血清丙氨酸氨基转移酶 任超

血清丙氨酸氨基转移酶 任超 成都医学院《生物化学与分子生物学实验》 课程实验 任超 1425100256 林单 1425100255 李乾坤1425100254 实验名称(name of the experiment) 血清丙氨酸氨基转移酶(谷,丙转氨酶)活性测定 实验目的(goal of the experiment): 1.掌握血清丙氨酸转氨酶活性测定的基本原理 2.熟悉血清丙氨酸转氨酶活性测定的具体操作 3.了解血清丙氨酸转氨酶活性测定的临床意义 。 材料(Materials) 1.试剂:(1) 0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液 (2) 标准丙酮酸(含丙酮酸2.0μmol/ml) (3) ALT底物液(含酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙酮酸200μmol/ml) (4) 2.4-二硝基苯肼溶液 (5) 0.4mol/mlNAOH溶液 2.器材:恒温水浴、离心机、721型分光光度计。15cmX15cm试管、刻度吸量管。 方法(Methods) 1. 取空腹静脉血2ml，经离心分离得到血清，保存于冰箱中待用，因为血细胞中转氨 酶活性较血清中高，故应防止溶血。若血清中此酶活性过高，则可以适当稀释后使 用。 2. 取干净试管12支，按照要求编号，要求标准管和测试管平行操作。先做好对照管 和测定管，在30min保温期间在做空白管和标准管。 试剂(μl) 0 1 2 3 4 蒸馏水 100 100 100 100 100 标准液:丙酮酸钠 0 50 100 150 200 R1基质液: 500 450 400 350 300 丙氨酸及酮戊二酸 相当于酶活力KarU 0 28 57 97 150 R2显色剂 500 500 500 500 500 混匀，37?恒温 20分钟 R3NaOH 5000 5000 5000 5000 5000 3. 按照下要求进行试验 试剂(μl) 空白(B) 测定(U) 样本 — 100 蒸馏水 100 — R1基质液 500 500 混匀，37?恒温 30分钟 R2显色剂 500 500 混匀，37?恒温 20分钟 R3 NaOH 5000 5000 4. 混匀，室温恒定3分钟， 505nm波长，0号管调零，测定各管吸光度，制作工作曲线。 结果(Results) 计算:y=0.0027x-0.0115 (x:酶活性;y:A值;) 测得数据A值为0.032 算得酶活性为16卡氏单位(参考值为5-25卡氏单位) 讨论(Discuss) 1 实验前要清洗试管，清洗试管干净标准为试管内残余水既不聚成水滴，也不成股留下，以免试管内残留物混在溶液中，影响实验结果; 2 实验时，移液管操作必须准确到位，读数时要注意准确读数，避免影响实验结果; 3实验时注意把握时间，各个液体加入后立即摇匀，防止实验误差; 4 使用比色皿时注意，糙面和滑面的区别，防止手持滑面或弄脏滑面引起吸光度测量误差 5、ALT的临床意义? AST的测定对于肝病的诊断具有十分重要的意义，特别是AST/ALT比值大小对于临床判定肝病严重程度具有十分重要的意义，是临床诊治肝病的重要指标之一 6、血清谷丙转氨酶测定的注意事项,以及为何要避免溶血, (1) 常温下标本不宜久存，(2)严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血 清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照组(3)当标本的 酶活性超过150K时，应将血清中用0.145mol/L氯化钠稀释重做，其结果乘以 稀释倍数(4)酮戊二酸，2,4-二硝基甲苯肼是直接显色物，NAOH的浓度与显色 深浅有关，因此它们的浓度必须很准确(5)丙酮酸标准浓度要求十分精确(6) 加入2,4-二硝基苯肼溶液之后应充分混匀 当溶血之后，红细胞中的ALT会进入血液中，导致测得的实验数据较大，不符 合实际情况 7对照管的意义是什么? 减少非试验因素对实验结果的影响 8底物液为何要37?预温5min? 人体的体温为37?，只有在此温度下酶的活性才会达到最大，因此必须先让酶的 活性达到最大才与底物反应 9为什么在制作标准曲线时要加入基质液, 使反应的溶液体积相同，减少因体积不同而造成的实验非决定性因素的影响 结论(Conclusion) 经实验学习，知临床上常检查的血清转氨酶有两种:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST),ALT主要分布在肝脏,AST主要分布在心肌,因而这两种酶都属于细胞内功能酶,正常人血清中含量很低,但当肝细胞或心肌细胞受损时,由于细胞膜通透性增加,胞浆内的ALT与AST释放入血浆,致使血清ALT也AST活性升高,在临床上具有重要的诊断意义。而小组测得数据为16卡门氏，处于正常范围。 教师评语(Remark) 本次实验报告写人 任超 1425100256