菌株的抑菌活性 随浓度变化较明显,其余5种菌株变化不明显. 裹2优势菌株对镰孢菌孢子萌发的影响 '585l"Z10a【 ?糠及摊度 ?盘?|.???盘?抑?事?盘????盘?|.???童事 曩矗39.253.35'.535.143.1'8.'ao.863.38'.0 1O倍'2.349.'52.237.947.943.038.853.? 由表2看出4菌株发酵液对尖孢镰刀菌孢子萌发都有 一 定的抑制作用,其中以210,65两株菌株的抑制作用最强, 原液的抑制率达到了7O与61%.同时,经过发酵液处理 的病原菌孢子萌发产生的芽管都表现出不同程度的畸形,其 中65号菌株的孢子萌发产生的芽管短粗,210号菌株的孢 子萌发后芽管产生膨大的球状体,继而球状体内容物消失, 菌丝体消解.由此可见210菌株发酵液在抑制病原孢子萌 发的同时对孢子萌发后的生长也有一定的影响. 2.3对黄瓜种子萌发的影响 菌株65,85,124,210浸种结果表明:4菌株不同浓度处 178 理种子结果均好于对照,在主根长度上除124的100倍以 外,其余各处理的主根明显增长,以210的三组处理最为明 显,增长均在10mm以上;在须根数量上,各处理须根数量明 显多于对照处理;同时各个处理在单株鲜重上都有不同程度 的增加.由于瓜类枯萎病菌易从幼苗根部侵染,而后系统发 病,放线菌发酵液促进了幼苗根部的生长发育,从而提高了 幼苗抵抗病原菌侵染的能力.试验结果表明:4种活性放线 菌菌株发酵液对黄瓜种子萌发均有促进作用,所试浓度对种 子萌发没有不良影响. 裹3优势菌株浸种对黄瓜种子萌发的影响 2.4对黄瓜幼苗生长及枯萎病防治效果的影响 裹4优势菌株发酵液对黄瓜幼苗生长及枯萎病防治效果的影响 由表结果看出,4株菌株发酵滤液不同浓度处理后的种 子的出苗情况都明显好于对照处理,死苗率低,幼苗长势健 壮,其中以65号菌株处理的出苗情况最好,出苗率达92.O 和92.3;在生长状况上也有显着差异,4种菌株处理的幼 苗在株高,叶面积,单株鲜重上都明显高于对照处理.其中 124,65号菌株的株高略高于其他处理,210,65号菌株的叶 面积略大,124号菌株的单株鲜重最重,整体以210,65号菌 株最好,植株长势旺盛,根茎粗壮,叶色浓绿;在防治效果上 各处理的病情指数明显低于对照处理,对苗期枯萎病均具有 较高的防治效果,以65号菌株处理在病情指数最低,两个浓 度处理的相对防效分别达91.8和91.4. 3结论与讨论 本研究从黄瓜根部分离出放线茵134株,其中对尖孢镰 刀菌有抑制活性的菌株7株,占总分离菌株的4.5%.经过 对4株优势菌株采用浸种与灌根的方法进行田问药效测定 表明,4种菌株均显示出了较好的抑菌和促进植株生长作 用.由于瓜类枯萎病是一类幼苗侵染的病害,植株在苗期的 生长状况直接影响其对病害的抵抗能力.通过试验,4株放 北方园艺2006(4):179?植物保护? 寒冷地区梨树干枯病及防治 丁丽华,赵晨辉,邹利人 (吉林省农业科学院果树所,公主岭1361oo) 中图分类号:$436.612.15文献标识码:B 文章编号:1001—0009(2006)O4—0179—01 梨树干枯病又称干腐病,是一种危害梨树苗木和枝干的 真菌病害.病源为Phomops~fukushffTanaka etEndo.寄主为中国梨和日本梨,如秋子梨,白梨,沙梨 等,是寒冷地区梨园经常发生的一种常见病害.严重影响梨 苗生长和造成成龄梨树大量死枝或死树.因此,必须加强预 防才能使梨树安全丰产. 1主要症状 1.1病苗 初发病在茎基部表面出现圆形暗色水渍状斑点;后扩展 成椭圆形,棱形或不规则形状红褐色病斑;以后病斑逐渐凹 陷,病健交界处产生裂缝,并在病斑表面密生黑色小粒点. 再后变黑干缩.随着褐色病斑的侵害加深病斑围茎1/2以 上时,因梨树苗水分和营养输送受到阻碍而上部逐渐萎蔫干 枯变黑死亡,刮风时易折断. 1.2成龄树多在枝干上发病 症状与幼树苗发病相似.严重时病部凹陷,干裂,翘起, 露出木质部,后期在病树皮表面上出现散生的细小黑色点粒 状突起一即孢子嚣.严重时引起死枝死树. 2病害侵染过程 Z.1病害的潜伏寄生体 梨树干枯病的病菌,以多年生茵丝体或分生孢子嚣,分 生孢子,子囊壳在被害部位皮层中寄生越冬. 2.2病原体的成长 越冬后,随着春天温度的提高,春雨的滋润,在温湿度条 件适宜的情况下茵丝蔓延或分生孢子嚣散发孢子. 2.3病害侵来过程 每年5,6月随着雨季的来临,茵丝或孢子借助风雨的 传播,引起初次侵染.苗木(包括山梨苗)和幼树受害比较明 显,6月份蔓延速度加快.成龄树一般是从修剪和其他的机 械伤口侵入,生长势衰弱的树发生较重. 收稿日期:20o6—02—27 3发病条件 3.1温,湿度 5月份阴雨多湿,有利孢子放散和侵来;5月下旬至6月 份的阴雨多湿有利于病疤扩展;6月下旬以后的高湿抑制病 势的发展. 3.2栽培条件 土壤瘠薄或保水保肥能力差的沙砾多的地块容易发病, 土壤有机质多,肥力好,通透性好的土壤发病较轻;地势低 洼,排水不良的地块容易发病,地势较高,通风排水好的地块 发病较轻;长势弱的树发病较重,健壮的树不易发病. 4防治方法 4.1药剂防治 4.1.1春季剪砧抽梢后,喷药保护,预防初侵染.药舟j及使 用如下:早春喷5度石硫合剂一次}在苗木生长期,喷1:2 :200(倍量式)波尔多液,1O,15d一次,共两次;50退茵 特800倍液7,10d一次,共2,3次.70%甲基托布津1 000~1200倍液10d一次,共2,3次;多茵灵,百茵清等亦 可用于防治.已发病的苗木,应于发病初期刮除病斑,并用 托布津油膏涂抹病部,或涂s_-921抗茵剂2O,3O倍液或 2的401抗茵剂.也可不刮除病斑,用刀将病斑纵向划条, 然后涂抹401抗茵剂2O倍液. 4.1.2幼树及成龄树防治可于萌芽前喷布5.Be石硫合 剂;萌芽后喷布0.5oBe石硫合剂;也可参照上述方法防治. 但是,应事先检查,刮除病患部后再行施药. 4.2人工防治 梨干枯病主要为害10a以下枝条苗木,所以防治重点是 在苗圃和幼树. 4.2.1苗木检验梨干枯病可以通过苗木传播,所以调运 的苗木必须经过检验. 4.2.2合理选用苗圃地,选择地势高,通风和光照条件好的 岗地作梨苗圃,从泺头防御病害. 4.2.3加强栽培管理,增强树势,提高树体的抗病力. 4.2.4加强树体保护,战少伤口.对修剪后的大伤口,及时 涂抹油漆或动物油,以防止伤口水分散发过快而影响愈合, 预防病菌侵入. 4.2.5及时清除病苗,病枝和病疤,烧毁,尽量减少病源. 4.2.6低洼地注意开沟排水和降低地下水位;粘重的地块 要注意增强施有机肥,压绿肥,或掺沙改良根系生态环境;窝 风的地块应注意通风. 4.2.7苗圃地萌芽抽梢后,除注意喷药(见前述)预防侵来 外,还要经常检查苗木新梢的根茎部位,发现病疤,病苗及时 剪除病部,而后再施药消毒保护. 4.2.8已定植的幼树和成龄树,5,6月应经常检查,发现 病患及时清除侵来的部位或剪断患病枝条. 线菌的发酵液不仅具有抑菌作用,还在不同程度上促进了植 株的生长发育,尤其在胚根接种试验中,4种菌株均表现出 了很高的促根作用. 在4菌株中,以210,65两株菌株的各项结果较好.虽 然65号菌株的离体抑菌活性小于210号菌株,但它在田问 试验中表现出了很好的防治效果.由于一部分抗生素类生 物农药具有很好的内吸作用,能在作物体内传导,更好的抑 制病原真菌孢子萌发,芽管生长以达到防治病害的目的,65 号菌株较210号菌株也可能具有更好的内吸性,或者该发酵 液能诱导黄瓜产生了对枯萎病菌的抗性,有待于通过对其防 病机理的进一步深入研究来加以揭示. 同化学农药相比,防效一直是制约生物农药发展的瓶 颈,本次试验所筛选出的210,65两种菌株显示了良好的生 防活性及较高的田问防效,由于试验时间,条件的限制,研究 还只是刚刚开始,若要将其用于大面积田间防治还有许多抑 菌机理,菌株改造,药效稳定性等方面的研究需要进行. 参考文献: [1]刘训理,崔云龙,张国珍,等.S一921抗生索中部分理化性质 研究[刀,山东农业大学,1995,26(2);199—204. [2]中国科学院微生物研究所放线菌分类组,链霉菌鉴定手册 [M].北京t科学出版社,1975, [3]阮继生,刘志恒,宋丽儒,等,放线菌研究及应用[刀.北京:科 学出版社,1990. [4]阎逊初,芦运玉,邓宇秀,等.微生物[n,1962,8(4);391—401. 179