左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素表达与HPA轴活性作用的实验研究【文库论文】

左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素达与HPA轴活性作用的实验研究【文库论文】 左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素表达与HPA轴活性作用的实验研究 ====================================================================== 作者:姚建平， 金国琴，戴薇薇， 姚龄爱，康湘萍 【摘要】 目的观察老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)表达和血清皮质酮(CORT)含量变化和左归丸、右归丸对其的影响，探索老年肾虚大鼠CRH多肽表达与下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴活性的相关性及左归丸和右归丸的作用。方法以自然衰老SD雄性大鼠(24月龄)为肾虚衰老模型，大鼠随机分为老年对照组、左归丸组和右归丸组，每组35只，另设青年对照组(5月龄)35只，共4组。老年对照组大鼠常规喂养至24月龄。左、右归丸组大鼠自20月龄始，均按相当于左、右归丸生药7.5g?kg-1(成人临床用量的15倍)自由饮用稀释药液，每周停药2 d，连续4个月;采用Western Blot检测大鼠杏仁核CRH多肽表达, 放免检测血清CORT含量。结果与青年对照组比较，老年对照组大鼠杏仁核CRH多肽表达及血清CORT含量显著增高(P<0.05)，与老年对照组相比，左归丸组及右归丸组大鼠杏仁核CRH多肽表达及血清CORT含量显著下降(P<0.05)。结论 左归丸、右归丸通过调节杏仁核CRH多肽表达进而调节衰老大鼠HPA轴功能。 【关键词】 促肾上腺皮质激素释放激素; 肾虚; 左归丸; 右归丸 下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴是重要的神经内分泌调节系统之一，与衰老密切相关。下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)对HPA轴发挥主要调节作用。近年研究表明，杏仁核也存在高表达的CRH，杏仁核可以通过CRH能神经元直接作用于下丘脑，促进HPA轴活性,1,，提示杏仁核参与HPA轴调节，协同维持HPA轴的神经内分泌稳态调控水平。本实验以自然衰老大鼠为肾虚衰老模型，探索杏仁核CRH表达与HPA轴功能调节的相关性及左归丸、右归丸的作用。 1 材料与仪器 1.1 动物雄性Sprauge-Dawley(SD) 大鼠，清洁级，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号:2003-0002。 1.2 试剂兔抗鼠CRH多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司);大鼠皮质酮放免检测试剂盒(Diagnostic Systems Laboratories,Inc);中药(饮片)。 1.3 仪器垂直电泳及电转移装置(Bio-Rad Company);γ-射线计数仪(Beckman Company)。 2 方法 2.1 动物分组、造模与给药 105只SD雄性大鼠，随机分为3组:老年对照组、左归丸组、右归丸组，每组35只。另设青年对照组35只，共4组。温度18,22?，光暗周期12 h?12 h，群养，5只/笼，常规喂养饲料，自由饮水。以自然衰老SD雄性大鼠(24月龄)为模型，老年对照组大鼠常规喂养至24月龄。左、右归丸组大鼠从20月龄始，均按左、右归丸生药7.5 g?kg-1(相当成人临床用量的15倍)自由饮用稀释药液，每周停药两天，连续4个月。 2.2 药材及制剂左、右归丸组方及用量均参照《方剂学》第1版教材，原方用量(单位:g)左归丸:熟地24，山药12，枸杞子12，山茱萸12，川牛膝9，菟丝子12，鹿角胶12，龟甲12， 右归丸:熟地24，山药12 ，山茱萸9，枸杞子 9，菟丝子12 ，鹿角胶 12，炒杜仲12，当 归9，肉 桂6，炮附子6。中药(饮片)一次性购于上海华宇药业有限公司，两方均按原方用量比例水煎，浓缩成膏，-30?保存。 2.3 取材 大鼠腹腔麻醉(25%乌拉坦，0.75 mg/kg)，用消毒手术器械取大鼠杏仁核，置于高压蒸气灭菌的Eppendorf管中，-70?保存。 2.4 Western Blot法检测大鼠杏仁核CRH多肽表达 蛋白样品制备:称取样品100 mg放入消毒处理试管?加入RIPA 900 μl，冰浴匀浆?匀浆后立即加入100 μl PMSF(100 μg/ml)液?转移到1.5 ml离心管中并加40 μl(10μg/μl) Complete液?4?，10 000 r)min-1，离心10 min?取上清液，-70?冻存?24 h后，4?，10 000 r/min，离心10 min?取上清，分装，-70?保存待测; 蛋白样品浓度检测:参考马斯亮蓝试剂盒(南京建成)说明，595 nm波长测各样品吸光值，参照公式“蛋白浓度=测定管吸光值/标准管吸光值×标准管浓度”检测各样品蛋白浓度;蛋白样品电泳分离:取含蛋白40 μg的样品(样品加1/5总体积的LB，最后用RIPA补齐至总体积至25 μl，混匀后95?煮5 min)上样，在聚丙烯酰胺凝胶上(12%的分离胶，约3/5总体积，4%的堆积胶，约2/5总体积)电泳分离蛋白样品(100 V，4?，2 h);蛋白样品电转移及预染:按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-三层滤纸-海绵-红色板)。并完全排除气泡，4?，100 V转膜2 h;将硝酸纤维素膜放入丽春红染液中染色约2,5 min，去离子水漂洗至现出条带，用铅笔标出蛋白Marker位置，再用去离子水振荡以去除染色;抗原抗体反应及显色:将膜转移至一培养皿中，37?，用5%脱脂奶粉封闭1 h(或4?过夜)?将膜转移至塑料夹膜中，并加入1:200稀释的兔抗大鼠CRH一抗?37?摇床孵育约2 h?0.1 moL/L的PBST洗涤4次，每次5 min?将膜转移至塑料夹膜中，并加入1:400稀释的山羊抗兔辣根过氧化酶标记的二抗，37?摇床孵育约30 min?0.1 mol/L的PBST洗涤4次，每次5 min?将膜转移至塑料夹膜中，并加入DAB显色剂(显色时间视染色程度定)?去离子水洗膜;扫描及分析。 2.5 放免法检测血清皮质酮 按试剂盒说明操作，γ-射线计数仪检测cpm(管/min)。 2.6 数据、图像处理及结果分析 Western Blot图片采用可见分析装置进行图像处理、拍照，Smartview分析软件对条带进行密度扫描，得出条带密度值。结果以扫描密度值表示;放免结果由分析软件将所测放射性比活度根据浓度曲线转化为浓度。所得数据均采用?s表示，SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。 3 结果 3.1 各组大鼠杏仁核CRH多肽表达 由表1可知，与青年对照组比较，老年对照组大鼠杏仁核CRH多肽表达显著增高;与老年对照组相比，左归丸组及右归丸组大鼠杏仁核CRH多肽表达显著下降。表1 大鼠杏仁核CRH多肽表达(略) 3.2 左归丸和右归丸对老年大鼠血清皮质酮(CORT)含量的影响 由表2可知，与青年对照组比较,老年对照组大鼠血清CORT含量显著增高(P<0.05);与老年对照组比较，左归丸组和右归丸组大鼠血清CORT含量显著下降(P<0.05)。 表2 大鼠血清CORT含量(略) 4 讨论 下丘脑CRH是启动HPA轴调控的重要因素。但下丘脑以外CRH的调节作用却知之甚少。1996年，Gray提出杏仁核含有高浓度的CRH结合蛋白、CRH受体和皮质类固醇受体，提示杏仁核与CRH关系密切。最近研究报道，杏仁核含CRH并参与对HPA轴的调节，衰老可引起杏仁核及下丘脑CRH的增高,2,。实验发现，CORT可刺激杏仁中央核表达CRH mRNA,3,，CRH可增强杏仁中央核GABA能突触传递，这种效应是由CRH1受体介导的,4,。因此，推测杏仁核不是通过GABA能神经元抑制PVN，而是通过分泌CRH直接作用于下丘脑，兴奋性调控HPA轴功能。 由于杏仁核不仅含有皮质类固醇受体，也含有丰富的CRH神经元。因此杏仁核可以接受HPA轴的糖皮质激素信息反馈，促进CRH的合成和分泌，参与HPA轴环路调节。本实验发现，与青年大鼠比较，老年大鼠杏仁核CRH多肽表达和血清CORT含量显著增高，推测杏仁核可以通过皮质类固醇受体接受HPA轴终末激素GC的反馈信息，上调CRH多肽表达，发挥对HPA轴的兴奋性调控作用，可能是杏仁核对HPA轴行使兴奋性调控的重要机制，左归丸、右归丸可下调杏仁核CRH多肽表达，进而调节老年肾虚大鼠HPA轴功能紊乱。 【参考文献】 ,1,Han JS, Bizon JL, Chun HJ，et al. Decreased glucocorticoid receptor mRNA and dysfunction of HPA axis in rats after removal of the cholinergic innervation to hippocampus,J,. Eur Neurosci， 2002,16(7):1399. ,2,Herman JP, Tasker JG, Ziegler DR，et al.Local circuit regulation of paraventricular nucleus stress integration: glutamate- GABA connections,J,. Pharmacol Biochem Behav，2002,71(3):457. ,3,祖衡兵(细胞因子与A1zheimer病,J,. 国外医学?神经病学神经 外科学分册，1998,25(3):154. ,4,Turnbull AV, Prehar S, Kennedy AR，et al.Interleukin-6 is an pituitary-adrenal axis during afferent signal to the hypothalamo- local inflammation in mice,J,. Endocrinology，2003, 144(5):1894.