血吸虫病诊断方法及研究进展

血吸虫病诊断方法及研究进展 长期以来，血吸虫病诊断研究，一直是血吸虫病研究的重点之一， 并连续被列为国家医药卫生科技七五、八五、九五、十五攻关项目， 成为血吸虫病防治中的热门课。血吸虫病的诊断一般可以分为临床 诊断和实验诊断。前者主要依据病史和体症，虽有一定参考价值，但 往往缺乏足够的依据，不易和其他疾病相区别，难以确诊病人。因此， 必须依赖实验诊断，实验诊断可分为病原学诊断、免疫学诊断及其他 辅助诊断方法。 一、病原学诊断研究进展 （一）病原学诊断的地位 传统的病原学检查方法，有粪检和直肠镜检。尼龙绢集卵法、水洗沉淀法及改良加藤氏法等粪检方法，依然是基层疫区常用并首选的诊断方法。粪检或无治疗史者直检，为确诊血吸虫病人的最好依据。只要在受检者粪便中或未经治疗的患者活体组织内发现了血吸虫卵，即可确诊为血吸虫病人，是确定感染的最直接、最可靠的指标。 自从1903年Kasai氏首次在病人粪便中找到血吸虫卵以来，粪便检查一直是确诊血吸虫病和考核疗效常用的方法。粪便检查主要包括两大内容即检查虫卵和孵化毛蚴两种方法。检查虫卵：尼龙筛集卵法、沉淀法、透明法、改良加藤氏法；毛蚴孵化法：三角烧瓶法、塑料杯顶管法。 由于新中国成立以来，党和政府高度重视血吸虫病的防治工作，我国血防取得举世瞩目的成绩，无论是从病人的感染率或是感染度方面都显著下降，病人粪便中虫卵数大大减少，同其他检查方法比较，粪检的阳性率较低，漏诊多，因而改进粪检方法，提高粪检质量就一直是查病工作中的一个重要课题。事实上，粪检方法随着血防工作形势的发展，一直在不断的改进和提高，大量的现场查病工作也积累了丰富的经验。此外，血吸虫并非肠道内寄生虫，故非所有的虫卵都能随便排出，在粪便中查到的虫卵仅占雌虫产卵数的16%。在成虫排卵前期或者是非排卵期，就缺乏诊断价值，粪检也就失去了意义。而在发病后期，肠壁组织纤维增生，肠壁增厚，虫卵不易穿透肠壁而造成粪便中虫卵数减少，粪检时不易获得阳性结果而导致漏检。 （二）Kato-Katz 法 理想的病原学诊断方法应兼有简单、快速、经济、敏感性高、能 确定感染度、重现性好、适于现场应用等优点。Kato-Katz 法是当今WHO 推荐的血吸虫病定量检测方法，我国多次血吸虫病抽样调查以及全国血吸虫病疫情、病情监测等都使用Kato-Katz 法。然而Kato- Katz法检查粪量少，直接影响了该方法的敏感性，所以Kato-Katz法的漏检，特别是低感染度的漏检一直是大家关心的问题。为此，国内学者也做了一些新方法的探讨。         1  Kato氏法在不同流行区查病的漏检率            作者      单位  集卵法  孵化法  Kato氏法  疫区人群      钱小洪等  四川          25.97  40.26      大山区 陈大林等  安徽  24.53          55.66  重度流行区(EPG<20) 刘晓明等  安徽          10.57  52.85      急性病人 黄希宝等  湖北                  40.70      四个疫区村 毛官祥等  湖北                  47.50      重疫区(7/41) 罗建平等  江苏                  60           EPG<10     宋鸿焘等探讨了粪便检查在血吸虫病低度流行区查病的现场应 用价值。采用尼龙绢集卵孵化法和改良加藤氏法对463人进行检查， 两法阳性8例，孵化法阳性加藤法阴性9例，加藤法阳性孵化法阴性1 例，孵化法漏检率为5.6%(1/18)，加藤法漏检率为50.0 %(9/18)，尼 龙绢集卵孵化法比改良加藤氏法阳性检出率高，漏检率低，经x2测验， 两法差异有显著性。（中血2003；15（3）：218） 采用Kato法与粪便集卵孵化法在重疫区检查了2513人，其中男性 1503人，女性1010人，年龄最大者70岁，最小者三岁，均是农民和中小学生。两种方法共检出血吸虫阳性病例1027人，检出率为41.20%，孵化法检出率显著高于Kato法(P<0.05)(表2) 表2        2种方法诊断血吸虫病的对比      方法      检查例数    阳性数  检出率(%) Kato法    2513        176      7.00 孵化法    2513        994      39.55  [毛官祥等，湖北预防医学杂志 6（2）：39]   表3      不同感染者Kato法检出率比较                感染度(EPG)    沉淀虫卵计数法          Kato法                      阳性例数          检出数    检出率(%) 1~              42                12        28.59 10~              10                7        70.00 20以上          18                16        87.90  分析加藤法漏检原因，可能与Kato法取粪量过少及经过反复查 治，血吸虫病人的EPG低有关，另一方面， Kato法检出率高低与疫区人群感染度高低有关。在感染度低的疫区，若选用定量方法查病，作者认为采用尼龙绢筛集卵孵化法较为适宜。当EPG为8时，kato-katz法的检出率只有42.9%。用kato-katz法检测EPG真值≤5时很难找到虫卵,为10时其检出率只有55%,以往资料显示, kato-katz法在血吸虫病中，轻度流行区查病要遗漏部分病人。 四川吴子松等研究并经相关性分析，发现孵化出的毛蚴数与 Kato-Katz法的检出率呈正相关(r=0.9347)，作者认为在血吸虫病流 行区广泛使用Kato-Katz法，进行流行趋势动态监测，针对群体而言， 即使又部分漏检的情况下，Kato-Katz法优于孵化法。[实用寄生虫病 杂志1995；3（1）：21] 表4      Kato-Katz法对不同感染度的检出率                  孵化结果    平均毛蚴数  受检例数  阳性例数    检出率(%) +以下(1～5)    2.5        81        31        38.27 +   (6～10)    7.5      144        83        57.64 ++   (11～20)  15          98        59        60.20 +++ (21～30)  25          81        51        62.96 ++++ (>30)    40          63        52        83.87  四川作者近年探讨Kato-Katz法诊断血吸虫病时不同涂片数与检 出率的差异，对四川省血吸虫病流行区的240人进行Kato-Katz法检查，按顺序制作4张涂片，镜检计数血吸虫卵，结果1片至4片的检出率分别为15.83%，20.00%，22.92%，25.83%，检出率随涂片数增加而提高，3片与4片的病人EPG几何均数差异无显著性，建议血吸虫病查病时使用3张Kato-Katz涂片。[中血2002；14（6）：436] 表5          EPG涂片数与检出率的关系                EPG组  检查数         不同涂片数的检出例数                          1      2      3      4     6-      19          6      10      15      19  12-      20        11      15      17      20 30-    10          8      10      10      10 54-      13        13      13      13      13 合 计      62        38      48      55      62    （三）集卵直检法 四川所在山丘型血吸虫病流行区对2160人进行集卵直检法、Kato-Katz法和集卵孵化法的对比试验。样本感染度和感染率越低，集卵直检法检测性能越佳。集卵直检法镜下虫卵形态清晰，基层血防技术人员容易掌握。 方  法    检出率（%）  材料费用（元）     集卵直接法    13.10        2.05     Kato-Katz法    8.29        2.02     集卵孵化法      7.36        2.47 国家所钱珂等采用集卵薄涂片法检测牛粪中血吸虫卵，比较了薄 涂片法和透明法的虫卵回收率。结果表明，在三种虫卵梯度，薄涂片法的虫卵回收率，分别为透明法的18、4.2和3.5倍，现场检查34头孵化阳性黄牛的结果也证实薄涂片法优于透明法。薄涂片法检查半量粪渣(制6张涂片)的虫卵估计值和差与全量粪渣结果相似，可以代替全量粪渣检查。在感染度高的地区，可以检查1/4粪渣，制3张涂片，从而减少工作量。 （四）尼龙绢集卵法 尼龙绢集卵法已成为血吸虫病普查的常规方法。但是，在流行区普查血吸虫病工作中发现该方法也存在血吸虫卵散失的现象。 表6    49例阳性粪便尼龙绢不同淋洗次数检查结果            组别  检出毛蚴例数  检出率(%)  检出毛蚴只数  构成比(%) Ⅰ        44          89.8            2944        65.0 Ⅱ        34          69.4            413        9.1 Ⅲ        32          65.3            187        4.1 Ⅳ        44          89.8            988        21.8 合计        -            -            4532      100.0  江苏省血吸虫病防治研究所曾有两个类似的结果， 第一次是从 已知的10份阳性粪便，共检出毛蚴2101只，其中沉淀内检出毛蚴1050只，弃去的粪渣中检出毛蚴917只，损失43.6％。第二次现场试验结果，粪渣中散失毛蚴38.1％。浙江张雪娟等以尼龙筛法铜筛杯内的粪渣再进行孵化，并与尼龙筛内孵出的毛蚴数进行比较，结果毛蚴散失28.7％～35.3％，基本与上述结果一致。 （五）毛蚴孵化法（耕牛血吸虫病检测） 1、直孵法 检查的粪便既未经过铜筛杯过滤，也未经尼龙筛淘洗，粪渣多， 色素浓，影响其毛蚴孵出。根据中国农科院上海家畜血吸虫病研究室 诊断组50次试验结果，自然光照组比光照较弱组毛蚴孵出总数高出4 倍多。有作者特意将已经孵化5小时后的粪渣保留，通过尼龙筛淘洗， 再次加水孵化，2小时后孵出了大量毛蚴，说明许多虫卵可能由于光 线等原因未能孵出毛蚴。[浙江农业学报2004；16（6）：381] 2、顶管粪便孵化法 根据毛蚴具有向上性、向光性、向清性的特性，普宪光等将三角 烧瓶孵化法改进为顶管孵化法，将耕牛粪便置于铜丝筛中，在一个盛满水的茶缸中淘洗，取出铜丝筛，沉淀换水。在一个大于茶缸口的正方形木板中打孔插入玻璃管，加满水后倒盖在荼缸上（玻璃管口与茶缸内水面接触）孵化，在玻璃管中观察毛蚴。陈代荣、邵水康等对这一方法又作了进一步改进，设计了一种特制塑料杯和装有玻璃管的塑料盖。 3、粪便沉淀孵化法 该法最早用于诊断耕牛血吸虫病，该方法是取牛粪50g，经40一60目铜丝筛在盛有500ml水的茶杯或量杯中淘洗，取出铜丝筛，分别沉淀30分钟直至水清。滤去上清液将粪渣移入三角烧瓶中加满水在适宜温度(20—27℃)或温箱中孵化，分别在孵化后1、3、5小时或 2、4、6小时各观察一次，发观毛蚴即判为阳性。 4、尼龙兜淘冼孵化法 粪便沉淀孵化法，需反复换水，很费时，费水，在高温季节还必 须用1%盐水，以免毛蚴孵出倒掉。孙承铣等经反复试验比较，选择了一种孔目小于虫卵而粪便中色素可以滤过，型号为N xl03的尼龙筛绢，将经钢丝筛淘洗过的粪水，倒入用尼龙绢兜内在清水中淘洗，再将兜内粪渣移入三角烧瓶内加水孵化，观察毛蚴。 5、棉析粪便孵化法 用尼龙绢兜淘洗法，免去多次换水的操作程序，缩短了工作时间， 但用尼龙兜淘洗过的粪渣，其中一部分在孵化过程中将浮于三角烧瓶颈部，影响对毛蚴的观察，如在瓶颈下部加一隔层，阻止粪渣上浮，使观察部位保持清晰。有人曾进行这样有趣的试验，用一根一端为球形的玻璃管，在球底部放入水和毛蚴，水面上加一脱脂棉层，棉层上再加水，毛蚴可从棉层下的水中，穿过棉层进入上层水中。 6、粪便湿管孵化法 由于随粪便排出的虫卵，成熟期各不相同，毛蚴孵出时间也有长 有短，毛蚴逸出数量一般呈抛物线状。观察毛蚴选择在孵化后1、3、5或2、4、6小时就是这个道理。有学者提出能否使成熟早的虫卵抑制其孵出，而成熟晚的虫卵促使其成熟，使毛蚴在同一时间内达孵出高峰。 （六）直肠组织活检 人体感染血吸虫病后，血吸虫卵在体内肠粘膜沉积，引起肠粘膜 一系列病理变化，以直肠和乙状结肠尤为显著。因此，直肠镜、乙状结肠镜作为血吸虫病病原学检查的一种方法．可以补充粪检血吸虫孵化和集卵之不足。该法对无治疗史患者易作出正确判断。对有治疗史的患者，由于血吸虫卵在肠组织的演变形态较为复杂，需要一定识别虫卵形态的经验或进行染色才能作出较为正确的判断。 直肠镜检的主要副作用是损伤性出血和肠穿孔：①强行插镜与强 行拔出镜心所致损伤性出血；②当直肠镜筒与镜心末端接触肠壁粘膜过紧时，猛拉、急退、强行拔出镜心，远端势必产生负压，镜筒进腔越深，负压越大，致使肠壁粘膜与金属镜筒缘有力吸附，切割伤就越厉害；③原病变处的溃疡、息肉、孤立性小静脉瘤容易损伤而致出血；④活检肠粘膜时未避开较大血管和深部有血管搏动的部位。 （七）胃纤维镜检查 慢性和晚期血吸虫病患者的胃部病变尚未见胃纤维镜检查的详 细报道。对109例慢性血吸虫病和109例晚期血吸虫病患者的胃粘膜病变作了内窥镜观察。纤维胃镜检查 :使用Olympus GiF-Q20GiF-K2和国产XS一4型前视斜视胃镜观察胃粘膜病变和晚血患者食道静脉曲张情况。发现晚血的胃粘膜糜烂发生率明显高于溃疡（P＜0.01)，晚血和慢血患者的充血性(浅表性)胃炎发病率(86.2%和84.4%)均明显高于非血吸虫病患者的检出率（61.0%）。晚血的胃粘膜病变发病率明显高于慢血，特别是摩烂性胃炎的发病率高。晚血患者中胃粘膜病变有92.9%合并有幽门螺旋杆茵感染。 （八）动物解剖检查 解剖检查，即家畜尸体内收集血吸虫虫体，或在组织中检获虫卵，这是诊断血吸虫病最为准确的方法。在收集虫体时，首先必须了解血吸虫在宿主体内的主要寄生部位是肠系膜静脉、痔静脉和直肠静脉，有时在门静脉、胃静脉及肝脏也能找到少量虫体。因此，在收集虫体或检查虫卵时，主要对这些部位进行冲洗集虫和作肝、肠组织压片镜检虫卵。 1、冲洗集虫检查 （1）胃肠道血管虫体收集法 牛宰杀后，为防止血液凝固，应组织多人尽快从速剥皮。事毕，将牛头弯转至牛体左侧，使牛仰卧呈偏左倾斜姿势，剖开胸腔和腹腔，除去胸骨。首先，分开左右肺，找出暗红色的后腔静脉，并进行结扎；其次，在胸腔紧靠脊柱的部位找到白色的胸主动脉，左手将其托起，右手用剪刀沿血管平行方向剪一开口，然后将带有橡皮管的玻璃接管从离心方向插入，并以棉线扎紧固定，而橡皮管的另一端与压缩式喷雾器连接，以便进水；第三，在肾脏后紧贴脊柱处，将并列的腹主动脉及后腔静脉同时结扎或以止血钳夹紧，避免冲洗液流向后躯其他部位；第四，在胆囊附近，肝门淋巴背面，细心分离出门静脉，向肝一端以棉线或用止血钳扎紧，离肝一端取与血管平行方向剪一开口（尽可能贴近肝脏，以免接管进入肝静脉的肠支，而影响胃支中虫体的收集），插入带有橡皮管的玻璃接管，并固定之。为防止血液凝固，接管内应事先装满5%的枸橼酸钠溶液，在插入接管时此溶液即会流入血管中，橡皮管的另一端接以铜丝筛，以备出水时收集虫体。手术结束后，即可启动喷雾器，注入0.9%加温至37∽40℃的食盐水进行冲洗，虫体即随血水落入铜丝筛中，直至出水清晰，无虫体冲出为止。如虫体仅作为计数用，也可以将橡皮管直接接到自来水管上冲洗，不必应用0.9%食盐水，而且压力更大。为了方便，门静脉可不必进行插管，可以直接剪断，并在该处收采虫体。 （2）肝脏中的虫体收集法 胃肠血管内虫体收集完毕后，从肝脏的后腔静脉（位于胸腔内）离心端插入导管，结扎固定。同样与喷雾器或自来水管相接，然后解开门静脉（近肝脏端）的结扎线，装置出水接管，将橡皮管导入铜丝筛中，冲洗。启动喷雾器或打开自来水龙头冲虫，但是应该慢慢放水，以避免水压过大，造成肝脏破裂，待至血水变清，无虫体冲出为止。 （3）痔静脉内的虫体收集法 试验证明，人工感染血吸虫病的动物、包括牛、羊、猪等，大部分在痔静脉内可检获到一定数量的虫体，但是一般的冲洗方法，不能把痔静脉内的虫体冲洗出来，必须另作检查。其方法是：剖开骨盆腔取出直肠，先排出直肠内残余粪便，然后以左手伸入直肠中衬托肠壁，此时痔静脉充分暴露，沿痔静脉进行检查，发现痔静脉内有虫体时（多半是雌、雄合抱，呈黑色），以剪刀剪断血管，然后以镊子轻轻将其挤出。其他动物可参照牛的方法进行。 2、肝脏虫卵检查 （1）虫卵压片检查法 将肝脏上粟米大小的白色血吸虫虫卵结节，以眼科剪取下，置于载玻片上，再用另一张载玻片将其压紧，然后以胶布或橡皮筋固定之，置于低倍镜下检查。阳性者可见到似肠黏膜上虫卵结节样的血吸虫虫卵。 （2）虫卵毛蚴孵化法 轻度血吸虫感染的动物，捕杀后，肝脏病变不甚明显，任意取肝组织压片检查，往往得不到很好的结果。在这种情况下，为了确诊血吸虫病，可作肝组织毛蚴孵化检查。方法：任意取肝组织10∽20g，剪碎，置于组织捣碎机内捣碎，加上适量水调匀，先通过40孔/25.4mm铜筛杯过滤，弃去滤渣，将滤液倒进260孔/25.4mm尼龙筛兜内淘洗干净，然后将这些肝组织倒入三角烧瓶内，作毛蚴孵化。这种方法可以获得较满意的效果。 （九）病原学检查的注意事项  1、粪检的注意事项 ( 取材的部位：粪便中虫卵的分布以外层多余内层，头段多于尾段。 ( 粪检的次数：1-5次粪检的阳性率分别为65.4%，91.5%，97.2%：98.8%，99.5%，第4次以后每次递增不足1%。 ( 被检的粪量：30-50克，粪卵（100克含10个卵）检出率为100%，20克检出率为80%，10克检出率为40%。 ( 粪检的季节：牛粪中毛蚴孵化以4-7月为最高，11-1月最低。 ( 粪便保存和运输: 注意防高温、干燥和暴晒，粪便外层虫卵多于内层，因黏附易丢失虫卵。 2、改良加藤氏法 与疫区的流行程度、病人的感染度以及粪便中虫卵数密切相关。 在低中度流行区注意增加涂片数或进行厚涂片法，可减少漏检。 3、集卵检查的注意事项 尼龙筛集卵法: 快捷、简便、省时、省力、集卵效率高；缺点是 黏附、交叉污染问题。沉淀法:粪便需调匀，以防铜筛上层粗渣中虫卵的丢失（有实验报道可丢失38.1-43.6%）；换水速度间隔30分钟为宜；涂片3-4张为佳，以疫情轻重作为参考。 4、毛蚴孵化注意事项 ( 孵化用具：顶管法（毛蚴观察容易） ( 孵化用水：去氯水 ( 温度与光线：要适宜 ( 毛蚴鉴别要点：三性、匀速直线运动 5、血吸虫病直肠镜检查注意事项 ( 直肠黏膜组织活检方法：看清部位、避开血管、展平黏膜、固定镜筒、控制组织钳开口及被钳组织的大小。 ( 钳取组织的部位：10厘米位置、黏膜病变处阳性检出率高 ( 对有治疗史者组织中虫卵死活的鉴别。 二、免疫学诊断研究进展 通过我国控制日本血吸虫病策略的实施，经反复化疗，血吸虫病的病例已明显下降，病人数从50年代 1千多万降到2002年82万。在血吸虫病的流行区，该病的感染率和感染度都有显著下降。 在血吸虫病流行地区，特别是低感染度的居民，其粪便中虫卵的排出常发生波动，寄生虫学的诊断技术，如粪便检查，敏感性低，而且费时、费力，成本/效率低，群众对粪检的依从性也越来越低。因此，寄生虫学方法在有效检测血吸虫病方面的作用愈来愈差。而免疫诊断技术则具有较多的优点，与寄生虫学方法相比，更为敏感、特异性好、操作更简便。特别是自上世纪80年代，高效、低毒的口服抗血吸虫药－吡喹酮引入中国以来，免疫诊断逐渐被专家和疫区的群众所认同，并整合入我国血吸虫病防治策略中。已有很多种免疫诊断技术在我国疫区广泛用于对化疗靶人群的确定，同时，在流行病学调查、防治效果评价等方面发挥着重要的作用。 （一）我国血吸虫病免疫诊断方法的发展史 我国的科学家在日本血吸虫的免疫诊断方面作出了巨大的努力。早在1936年，甘怀杰等采用以血吸虫虫卵作为抗原的皮内试验（ID），成功地用于血吸虫病的诊断。自20世纪50年代，这一试验被大规模用于血吸虫病的调查。在此以后，陈祜鑫等发展了一种尾蚴膜反应（CHR）的体外诊断方法。 环卵沉淀试验（COPT）是在我国研究较多，且应用时间较长的一种免疫诊断方法。我国自1958年，刘献等首先应用完整的新鲜虫卵检测日本血吸虫的感染。以后改用冷冻干卵或热超声干卵代替鲜卵作为诊断抗原。在方法学上也作了一系列改良。陶义训等首先在我国将间接血凝试验（IHA）用于血吸虫病的诊断。以后在抗原作了改进，杨赞元等（1976）采用冻干致敏红细胞代替新鲜冻干红细胞，使该方法更适合在现场应用。1978年严自助等首先在我国将ELISA方法用于诊断。自此以后，我国研究人员对ELISA方法做了大量的研究和改进，不仅应用SEA作为抗原，而且还应用纯化抗原、组分抗原或抗个体基因型抗体等作为抗原。在此方法的基础上，发展了酶标记抗原对流免疫电泳（ELACIE）、免疫酶染色法（IEST）和快速ELISA、Dot—ELISA。1985年裘丽姝发展了另一种免疫诊断方法－胶乳凝集试验（LA）。朱荫昌及其同事研制成功了胶体染料试纸条法（DDIA），更适合大规模的现场应用。 从上世纪80年代起，我国的研究人员已经成功研制了多种单克隆抗体，如3D8A、NP28－5B、ⅢD10、8SE4和AT1。并应用这些单克隆抗体建立了多种检测方法。但遗憾的是，通过1993年和1995年二次全国性合作研究显示，这些方法并不令人满意，对慢性病例，特别是低感染者，敏感性较低，特异性差。最近在我国发展了应用重组抗原，如rSj26GST、rSj23HD、rSj32、rSj31－b，或者是抗重组抗原的单克隆抗体，如AT1，检测血吸虫病的抗体或抗原的方法。 （二）我国应用的主要免疫诊断方法 在我国应用较广泛的免疫诊断方法主要是皮内试验、环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶标免疫吸附试验和试纸条快速诊断试验。 1、皮内试验（ID） 该法具有操作简便、判断结果快速以及价廉等优点，其敏感性与粪检虫卵阳性的符合率可达到96％以上。该法在50年代曾为全国血吸虫病的调查发挥了重要的作用。但由于其抗原无法达到体内用药的标准，且在流行区一旦病人出现阳性，即使已经治愈，几乎不会转阴。因此，该方法目前在我国已不再使用。 2、环卵沉淀试验（COPT） 自从1958年我国应用COPT法诊断血吸虫病以来，研究人员在该方法的抗原和方法学方面不断进行了改进。冷冻干卵和热超声干卵的制备已经达到标准化。改良的COPT方法例如双面胶纸条法（DGS－COPT）、PVC膜片法、塑料管法等，使COPT的操作更方便。该方法具有较高的敏感性和特异性。其敏感性与粪检阳性的符合率达到94.1－98.6％。非流行区健康人的假阳性率为2.5－3.6％。通过有效治疗3－8年后，经COPT检测阴转率分别为82.5％和80－83％。然而，在病情控制的地区，经过反复治疗，其感染率和感染度都很低，COPT的检出率明显下降，仅为70－80％。COPT的另一些缺点是操作繁琐且判断结果耗费时间长（一般为48－72小时），而且需要使用显微镜。所以这些就限制了该方法在我国现场进一步的推广应用。 3、间接血凝试验（IHA） IHA是继COPT后在我国广泛应用的一种免疫诊断方法。杨赞光等（1976年）首次在现场采用冻干致敏红细胞用于IHA试验。吴福东等以Sephadex G 100 纯化虫卵抗原代替粗抗原，提高了该方法的特异性。该方法与粪检的符合率达到93－100％，非疫区健康人的假阳性率为1.71－3.0％。与肺吸虫的交叉反应分别为64－84％（粗抗原）和31.3％（纯化抗原）。有效治疗后3年或者3年以上，大多数病人IHA可以转阴。由于该方法简便、快速，可用于血吸虫病疫区（人群）的诊断以及在疫区对化疗靶人群进行筛查。然而，该方法在结果判定时存在着主观性。 4、酶联免疫吸附试验（ELISA） 用于血吸虫病诊断的常规ELISA常使用可溶性虫卵抗原，其敏感性与粪检阳性的符合率可达到95％以上，非疫区健康人群的假阳性率为1.3－3.3％。在有效治疗1－2年后，阴转率可以达到58.5－59.8％。该方法具有良好的敏感性和特异性。然而，操作过程需花费2－3小时，而且需要ELISA检测仪，这在疫区大规模的现场应用存在一定困难。随着抗原的改进，该方法扩展了其应用领域。例如，应用1％可溶性抗原和尿素溶解性抗原的混合物代替可溶性抗原作为快速ELISA的诊断抗原，其敏感性和特异性均与常规ELISA相似，但操作相对简便、快捷，这有利于在疫区现场的应用。当用NP30（一种抗个体基因型抗体）作为“内影像抗原”时，该方法对急性血吸虫病人的检出率与常规ELISA相似（阳性率为95－100％），但在慢性病例中的阳性率只有61－73％，低于常规ELISA。然而，对于有效治愈后1年的血吸虫病人的阴转率可达42.5－100％，似具有疗效考核价值。用血吸虫的虫卵组分抗原（107－121KDa）作为检测抗原检测抗血吸虫短期抗体，建立了FA－ELISA，该方法有较高的敏感性（91－95％）和特异性（96.7％），均与常规ELISA相似，并且有较好的疗效考核价值，经过一年半的有效治疗后，阴转率可以达到90％以上。另外，该方法与肺吸虫、肝吸虫以及姜片虫几乎没有交叉反应。这明显优于常规的ELISA方法。 5、胶体染料试纸条法（DDIA） 为了发展一种快速、简便的免疫学方法以用于疫区的现场应用，朱荫昌及其同事发展了一种新颖的诊断方法－胶体染料试纸条法。这种方法采用国产染料标记可溶性抗原，以硝酸纤维膜为支架，通过层析技术检测血吸虫病人的抗体。 检测日本血吸虫病具有很高的敏感性和特异性：检测急性和慢性血吸虫病的敏感性分别达到96.7%和94.1%-97.2%，非流行区健康人的特异性达98%以上，具有较高的诊断效能。检测湄公血吸虫病的敏感性达97.0%(33/34柬埔寨)和98.6%(69/70老挝)，特异性（非流行区健康人）达100.0%(0/114)。检测曼氏血吸虫病（埃及）16例粪检阳性的曼氏血吸虫病人DDIA全部阳性，5例健康者全部阴性。检测家畜血吸虫病：牛、猪的敏感性达95.7%-100.0%，特异性达94.0-95.7%。 该方法的特点是快速：整个试验仅需5-10分钟即可判定结果；简便：操作简单，不需专业培训即可操作，不需任何特殊的仪器设备；试剂可在室温保存，运输中不需冷藏，但酶在运输中必须冷藏；价廉：染料的价格要比酶和胶体金低几十倍。 该方法本身的特点是：由于应用层析法，反应背景很清晰（较Dot法清晰）；而且在每张试纸条上均设有质量控制对照带，保证了每份试验的可靠性。本方法不仅可检测血吸虫病人，还可以检测感染血吸虫的家畜。该方法既可以检测日本血吸虫病，而且还能检测其他血吸虫病，例如湄公血吸虫病和曼氏血吸虫病。 6、Dot－ELISA 严自助等（1990）建立了应用抗CCA的单克隆抗体检测血吸虫循环抗原的Dot－ELISA方法。这种方法在急性、慢性病人的敏感性分别达到90.6％和83.2％。非疫区健康人群无假阳性反应。除与肺吸虫有交叉反应外（10％），与其他寄生虫的交叉反应较低。大多数病人治愈后1年可转为阴性，该方法有较好的疗效考核价值。 以上的免疫诊断方法是目前在我国各地常用的免疫诊断方法，但在我国已建立的方法远远不止这些，在实际应用中，需要根据不同的防治目标来选择不同的免疫诊断方法或不同诊断方法组合。 三、免疫学诊断技术在日本血吸虫病流行病学中的作用 在血吸虫病流行病学调查中，随着血吸虫病流行区的人群感染率和感染度普遍下降，而原有的粪检筛查方法因其操作繁琐、漏检率高而无法满足流行病学调查的需要时，免疫学方法因其较粪检敏感且能反映感染的累积状态和近期流行情况而逐渐受到重视。凭借着抗原抗体反应的特异性，血吸虫病的免疫学检测技术为该病的流行病学调查研究提供了许多有力的测量手段。籍此，血吸虫病流行病学将现场调查和实验室免疫学检测有机的结合起来，大大提高了研究的客观性与精确性。本节主要从血吸虫病血清流行病学调查方法、血清学检测方法的选择与评价以及血清流行病学调查的应用等方面作一综述。 （一）调查方法 以往的血吸虫病血清流行病学调查方法主要采用横断面调查和重复横断面调查。前者大多是对不同程度流行区或防治结果有差异的地区不同人群血清中的特异性抗体水平作一横向比较，以期获得血清抗体水平与流行状况之间的关系。后者主要是纵向观察同一或不同地区人群血清中特异性抗体水平随化疗等防治措施的开展而动态变化的情况，以期通过抗体水平的波动规律反映和评价防治措施的效果。 1、横断面调查 陈淑贞等应用日本血吸虫肠相关抗原的间接血凝试验（IHA），对一个现存的和两个已经基本控制传播的历史流行程度不同的血吸虫病流行区人群进行血清流行病学的调查。结果发现，现存流行区的人群抗体阳性率（67.4%）和阳性抗体滴度平均水平GMRT(119.3)明显高于基本控制传播的历史重流行地区（21.7%、32.2）和历史轻流行区（4.6%、12.6）；现存流行区低年龄组抗体阳性者的GMRT较高年龄组为高，而已经控制传播的地区低年龄组抗体水平则为0；在基本控制传播地区，历史重流行区高年龄组的抗体阳性率和阳性GMRT均高于历史轻流行区。研究者认为，三个地区的抗体阳性率差异因其选择的类型不同且调查点较少，不能代表各种典型的流行状态，所以难以通过横向比较来阐明人群抗体水平与当地血吸虫病流行程度之间的关系。但现存流行区人群阳性GMRT随年龄增加而下降的趋势，与人体对曼氏和埃及血吸虫特异的成虫肠相关抗原的体液免疫反应调变现象——抗体滴度随感染持续时间的延长而下降相一致。这一点在日本血吸虫病兔模型的连续观察中也曾得到证实。因此，在某一特定地区内，分析当地低年龄组人群的抗体水平，似可作为评价传播是否阻断的依据并作为监测流行趋势的工具。而传播基本控制流行区内高年龄组人群的抗体反应似可反映当地以往的传播和感染，且其抗体水平的高低似可作为回顾一个地区血吸虫病流行程度的参考指标。 在另一对不同流行情况的8个点的横向血清流行病学调查中，研究者观察了高度流行区、中度或低度流行区和基本控制或基本消灭地区三种人群抗体反应。结果显示，在高度流行区，人群抗体阳性率和总GMRT均高；在传播已得到一定程度控制的中度或低度流行区，人群抗体阳性率较高度流行区的为低，而总GMRT的低水平更为显著；在基本控制或基本消灭地区，人群抗体阳性率和总GMRT的水平更低，甚至低年龄组为0。提示总GMRT的低水平可作为传播频度下降的指标，而抗体阳性率和总GMRT的年龄分布曲线则反映了传播和流行程度。流行程度愈高，高峰值的位置愈偏向低年龄组，反之亦然。在云南洱源县，杨锦亮等对5个不同流行程度地区亦开展了类似的血清流行病学调查。结果显示，5个调查点的抗体水平与流行程度相关显著。与湖区同类地区相比，该县抗体阳性率和高滴度出现率较高而总GMRT较低。作者认为这可能与云南血吸虫病的高感染率、低感染度的特点有关。研究还显示，年龄组抗体水平的高峰位置较湖区同类地区推迟，且重流行区抗体反应的全频率分布曲线与湖区亦不同。 此外，对基本消灭血吸虫病7年和12年的地区人群采用间接血凝试验（IHA）进行检测，并与正在流行的地区和非流行区比较。结果显示，前者仍维持较低的血凝抗体水平，而后者已下降到正常人群的水平。对年龄分组资料的进一步分析似也证明了低年龄组人群的IHA阳性率和GMRT在一定程度上可反映流行区控制血吸虫病的状况，而高年龄组人群的抗体水平似可反映该地控制感染时间的长短。 2、重复横断面调查 姜耀明等用环卵沉淀试验（COPT）对处于重、中、轻度流行的开化县庄埠村人群血吸虫病血清抗体进行防治初期、控制及阻断流行全过程的纵向观察。结果表明，从1983年到1987年，不同流行程度地区各年龄组人群的COPT阳性率、总环沉率几何均数和高环沉率的阳性率三项指标值均呈逐年下降趋势。而且环沉率全频率分布曲线也显示，环沉率≥30%的频率逐年下降，0%组的频率逐年上升，重、中度流行地区的环频曲线由原先的起点低于尾端的重度型环频曲线和起始部显著高于尾端的中度型环频曲线有规律地转变成中度型和轻度型环频曲线（起点很高，急剧下降而趋于平坦），至1987年各地均呈轻度型。提示COPT检测人群血吸虫病抗体水平的消长和环频曲线形式及其变化能反映血吸虫病流行程度及其受控趋向。这与在湖沼地区的4个不同类型血吸虫病流行区连续3年的纵向调查结果相一致。 （二）血清学试验方法的选择和质量评价 在过去的50多年时间里，血吸虫病的免疫学诊断方法和技术层出不穷，如COPT、IHA、酶联免疫吸附试验（ELISA）、细胞凝集试验、酶联免疫印渍技术和胶体染料标记技术等。然而，由于受价格、反应时间和操作要求等多种因素的影响，有很多方法目前仅限于实验室研究或现场小规模应用，而真正在大规模的血清流行病学调查中得以推广的试验方法并不多。 在血清流行病学调查过程中，血清标本检测的工作量大，影响因素多。因此，血清学试验方法的一般选用原则为灵敏度和特异度高、重复性好、操作简单、经济安全。同时，大量血清标本的检测往往需要多个实验室或较多的实验员参与。因此，须对实验条件和操作规程等进行严格的质量控制，同时须对所选用的实验方法及其检测结果的真实性与可靠性进行质量评价。为了解我国血吸虫病防治工作中使用的免疫诊断试剂的综合质量，许静等采用单盲法对4种间凝试剂盒、3种ELISA试剂盒、1种层析法试剂盒和1种斑点金免疫渗滤法试剂盒进行了综合测评。结果显示参评的9种试剂盒总体上质量较好，绝大部分试剂盒的敏感性和特异性都达到了现场应用标准。 （三）血清流行病学调查的应用 1、疾病状态的群体诊断  即对某特定人群，从整体角度对其患病状态做出诊断，血清流行病学调查能够反应血吸虫病在一特定地区的流行状况并提供新信息。如血吸虫病暴发流行的快速诊断，既往流行的推断性诊断及其对高危人群的筛检等。张玉其等为了解和掌握湖沼渠网型地区不同人群血吸虫病流行情况以便采取针对性防治措施，于化疗前后对湖北省潜江市张金镇的中小学校和镇办企业等不同人群进行了血清流行病学调查。结果发现除农村居民外，乡镇企业员工、机关干部和中小学师生中均存在一定的感染率。提示在血吸虫病重度流行区，血防主管部门除对农村居民进行大规模的常规查治和扩大化疗外，还应将乡镇企业员工、机关干部和中小学师生等纳入血防工作规划统一管理和查治。同时采取加强健康教育和灭螺等措施以达到控制血吸虫病流行的目的。 吴观陵等报道在8个不同的日本血吸虫病流行地区，用GAA－IHA的方法对人群进行调查，结果显示有三种不同类型的针对GAA的抗体模式。表明，血清流行病学调查的资料可以用于衡量血吸虫病疫区的流行性、监测疾病传播的变化趋势和评价血吸虫病的防治效果。 2、疾病监测与预测疫情动态 通过人群血清抗体调查，系统了解群体免疫水平及其动态变化，为决定当地的血吸虫病防制工作重点提供科学依据，同时可预测疫情动态，推测血吸虫病流行的可能性及流行强度。张悟澄等在血吸虫病重度、中度和已控制流行地区用ELISA法对各年龄组人群的特异性IgG及IgM进行了检测。结果表明，不同地区的特异性抗体阳性率曲线均具不同的特征，籍此可判断当地目前的传播情况，并可评价以往的防治效果。如定期调查可起到疫情监测的作用。 3、考核防制效果 江苏省应用COPT和ELACIE对血吸虫病疫区219－453名居民进行了连续5年的纵向观察，结果表明这两种方法能够被用于防治效果的评价以及反应疾病传播的趋势。我国的研究人员还报道，使用ELISA、IHA和COPT等免疫诊断方法对特定的流行区人群抗体阳性率、抗体水平年龄分布曲线以及抗体水平进行观察，结果显示，免疫诊断方法对于评价疫区的防治措施的有效性十分有用。 在菲律宾莱特地区，研究者通过对当地小学生连续4年的血清流行病学调查来评价所采取的吡喹酮治疗、灭螺和卫生教育等4项措施的防制效果。结果显示每年患病率都有显著下降。鉴于吡喹酮的药物生物学效应，研究者认为，当用每年的患病率来评价血吸虫病控制的情况时，最好选择6-7岁的一年级新生。因为该年龄组患病率低且并未经药物治疗，所以他们是反映人群血吸虫病患病率变化的最敏感指标。 在血吸虫病的血清流行病学调查中，规范化的操作、标准化的诊断试剂和客观统一的结果判断标准可提高不同实验室和不同地区间的可比性，增加其可靠性和监测的敏感性。因此，今后在选择血清学试验方法时除了要考虑敏感性、特异性和诊断效能等因素外，同时应兼顾上述三个方面的指标，以期得到更客观可比的研究结果，为血吸虫病的监测和预警提供更科学的参考依据。 尽管血吸虫病免疫学诊断方法广泛的应用于现场，同时也广泛应用于流行病学评价，对评价人群的感染率和感染度有着一定的意义。但从方法学本身来说还存在着一些不足，最主要的问题是抗体消失需要较长的时间，在疗效考核方面存在缺陷。由于目前用于现场的诊断方法主要是检测抗体，而抗体的消失需要２－３年，甚至更长，因此在每年进行化疗的重度疫区来说，如何进行评价确实存在问题。