溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性的影响研究论文

溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性的影响研究 题 目 溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质 稳定性的影响研究 学 院 食品科学与工程 专 业 食品科学与工程 毕业届别 2013 姓 名 贾志春 指导教师 李敏 职 称 讲师 甘肃农业大学教务处制 二〇一三 年 五 月 目 录 摘要.............................................................................................................................................. 1 关键词.......................................................................................................................................... 1 Abstract....................................................................................................................................... 1 ey words ................................................................................................................................... 1 K 前言.............................................................................................................................................. 1 1 材料与方法 .............................................................................................................................. 2 1.1 材料 ....................................................................................................................................... 2 1.2试剂及药品............................................................................................................................ 2 1.3仪器设备................................................................................................................................ 2 1.4试验方法................................................................................................................................ 2 1.4.1不同溶菌酶浓度冰白葡萄酒样的制备............................................................................. 2 1.4.2浊度测定............................................................................................................................. 2 1.4.3色度、色调、澄清度的测定............................................................................................. 2 2 溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性影响研究试验结果与分析 .......................................... 3 2.1 冰白葡萄酒澄清度度单因素试验结果 ............................................................................... 3 2.2 冰白葡萄酒蛋白质稳定性度单因素试验结果 ................................................................... 4 2.2.1 不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒浊度的影响 ............................................................ 4 2.2.2 不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒澄清度的影响 ........................................................ 5 2.2.3不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒色调的影响............................................................. 5 2.2.4不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒色度的影响............................................................. 6 3讨论........................................................................................................................................... 6 4结论........................................................................................................................................... 7 参考文献...................................................................................................................................... 8 致谢.............................................................................................................................................. 9 2 贾志春:溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性的影响研究 溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性的影响研究 贾志春 (甘肃农业大学食品科学与工程学院食品科学与工程专业～甘肃兰州～730070) 摘要:溶菌酶作为天然的防腐抑菌剂～被证明可以添加到葡萄酒中以抑制酿造过程中细菌的增殖～ 但高剂量的溶菌酶会影响葡萄酒蛋白质稳定性。本文以甘肃祁连酒业提供的贵人香冰白葡萄酒原酒 为原料～初步了解冰白葡萄酒的酿造工艺。设计了分别添加0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L 的溶菌酶在一定时间段内对冰白葡萄酒的澄清度和蛋白质稳定性有关的指标,色度～色调～浊度, 单因素四水平实验,跟踪监测了420nm、520nm、620nm波长下的吸光度值,利用浊度仪测定了各溶 菌酶剂量下的葡萄酒浊度,通过吸光光度值计算色度～色调～根据吸光度值越小透光率越大的原理～ 并结合查阅的相关文献资料得知:高浓度的溶菌酶剂量,?250mg/L,会对冰白葡萄酒的色度～色 调和蛋白质稳定性会产生一定影响。 关键词:溶菌酶,色调,浊度,浊度,澄清度 Lysozyme on Ice White Wine Protein Stability Impact Study Jia zhi-chun (Major in Food Science and Engineering in the College of Food Science and Engineering of Gansu Agricultural University, Lanzhou Gansu 730070) Abstract: Lysozyme was proved to be added to the wine brewing process to inhibit the proliferation of bacteria as a natural preservative antimicrobial agent, but high doses of lysozyme may affect protein stability in the wine. This experiment use Gansu Qilian Italian Riesling ice wine as raw material. The ice wine brewing processing was acquired through a preliminary understanding. Designing add 0mg / L, 100mg / L, 200mg / L, 300mg / L of lysozyme in a certain period of time to the ice wine and to detect indicators (Chroma, color intensity, turbidity) related to clarity and protein stability and univariate four levels of experiment was expressed.Through tracking and monitoring absorbance of 420nm, 520nm, 620nm wavelength.Turbidity under the doses of each lysozyme was measured by using wine turbidity instrument; Chroma, hue was worked out through absorptiometry value, according to the principle of the less absorbance value, the greater transmittance, combined with access to relevant literature that: a high concentration of lysozyme doses (? 250mg / L) will have an impact on ice wine chroma, hue and protein stability. Key words:Lysozyme; Color; Color Intensity;Turbidity;Clarity 1 贾志春:溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性影响研究 前言 [1]冰酒是将葡萄推迟采收,当气温低于-7?使葡萄在树枝上保持一定时间，结冰，采收，在结冰状态下压榨，发酵，酿造而成的葡萄酒(在生产过程中不允许外加糖源)，按颜色可分为白冰和红冰两种，白冰葡萄酒又称冰酒。 目前在甘肃、吉林、辽宁、山东等省份都有企业生产冰白葡萄酒。但是冰白葡萄酒中蛋白质的稳定性是其质量最为关键的一个方面，特别是装瓶后的葡萄酒应该具有很好的澄 [6]清度和保持其固有的色泽。虽然说少量的沉淀并不影响冰葡萄酒的内在质量，但是改变了冰葡萄酒的外观质量，使消费者难以接受，或产生误解，防止成品冰葡萄酒发生这种沉淀是酿酒工艺必须要解决的问题，因为从某种意义上说这是产品质量控制不好的表现。目前对冰葡萄酒稳定性的分析和相关研究还极其有限，也很少有这方面的报道。 采用SO控制乳酸菌的生长是从古至今一直沿用的传统方法。但近年来的研究表明, SO22并不是一个理想的控制生长的工具。因为SO被广泛应用于其他食品中，过高的积累摄人量2 会对人体产生一定的毒性，一部分人对SO过敏，SO具有非专一性抗菌活性，SO对酒的感222官质量产生有害的影响，与SO相反，上述的弊端使目前的葡萄酒酿造工艺研究集中于寻找2 SO的替代物。 2 溶菌酶为白色晶体，味甜，易溶于水和盐溶液，最适温度为45~50?，最适 pH为6.7，等电点为10.7~11.0。溶菌酶活性在酸性条件下对热稳定，在pH3时，能耐受100?高温达 [5]45min而保持活性不变。溶菌酶在葡萄酒生产中应用的研究始于世纪年代后期, 最初只是因其对革兰氏阳性菌的溶解作用, 而关注于它对乳酸菌生长的调控。但随着研究与使用的进一步深人, 人们发现溶菌酶的作用不仅于此, 它在葡萄酒生产中还有许多重要的新用途而对溶菌酶的有关试验表明它可成为优良的SO替代物或补充剂。 2 甘肃省的河西走廊是我国葡萄栽培最早的地区之一，地处东经93,104?,北纬38,40?,正处于中国北方葡萄带中,气候干燥，光热资源极其丰富，昼夜温差大，灌溉便利，有利于浆果糖分积累和着色，是优质葡萄产区之一。甘肃省葡萄酒原料生产基地都在这一最佳地带，经过10多年的发展，甘肃省的葡萄酒产业已初具规模。形成了以莫高、祁连、紫轩等一批在省内外具有一定影响力的葡萄酒品牌。因此，对甘肃河西走廊酿酒葡萄产区酒中蛋白质稳定性进行研究分析，可以为减少酿酒葡萄产区冰葡萄酒的蛋白质稳定性对其外在感观影响。本研究主要以我国自行研发的贵人香冰葡萄酒为研究对象，通过对其稳定性(主要为蛋白稳定性、酒石稳定性和微生物稳定性)的研究，旨在进一步提高冰葡萄酒 [4]的质量，满足日益增长的社会需求。 1 1 材料与方法 1.1 材料 祁连贵人香冰白葡萄酒原酒:2012年12月由甘肃祁连酒业有限责任公司提供。选自2012年12月-7,-8?的夜间冷冻结冰的雷司令葡萄(Italian Riesling)原料，采摘下来的结冰葡萄立即予以压榨酿造的未经过滤的冰白葡萄酒原酒。 1.2试剂及药品 蒸馏水(摩尔超纯水制备仪); 溶菌酶 (东京化成工业株式会社) ; 95%乙醇 (天津科密欧化工试剂厂) ; 饱和硫酸铵(天津市北辰方正试剂厂) ; 单宁(天津市凯信化学工业有限公司)。 1.3仪器设备 HH-S数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司); GZX-GF101-?电热鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司); 电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司); CDS-3B光电式浊度仪(无锡科达仪器厂); 卧式冷藏冷冻转换柜(青岛海尔特种电冰柜有限公司); 723型可见分光光度计(上海光谱仪器有限责任公司); 摩尔超纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司)。 1.4试验方法 1.4.1不同溶菌酶浓度冰白葡萄酒样的制备 [3]参照杨新元的方法，略有改动。取相同量的四份酒样100mL，参考国标制备(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L)溶菌酶的祁连贵人香冰白葡萄酒，编号贴标，制备实验要求的材料。 1.4.2浊度测定 取四份添加不同浓度(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L)溶菌酶的祁连贵人香冰白葡萄酒10mL，首先进行空白试验测定初始浊度值，然后将样品80.0?恒温水浴6h，4.0?恒温冷却12h后，用浊度计测定加热前与冷却后的浊度差(以EBC计)，分别在第7天、14天、21天、28天取样测定样品在放置过程中浊度的变化，同一方法，做三次重复试验。 1.4.3色度、色调、澄清度的测定 [5]参照冒秋丹的方法，略有改动。用1cm比色皿在420nm，520nm，620nm处分别测得 2 贾志春:溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性影响研究 其吸光值。将3波长下吸光度之和即为冰白葡萄酒的色度值，420nm和520nm吸光度之比即为色调值，澄清度则用420nm下的吸光度值表示。 澄清度:OD 420 色 度:OD+OD+OD 420520620 色 调:OD /OD 420520 取四份添加不同浓度(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L)溶菌酶的祁连贵人香冰白葡萄酒10mL，首先进行空白试验用723型可见分光光度计测定初始吸光度值，然后将样品80.0?恒温水浴6h，4.0?恒温冷却12h后，用723型可见分光光度计，分别在第7天、14天、21天、28天取样测定样品在放置过程中色度、色调、澄清度值的变化，同一方法，做三次重复试验。 2 溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性影响研究试验结果与分析 2.1 冰白葡萄酒澄清度度单因素试验结果 表1 蛋白质稳定性试验设计单因素表 Tab1. Protein stability test design facter 浓度(mg/L)时间(d)色调色度澄清度浊度(EBC) 70.9732.2070.5540 31.4 140.9692.2200.553 30.4 210.9652.2130.551 30.1 280.9342.4420.547 29.2 10070.6532.9930.455 38.0 140.6413.0470.451 37.4 210.6323.0900.448 36.6 280.6293.1040.447 36.2 20070.5833.8260.440 51.2 140.5743.9020.437 50.6 210.5713.9550.435 49.6 280.5663.9820.434 49.2 30070.7972.7140.521 33.6 140.7882.7410.518 32.7 3 210.7822.7850.515 31.2 280.7752.7990.513 29.9 2.2 冰白葡萄酒蛋白质稳定性度单因素试验结果 2.2.1 不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒浊度的影响 55 50 45 0mg/L40100mg/L35200mg/L 30浊度(EBC)300mg/L 25 20 07142128 时间(d) 图1 溶菌酶浓度对冰白葡萄酒浊影响 Fig. 1 Lysozyme concentration effect on ice white wine turbidity line 由图1可知，冰白葡萄酒样的浊度随着时间的变化，整体呈下降趋势但变化幅度较小。随着溶菌酶浓度在(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)依次增大，冰酒的浊度也逐渐增大，但当溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，浊度值变化出现无规律性，浊度值介于0 mg/L与100 mg/L之间。这与(Proctor,V.A. and Cunningham,F.E.1988. The chemistry of lysozyme and its use as a food preservative and a pharmaceutical.CRC Crit. Rev.Food Sci. Nutrition.)结论一致。因为高剂量溶菌酶会促进冰白葡萄酒样中的多酚、蛋白质交联产生化学反应形成一定量的 [12]沉淀，影响蛋白质稳定性。 4 贾志春:溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性影响研究 2.2.2 不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒澄清度的影响 0.6 0mg/L 100mg/L0.5 200mg/L澄清度 300mg/L 0.4 07142128 时间(d) 图2 溶菌酶浓度对冰白葡萄酒澄清度影响 Fig. 2 Concentration of lysozyme on ice white wine clarification degree affect the line 由图2可知，冰白葡萄酒样的澄清度随着时间的变化，整体呈下降趋势但变化幅度较小。随着溶菌酶添加剂量在(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)梯度下依次增大时澄清度逐渐减小，这是由于冰酒中的浊度随溶菌酶含量(0mg/L~200mg/L)的增加而增大，澄清度下降。但当溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，澄清度介于0 mg/L与100 mg/L之间，这与(Proctor,V.A. and Cunningham,F.E.1988. The chemistry of lysozyme and its use as a food preservative and a pharmaceutical.CRC Crit. Rev.Food Sci. Nutrition.)结论一致。可能是因为低浓度的溶菌酶有利于酒中的革兰氏阳性菌的溶解,有利于酒液澄清,但高浓度的溶菌酶会 [12]使酒液的溶解能力下降,导致酒液的浑浊。 2.2.3不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒色调的影响 1.1 1 0.90mg/L 0.8100mg/L 0.7200mg/L 0.6300mg/L 0.5OD420+OD520+OD6200.4 07142128 时间(d) 图3 溶菌酶浓度对冰白葡萄酒色调影响 Fig. 3 Lysozyme concentration effect on ice white tonal line 由图3可知，冰白葡萄酒样的色调随着时间的变化，各实验组的变化幅度较小。随着溶菌酶添加剂量在(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)梯度下依次增大时色调逐渐减小，但溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，色调值变化出现无规律性，且色调值介于0 mg/L与100 mg/L之 5 间。色调的变化趋势和澄清度的变化基本相同，说明高剂量的溶菌酶浓度会使冰白葡萄酒的色调值不稳定，这与冒秋丹(酵母对蛇龙珠红酒酒精发酵过程中游离态和键合态香气物 [5]质的影响)结论相一致。 2.2.4不同溶菌酶浓度梯度对冰白葡萄酒色度的影响 4.5 4 3.5 30mg/L 2.5100mg/L 200mg/L2 300mg/L1.5OD420/OD520 1 07142128 时间(d) 图4 溶菌酶浓度对冰白葡萄酒色度影响 Fig.4 Lysozyme concentration effect on ice white wine chromaticity line 由图4 可知，冰白葡萄酒样的色度随着时间的变化，各实验组的色度呈上升趋势但变化不大。随着溶菌酶添加剂量在(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)梯度下依次增大色度逐渐增大，色度的变化趋势和浊度的变化趋势一致。但当溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，色调值变化出现无规律性，且色度值介于0 mg/L与100 mg/L之间，说明高剂量的溶菌酶会使冰酒的色度不稳定，这与冒秋丹(酵母对蛇龙珠红酒酒精发酵过程中游离态和键合态香气物 [5]质的影响)结论相一致。 3讨论 由图1可知，冰白葡萄酒样的浊度随着时间的变化，整体呈下降趋势但变化幅度较小。随着溶菌酶浓度在一定范围内增大时色调逐渐增大，但溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，浊度值变化出现无规律性，浊度值介于0 mg/L与100 mg/L之间，说明0 mg/L、100 mg/L、 [2]200mg/L的溶菌酶作用下冰白葡萄酒的浊度值产生正相关性。但溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，澄清度介于0 mg/L与100 mg/L之间，高剂量溶菌酶并不呈现出规律性，会促进冰白葡萄酒样中的多酚、蛋白质交联产生化学反应形成一定量的沉淀，影响蛋白质稳定性。 由图2可知，冰白葡萄酒样的澄清度随着时间的变化，整体呈下降趋势但变化幅度较小。随着溶菌酶添加剂量在(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)梯度下依次增大时澄清度逐渐减小，说明0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的溶菌酶作用下冰白葡萄酒的浊度值产生负相关性，但溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，澄清度介于0 mg/L与100 mg/L之间。高剂量的溶菌酶浓度有可能会对冰白葡萄酒的澄清度产生影响。当葡萄酒的pH低于3.7时，葡萄酒中的多 [4]酚会促使和溶菌酶与蛋白质发生相互绑定，形成蛋白质絮状沉淀，造成溶菌酶活性降低。 由图3可知，冰白葡萄酒样的色调随着时间的变化，整体呈下降趋势但变化幅度较小。随着溶菌酶添加剂量在(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)梯度下依次增大时色调逐渐减小， 6 贾志春:溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性影响研究 说明0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的溶菌酶作用下冰白葡萄酒的浊度值产生负相关性。但溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，色调值变化出现无规律性，且色调值介于0 mg/L与100 mg/L之间，说明高剂量的溶菌酶浓度会可能对冰白葡萄酒的色调值产生一定影响。 由图4可知，冰白葡萄酒样的色度随着时间的变化，整体呈上升趋势但变化幅度不大。随着溶菌酶添加剂量在(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)梯度下依次增大色调逐渐增大，说明0 mg/L、100 mg/L、200mg/L的溶菌酶作用下冰白葡萄酒的浊度值产生正相关性。但溶菌酶浓度增大到300 mg/L时，色调值变化出现无规律性，且色度值介于0 mg/L与100 mg/L [7]之间，说明高剂量的溶菌酶浓度会对冰白葡萄酒的色度值产生影响。 4结论 1) 由实验及文献得出:高浓度(,300mg/L)的溶菌酶会增加冰酒的澄清度，从而影 响蛋白质稳定性。 2) 色度与色调值的变化，间接地反应出溶菌酶会对冰白葡萄酒的稳定性产生一定的 影响。 3) 由试验结果分析，在葡萄酒生产中溶菌酶作为二氧化硫的补充剂是可行的，但是 二者之间的相互作用，尤其是二者的协同作用对葡萄酒颜色的影响还需要进一步 深入研究。 7 参考文献 [1] GB/T25504—2010 冰葡萄酒. 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Nutrition. 26:359-395. 8 贾志春:溶菌酶对冰白葡萄酒蛋白质稳定性影响研究 致谢 本研究及是在导师李敏老师的悉心指导下完成的。从论文的选题、试验过程到论文的写作，都倾注了导师大量心血。在此，我谨向恩师表示诚挚的感谢和崇高的敬意。 在试验过程和论文完成过程中，曾得到学院其他老师的指导和帮助，同时也得到食品科学与工程学院研究生陈凯学长和本科毕业生吴亚红、曹弋同学的极大帮助，在此一并感谢。 值此毕业之际，向所有关心、支持和帮助过我的老师和同学致以最诚挚的谢意～向论文的评阅人和答辩委员会的所有专家表示我真挚的谢意～ 贾志春 2013年5月于甘肃农业大学 9 10