【doc】依赖雄激素的大鼠储精囊分泌蛋白的离子交换层析纯化

【doc】依赖雄激素的大鼠储精囊分泌蛋白的离子交换层析纯化 依赖雄激素的大鼠储精囊分泌蛋白的离子 交换层析纯化 第5卷第6期 1989年l2月 生物化学杂志 ChineseBiochemicalJournal voi.5.No.6 Dec.,1989 依赖雄激素的大鼠储精囊 分泌蛋白的离子交换层析纯化 王震熙张胜陈枢青林国庆 (浙江医科大学生物化学教研室,杭州) 摘要本文撮避利用阳离子交换层析,纯化7雄激素依赖的大鼠储精囊分泌蛋白 (SVP?,SVP?,SVPV.,SVPVb及SVP?).主要纯化步骤包括下刘二步:1.Sep- hadexG-100凝胶过滤f2.上样后,联合使用盐梯度和pIl梯度,洗脱快速蛋白液 相层析(FPLC)系统的阳离子交换柱MonoS.洗脱峰的纯度政变性条件下曲聚丙 烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和等电聚焦(IEF)鉴定借此,还洲定了已纯化 的大鼠储精囊夸泌蛋白的夺子量和等电点 关键词t大裹储精囊分泌蛋白纯化离子交换层析 储精囊是雄激素作用的靶器官,是研究甾体类激素作用的分子机理及与基因表达调控之 间关系的理想模式[I).大鼠储精囊分泌蛋白的含量很高,达200--300mg/ml,离子强度却 非常低(33mmo/cm,仅为血清的四分之一),其中某些组分,即便在分离凝固腺后收集仍极 易发生凝固和沉淀[8,这给分离纯化带来很大的困难.1979年Ostrowskl等…经变性的聚 丙烯酰胺凝腔电泳(SDS--PAGE)鉴定,它由五个主要成分组成,按其电泳迁移率顺序,命 名为sVPI—V迄夸,除-SVPIV外,其余几种分泌蛋白按常规方法很难被有效地分离.我 们首次用快速蛋白液相层析(FPLC)仪,经阳离子交换柱(Monos)层析,成功地纯化了 SVP?,SVPIV,SVPV.,SVPVb及以前尚未报道过的sVP?.本文报道这一简便而高效的 纯化方法,从而为储精囊分泌蛋白的生理功能及雄激素作用机理的研究提供了有效的实验材 料. 精s方法 一 , ].仪器?快速蛋白液相层析仪,阳离子交换柱(Monos,50×5tumiD)及电泳系统的 FiatBedApparatus3000 , CapilliaryCastingmould,ECPS30001150,VH-I均系Pharmaeia 产品f真空冰冻干燥机为美国Labeoneo公司的产品}751分光光度计为上海分析三厂产品. 2.试剂:SephadexG一100,pImarkerKit,Pharmalyte(3--10)均为Pharmaeia公司 88午4月19日收卿初稿,l.8B簪月2日收到螫圆裤. 9I 产品}Acryiamlde为fhka公司产品}Bis,SDS及MWmarker系Sigma公司产品}其余试 剂均为国产分析纯试剂. 3.动物:W'istar大自鼠纯种,由本校动物科提供. 二,方法 1.储精囊分泌蛋白的纯化:按王震熙等法抽取储精囊液,抽提液为HAc—NaAc缓 冲液(O.05mol/LHAc-NaAc,0.15mol/LNaC1,0.005mol/LNa2EDTA,pH4.4,8.c).抽 取储精囊液后,4000g离心10舟钟(4?)}取上清液上样于预先用0.05mol/LHAc—NaAc, 0.075mol/LNaCIpH5.4平衡的SephadexG一1O0层析桂(2.6×100cm),用同样的缓冲液洗 脱,流速12ml/h,每管收集4.5ml,紫外光吸收检溯各蛋白洗脱峰.各峰用SDS-PAGE确 定其蛋白组分洗脱峰I(见Fig.I)经O.45#滤膜过滤后,上样于FPLC系统的MonoS桂上, 用0.05mol/L磷酸缓冲液线性梯度洗脱(起始缓冲液pH3.1,极限缓冲液0.5mol/LNaCI, pHI1.O),其洗脱峰(见Fig.2)对0.005mol/LNH.Ac透析,冰冻干燥,经SDS—PAGE及等电 聚焦(IEF)鉴定其纯度,即为SVPIt}SephadexG一1OO凝胶过滤后的洗脱峰?,?,滤膜 过滤后,上样于MonoS柱,用0.05mol/LHAc—NaAc缓冲液线性梯度洗脱(起始缓冲液pH 5.4,极限缓冲液0.5mol/LNaC],pH6.O).洗脱峰a,bC(见Fig.3,Fig.4)经透析,冰冻 干燥及SDS—PAGE鉴定,得SVPIV,SVPV.,SVPVb和SVPVI四种成分. 2.大鼠SVP干粉的制备:按Ostrowski法…. 3.样品蛋白检出及各组分蛋白纯度和其分子量测定:用稍加改良的Leammli…法进行 电辣. 4.等电聚焦电泳t聚丙烯酰胺浓度采用T5c4系统,在Capilliarycastingmould中 制胶,置FlatBedApparatus3000中电泳,阳极溶液为0.04mol/L天冬氨酸,阴极溶液为 lmol/LNaOH.预聚焦500Vh(用VH—I控制),通过Sampleapplicator加样,聚焦3000Vh, 经l0三氯醋酸,5磺酰水杨酸固定,以0.2考马斯亮蓝R?染色和105醋酸,3乙醇 脱色.利用切胶洗脱和标准pImarket决定凝胶的pH梯度和待测样品的pI. 结果 一 ,储精囊分泌蛋白经SephadexG一100桂瑶析分离的洗脱曲线见Fig.1,电泳分析表明 ,SVPV,SVPVb;第?峰主要 (Fig.5):第1峰含SVPI,SVPIt,SVP?j第?峰含sVP? 为sVPu}第?峰为一些其它微量的分泌蛋白. =,将经SephadexG一100凝胶过滤分离的第1峰样品再过阳离子交换桂MonoS层析, 即获得了一个主峰见Fig.2,经SDS—PAGE电泳(Fig.)及等电聚焦(结果束到)证实,此 峰即为纯化的SVP?. 三,经SophadexG一1O0分离后的第?峰样品,再过MonoS桂屡析,得到三个峰见 Fig. 3.SDS—PAGE(Fig.6)鉴定,分别为纯化的SVPV.,SVP?和SVPvb. 四,取SephadexG一100分离的第?峰样品,过MonoS柱层析,则获得三个峰见Fig.4. SDS-PAGE证实其a峰为sVP?. 五,储精囊分泌液干粉及各样品纯度鉴定的SDS—PAGE图谱见Fig.5,Fig.6.从图中 『 492f Tube Fig.1Ratseminal,/esJealsecretiOnpro一 ~einsfr丑cti0nprofile0nSephadex0-100 ehrom~ography. colUmllI2.6×100cm-flowrRteIlzmL/h, elu~,ingsolutiont0.05mol/LNaAc—HAc 0.075moI/LNaClpH5.4 Fig.5Cati0n—exchangeset~arati0n0n Mono8HRS/S.peakNo.e0rresI~ondt0 thefollowingpro~einS{a:8VPVa,b= 8VPlg,e=8VPVb.e0nditi0nsibuffer HAcpH6.4.buffer A0.05mol/LNaAe— BD.05mol/LNaAc—HAC口H6.0pluS 0.5mol/LNaCl{gradient,D?100Bin 27mlIfl0wrate1.5ml/minIpaperspeed 0.~em/min_8ample4.Oml0fpeaklfr— actionfromSephadexG-100ehromato? gral~hys~,epIdetection2j0nml0.~tAIJF8 tooli'L) F}g.2Cati0n-exchangeset~arati0n0nMon0 8HRS/S.ehromatographiceondi~J0n8,col— llmnMono8prepackedHR5/5.bufferA 0.05mol/LPBpH8.1IbufferB0.05mol/L PBpH11.0plus0.5MNaC】lgradient0— 1O0Bin18mlIflowrate1.~ml/min'paper speed0.sere/raint8ample2.0mlofpeak1 fracti0nfrom8ephadexG一100chtomat0g? raphvStep.detecti0n280nml0.2AUF8. F;g.4Cati0n.oxehangesepara~i0n0nM0n0 8HRs/s.conditi0ng.bUfferA0.05mol/L NaAc.HAepH5.4.bUfferB0.05MNaAe— HAcpH6.5plus05mol/LNaClIgradient, 0—100Bin27mlIfl0Wrate1.5ml/minI paperspeed0.6era/rain'sample5.Dmlof peak?fracti0nfrom8ephadexG一100ch— rotor~ographysteptdetectj0n280nrnl 0.2AUFS. 493 ?u?o,0 可见,储精囊分泌蛋白的6条主要区带,并可见经琏~fonoS桂分离的上述五个组分sp直, SVPIV,SVPV., SVPVb,SVPVI,在此条件下分别呈一条区带.又利用SDS—PAGE法,测得 已纯化的储精囊分泌蛋白的分子量为lSVP?47,000(Rf=0.26),SVPIV15,000(Rf0.77), SVPV.,SVPvb13.000(Rf0.s5),svPVI11.500(Rf0.90)(见Fig,7). Fig,5Pa~ternofSVP0nslabSDS.PAGE maloratainedbandswerelabledItoV1. 1aneNo.correspondt0thefollowing日amp. Ie8l1apurified8VPIV_2;peak?frDill SephadexG-leochromatographyI3peakI fromSephadexO?100chr.?at.graPhy}4and B=SVPpowderI5ffipeak?fromSephadex U'100chromatographyI6;PurifledBVP?_ ffipeakIVfromSephadexO.100chromat graphy } 至 F,7Da~erminati0nofthemolocular weightofthepurifiedSVPby8DS—PAGE. ThemarkerproteinsusedwereovMbumin (4s_000),Pepsin(as,000),carbonicanhyz drase(20.000),chymo~rypsinogen(25.000). andcytochromeo(12-500).Thereelocular weigh~oftestedsample8*wasextraDMated from地eplotofLogMWofmarkerpro, ~einsagejn8t~heirelectr00hore{icmobil, iHe日. {{ Fig.8Measuremen~ofpHgradientpro. fileusingthehroadpIeallhra~ionkit (pI350to9.30)whichconslstgoftry— Psinogen(..30).lentillecti/1(8.65).lent|l 1ec~ln(8.45).1snailIectin(8.15),hor日e myoglobln(7.35)hersemyoglobin(6. 85), humancarbonicanhydra8eB(6. 55i,boy iilecarbenicanhydraseB".85),B—leet, oglobullnAf5.2),soybeantrypsininhi, bi~or(4.56),amyloglucosidaae(3.5).co. ndi~ion_TdC.polyacrylamidegeltoni, ~iningPharmMy~e3—D. 女,经TsC.系统的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析(电泳图谱未列示),以等电点范围3.5 , 9.3的pI标准品校正药盒作标记,从其离阴极距离与pH值的关系,确立了凝胶中的PH梯 度曲线(Fig,8),从而测得纯化的样品等电点SVP?9.7(离阴襁距离O.3era),SVPIY8.9 (1.3era),SVPVh9.5(0,7era),SVPV-6.55(5.3era). 讨论 一 ,含有5种主要蛋白成分的大鼠储精囊分泌液的电泳图谱是在碱性及低浓度尿素存在 下的SDS—PAGE中获得的,选已得到公认.我们在3mol/L尿素,0.1SDS,15丙 烯酰胺的条件下电泳,也得到了类似的结果J同时,我们还发现并分析了以往尚未报道的第 G条蛋白区带:其在碱性条件下电泳,泳动速度较其它快,我们称之为SVP?.此带虽然含 量较另外5种成分低,但也是雄激素依赖的,这可以从我们已往工作比较阉割前后大鼠储精 囊mRNA的翻译产物的电泳扫描图得到证实.因此,我们认为SVP?也可作为雄激素作 用的标志蛋白来研究甾体类激素与基因调控之间的关系,对SVP?的纯化及其研究有待进一 步深入.术实验使用NaAe—HAc缓冲液取代Tris缓冲液抽取储精囊分泌液,SVPI和 SVP?极大部分被沉淀,SVP?沉淀则明显比用Tris缓冲液抽取少,SVP?,SVPV,SVPVI 则几乎不受影响.在此条件下,对分离SVP1I较佳.目前仍尚无一个方法能使这几种分泌蛋 白同时抽取而不发生沉淀. =,除SVP?外,用常规纯化方法很难分离其它几种分泌蛋白.最近Stephen等利 用SVP液在SDS—PAGE电泳后的电洗脱(Electr0eluti0n)法,分离了所有5种主要成分, 但由于在变性条件下分离,影响了对其生理功能的研究.我们采用凝胶过滤层析结合阳离子 ,成功地纯化了SVP?,SVP?,SVPV.,SVPVb和SVP?.MonoS 交换桂(Monos)层析 是一种强阳离子交换剂,本身无缓冲能力,因此,联合使用盐梯度和pH梯度获得了 较隹的 分离效果.收集经Mono$柱脱洗的每一峰,经SDS-PAGE分析证实,得到的每一峰均为单 一 区带.意外的是,我们在MonoS柱分离时发现,SVPV是由SVPV.,SVPVb=个成分 组成:当将SephadexG一100分离后的第?峰样品过MonoS柱后,便能得三个洗脱峰(Fig.3), 其中a峰和c峰的样品经17era长的乎板SDS-PAGE,两者与SVPV区带相一致(Fig.6),合 并a,c峰样品电泳仍表现为一条区带j经等电聚焦分析发现,a峰样品(称之为V.)的pI 为6.55,而c峰样品(Vb)则是9.5}作者又将SVPV.,SVPVb抗原及其相应抗血清互相 进行免疫交叉分析",发现两者无免疫交叉反应.这些均表明尽管SVPV.,SVPVb分子 量相等或极相近(约13.000),但仍是二个独立成分,这一结果与Stephen[10利用加长(32cm) 的SDS—PAGE电泳发现SVPV由=个组分(F.,F2)组成完全一致. 三,储精囊分泌蛋白以碱性蛋白为主,约占蛋白总量的8O,90【".奉实验以纯化的 分泌蛋白经等电聚焦测定,揭示占整个SVP主要成分的SVP1I,SVPIY,SVPVh的P1分别 为9.7,8.9,9.5,也证明了SVP的碱性特征.迄今,除了利用SVP受雄激素调控这一特 性在甾体类激素作用机理的研究中充当标记蛋白外,对SVP的其它生理功能尚不明确.有实 验表明f,5,13]储精囊分泌液与精子受精有关,其中SVP在受精过程中可能有着特殊的作用: ?SVP的某(些)组分作为精子外套抗原(SpermCoatingAntigen)的来源'l'】,直接影响 精子本身的生理生化活性j?,在啮齿类动物,SVP是排精后阴道栓形成的主要底 物】, 495 逸种柱子既可防止一部分精子倒流,又可通过阴道粘膜缓慢地释放栓内物质,有和于受精} ?,分泌蛋白中的碱性蛋白可能与雌性生殖道内一些酸性的血清蛋白形成复合物,从而改变 雌性生殖道内的微环境,利于精子的活动【. 无疑,储精囊分泌蛋白的纯化,将是进一步揭示其生理功能,阐明其对生殖过程的影响 的开端由于SVPI和SVP]]I在原位抽提时,即几乎完垒被沉淀,因此,目前尚无法纯化 之.对此还有待于进一步瀑人研究和摸索. [1] [2] [31 [|] [6] [6] [7] [8] [9] El0] E1i] r'12~ [183 ["] 参考文献 Wil]iams-Ashaman,H.0.1.fre"D0sf4CellularD,(1983),22,202. Venezia]e,C.M.}Adv.疗F.日0rm.Rss.,{1977),;,1. Oeiger,B..eLa1.I[mmuno[og~:,(1974),27,729, Ostrowski,M.,eL81.t,.丑.^日m.,(1979)t254,383. 王震怖lg浙江医科大学,(1985).1,t1. Laemmli,L.K.INature,(1970),227,680. FharmaciaI~IsoelecLricFocusing.principles&methodspharmaeiauppsala>> _(1982), 46. Higgins-S.J.,eta1.?D.日gs,tof日ot.,(i981),21_255. 壬震扁等I《生精化学杂志》.I986),2(6):11. SLephen,E.eLa1.IMo1.Celt.E~doerlna1.,(1986),45,205. 张挫-王量庸t《生殖与蘧孕》,1989)_待发表. Lavon,U.eL81.tJ.r口er.Q97t),27,227. ClaverL,0.eLa1.IPPog.Rep~'od.口i.z.e.,(1985)t12.80. Dravland,E.eL81.1丑..D,Reprod.,(1981).25,649. Androgen-regulatedProteinsofRatSeminalVesicalSecretion IsolationbyHigh--performanceIon—-exchangeChromatography Wang,Zhen-xiZhang_ShengChen,Su—qingLin_Ouo—qing (Del,t..,B$ochem~siry,ZhejMedicaluaivers~Ly,Hangzkou) AbstractThemaj0randr.gn—reguIatedsecretoryproteinsofratseminalvesicles (svP?.SVP?.SVPV..SVPb.SVP?)havebeenpurifiedbyhigh—Perf0rmance cation—exchangechromatography.Thepurificationprocedureinvolvedtwosteps:1. gelchr.mat.gPhyOnSephadexG-]00and2. cationexchangeOnMonoScolumn inFPLCsystembyusingcombinedsaltandpHgradients.Thepurityofselected peakswasevaluatedbysodiumdodecy]sulphatepolyacrylamidegelelectrophoresis andisoe]ectricfocusing.ThemolecularweightandpIofpurifiedSVPweredete— rminedbyusingSDS—PAGEandIEF. Keywo~ds:RatSeminalVesicleSecretionproteinIsolationIon-excha- ngechromatography 496