轮藻培养条件的优化

轮藻培养条件的优化 届    别    2008届 系    别    生物系 专    业    生物科学 姓    名    指导教师    二○一二 年 五 月 轮藻培养条件的优化 学生          指导教师  张猛 摘  要  轮藻是一种广泛分布并具有一定经济价值的水生植物，但其人工培养鲜见报道。本实验在M-11培养基的基础上，调整N/P为16:1、40:1和80:1，Fe2+离子浓度为0.3mol/L、0.6mol/L和0.8mol/L等不同梯度来培养轮藻，通过称重法来研究适合轮藻人工培养的培养条件。结果显示：轮藻培养的最适N/P为40:1，最适Fe2+离子浓度为0.3mol/L。进而得出一种轮藻培养的适宜的培养基为NaNO3 250mg/L，KH2PO4 10mg/L，MgCl2·7H2O 29mg/L，CaCl2·5H2O 40mg/L，Na2CO3 20mg/L，EDTA-NaFe 2.25mg/L，Na2EDTA·2H2O 1mg/L。 关键词  轮藻； 氮磷比； Fe2+浓度； 培养 前言  轮藻，别名水茴香，是一种大型沉水藻类植物[1]。轮藻门仅一纲一目，轮藻纲（Charophyceae），轮藻目（Charales）。常见者为轮藻属和丽藻属。植物体具有类似根、茎、叶的分化。茎有节和节间之分，在节上轮生有相当于叶的小枝，有些种类体外被有钙质或胶质。细胞内具有小形盘状或椭圆形色素体；光合色素为叶绿素a和b，以及β胡萝卜素、叶黄素和其他类胡萝卜素；无蛋白核；同化产物为淀粉，单核。在成熟的细胞中具有大的中央空泡。 轮藻广泛分布于世界各地，但主要产于北温带，共约180种。中国已知有27种，其中9种为特有种。多生于钙质丰富、有机质较少、呈微碱性的淡水或半咸水中，特别是在透明度大，少浮叶植物生长的浅水湖、池塘、沼泽中，常大量生长。 国外关于轮藻的研究，过去多集中在其形态、生理、细胞学以及多样性等方面，而对轮藻应用方面的研究很少，仅Zeneveld，Groves和Pal等人在他们的论著中提到过[2～4]，而近几年来的研究还涉及到了环保、农业、医药业等方面的应用。 Caballero于1919年首次报道了在有轮藻生长的水域中没有蚊幼出现的现象[2]，而且这一现象也得到了大部分藻类学者的认同。同时，Russell和Balsas的研究显示蚊幼的生境与轮藻的生境几乎是惊人的相似。这就意味着轮藻对蚊幼可能存在驱避和杀灭作用。而Cabllero、Stroede和Buhot等认为轮藻可以产生某种对蚊幼有毒的物质，这种物质可以被轮藻释放到其生活的水域中，从而使其生活的水域中没有蚊幼的存在[2]。但Blow和Pal等却认为轮藻并不会产生有毒物质，之所以其生活的水域中没有蚊幼是由于一些其它的因素，Pal更给出了明确的原因，他认为是轮藻周围生活着一种以蚊幼为食的龙蝇的幼虫，出于对这种掠食者的驱避，所以雌蚊不在有轮藻生活的水域产卵[ 4 ] 。然而根据Gonzalves和Vaidya在1963年的实验显示，和轮藻共同培养的蚊幼会死亡，但死亡的蚊幼尸体完整，并非被其它掠食动物所杀死[5]。明轮藻中含有可对蚊幼产生较强的致死作用的物质。 Thienemann记述了在巴厘岛Kedisan的Batoer湖边，周围的居民将湖中大量的轮藻堆积在岸边，待其腐烂后便作为肥料施到地里。在欧洲很多地方也将轮藻作为肥料，Prosper和Wasmund对此都进行过报道。此外，Prosper还提到轮藻的特殊气味可以驱散一些根际害虫和啮齿动物，防治其对作物根际的破坏[3]。也就是说轮藻不仅可以作为肥料而且还有一定的农药功效，非常符合现今绿色农业发展的要求。 根据Prosper的记载，西班牙的穷人用在河岸边堆积的“硝石”进行泥浴来祛除疾病，而这些所谓的“硝石”就是从周围池塘中捞起晒干后呈白色的轮藻。无独有偶，Wasmund也记载了在德国的药店中出售轮藻，人们买来用于预防一些疾病。 中国也是轮藻的主要产地之一，但我国的相关研究起步晚, 虽在20世纪的80年代一些单位在轮藻生理、细胞学、多样性以及现生与化石轮藻研究的相关性等方面进行了较为全面的调查研究，如四川大学的兰利琼等人研究了轮藻科(Characeae)三个属的无丝分裂，她们选取了轮藻科3个属的轮藻植物：丽藻属的乳突丽藻(Nitella papillata)、拟丽藻属的钝节拟丽藻(Nitellopsis obtusa)和轮藻属的弧枝轮藻 (Chara connivens)进行细胞核无丝分裂的观察。实验结果显示，三种藻不同生长时期、不同生长部位的藻体细胞其分裂方式均为无丝分裂，未发现有丝分裂。在细胞核无丝分裂过程中，染色质不发生浓缩，核膜不解体，核的分裂部位不固定，产生的子核大小不等，形态多样。同种藻各部位及不同种藻相同部位无丝分裂情况有所差别，特别是钝节拟丽藻节部细胞发现有单核和双核存在，并且有绕裂和劈裂发生，而其他两种藻节细胞均为单核，也未观察到无丝分裂现象[6]。其后关于轮藻的研究几乎处于停顿状态，使我国现生轮藻研究大大落后于国际同行。 目前国内关于轮藻的研究多集中在其在环保、农业、医药业等方面。根据药典中的描述，轮藻全藻可以入药，具有疏风清热、利湿止咳之功效，可治愈风热感冒、烫烧伤等症[7]。谢树莲等对部分轮藻生化成分的显示，轮藻中含有多种矿物元素，其中Ca的含量相当高，可达3579μg/g，而人类必需的一些微量元素，尤其是Cu、Zn、Mn、Fe等具有重要药理活性的元素均有一定含量。轮藻所含氨基酸成分种类也比较齐全，而且必需氨基酸含量丰富[8,9] 。张猛、谢树莲等研究了轮藻的驱蚊抑菌作用，他们发现以轮藻为主要有效成分制成的香皂对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌3种供试菌进行抑菌实验，并作为驱避剂对蚊虫进行驱避测试。结果表明该香皂具有良好的抑菌效果，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌效果明显，抑制率分别达到98.39%和98.62%。该香皂对蚊虫有较强的驱避效果，防止蚊虫叮咬的有效保护时间平均为1.583h[10,11]。 另外轮藻在渔业、环保、饲料、医药等方面具有巨大的应用价值。资料显示轮藻作为鱼类的饵料，能够增加鱼类体内的EPA和DHA的含量，而这两种物质对水产品如鱼等的生长发育有重要的作用。轮藻具有耐酸性、耐抗生素和比一般微生物制剂热稳定性高的特点，因此轮藻可用于动物饲料添加剂，一方面可以为动物提供多方面的营养物质，另一方面在动物体内可直接杀灭细菌，增强动物免疫性[12]。从轮藻中提取的磺，可治疗和预防甲状腺肿。 虽然轮藻本身对环境适宜应强而且生长周期短，但野外生物量有限，不利于轮藻产品的产业化进行，所以对其实现人工培养势在必行。目前对于藻类的培养，不论国内还是国外都多集中在单细胞藻类的培养研究，如小球藻、雨生红球藻等，其培养基配方及培养条件都研究较为透彻，而对多细胞藻类来说，由于其生活史较为复杂，人工营养繁殖较为困难，所以其培养研究相对缺乏。本实验主要先通过对轮藻营养繁殖的研究来获得轮藻生长繁殖的最适培养基，并通过正交实验确定培养基的配方，最终完成对轮藻的人工培养中培养基、培养条件等方面的研究，实现轮藻的人工培养，以满足开发轮藻产品工业生产的需求。 1 材料与 1.1 材料 1.1.1 材料  普生轮藻（C.vulgaris）于2012年5月13日采于太原市晋祠公园，采集人张锦华。 1.1.2 药品  MgCl2，CaCl2，EDTA，Na2EDTA·2H2O，NaOH溶液（pH 8～9）。 1.1.3 器具  人工气候培养箱（海尔公司，hrqh-300h）胶头滴管，pH计，吸水纸。 1.2 方法 1.2.1 轮藻的驯化  分别向编号为1～24的锥形瓶中加入100mL的自来水，然后将它们全部放入光照培养箱中，在温度为22℃，光照强度2200lx，光暗比12h:12h的条件下放置24h后，把实验所用的轮藻接种到锥形瓶中并封口，然后在相同条件下培养24h。 1.2.2 培养基的配制及分装  培养基的配方整体上参照M-11培养基的配方，并在局部做了一些改动。改进后的培养基组成为：不变成份为：MgCl2· 7H2O 29mg/L，CaCl2· 5H2O 40mg/L，Na2CO3 20mg/L，Na2EDTA·2H2O 1mg/L，KH2PO4 10mg/L。可变成份如下表： 表1：不同N/P和Fe2+浓度所对应的培养基可变成份的配比 Table 1. The ratio of variable component in culture medium N/P Fe2+浓度(mol/L) NaNO3浓度(mol/L) EDTA-NaFe浓度(mol/L) 16:1 0.3 100 2.25 0.6 100 4.5 0.8 100 6         40:1 0.3 250 2.25 0.6 250 4.5 0.8 250 6         80:1 0.3 500 2.25 0.6 500 4.5 0.8 500 6         把配制好的培养基按次序加入实验所用的锥形瓶中，每个瓶中加入100mL。其中标号为1～3的锥形瓶中加入N/P16:1，Fe2+浓度为0.6mol/L的培养基，标号为4～6的锥形瓶中加入N/P16:1，Fe2+浓度为0.3mol/L的培养基，标号为7～9的锥形瓶中加入N/P40:1，Fe2+浓度为0.3mol/L的培养基，标号为10～12的锥形瓶中加入N/P40:1，Fe2+浓度为0.6mol/L的培养基，标号为13～15的锥形瓶中加入N/P40:1，Fe2+浓度为0.8mol/L的培养基，标号为16～18的锥形瓶中加入N/P80:1，Fe2+浓度为0.3mol/L的培养基，标号为19～21的锥形瓶中加入N/P80:1，Fe2+浓度为0.6mol/L的培养基，标号为22～24的锥形瓶中加入N/P80:1，Fe2+浓度为0.8mol/L的培养基。 1.2.3 测量初重  用吸水纸把驯化后的轮藻表面的水充分吸干，然后逐个测量其初始重量并记录。 1.2.4 定期称重测量  将测量后的轮藻分别接种到已加入培养基的锥形瓶中，封口后在光照培养箱中进行培养，温度为22℃，光照强度2200lx，光暗比12h:12h，每一处理设3个重复。每隔3天测量一次藻重并计录数据。 1.3 统计分析 采集的数据用SPSS17.0软件进行分析。不同处理间比较用单因素方差分析，并结合LSD进行多重比较。 2 结果与分析 2.1 N/P确定时不同Fe2+浓度和时间对轮藻重量的影响  表2：轮藻定期称重测量值 Table 2. The value of Charaphytes weight by regularly measured N/P Fe2+浓度 (mol/L) 不同测量时间的藻重 (g) 第3天 第6天 第9天 16:1 0.3 0.131 0.147 0.162 0.162 0.171 0.194 0.131 0.145 0.163 0.6 0.364 0.202 0.188 0.486 0.311 0.284 0.362 0.199 0.182 0.8 0.121 0.141 0.158 0.128 0.152 0.163 0.116 0.121 0.155 40:1 0.3 0.237 0.192 0.268 0.266 0.251 0.278 0.231 0.151 0.259 0.6 0.165 0.113 0.120 0.194 0.192 0.180 0.157 0.092 0.110 0.8 0.102 0.115 0.103 0.135 0.121 0.175 0.110 0.122 0.081 80:1 0.3 0.242 0.056 0.273 0.273 0.062 0.281 0.221 0.053 0.266 0.6 0.139 0.132 0.261 0.142 0.135 0.294 0.134 0.126 0.221 0.8 0.129 0.257 0.092 0.133 0.263 0.116 0.122 0.251 0.042                       表2所示的是不同N/P确定时不同Fe2+浓度和时间下所测得的轮藻培养后的重量，表2中所测得值用于计算轮藻的增重。