“黄芪颗粒”提取工艺优化及质量标准提升的研究（可编辑）

“黄芪颗粒”提取工艺优化及质量提升的研究（可编辑） 密 级. 分类号. 学校代码文 学 位论 “黄芪颗粒”提取工艺优化及质量标准提升研究 贵州技术创新项目 贵州省教育厅自然科学研究项目黔教科号 贵阳市科学技术计划项目筑科合号 何艳 指导老师姓名: 周.趑 专业名称: 生药堂 申请学位级别: 亟? 论文答辩日期: 生三月 论文提交日期: 生堇旦 学位授予单位和日期:贵田主医堂瞳生鱼旦贵阳中医学院硕士学 位论文相关声明 原创性声明 本文声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的 研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果,也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 日期: 矽三年多月节日 作者.坼涉 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留 学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文;学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 日期:乃三年争日 作者签名:确桫 导师签名:司砍贵阳中医学院硕士学位论文 目 录 中文摘要?...?.?.??.. 前言一 第一章黄芪颗粒提取工艺优化研究??一 仪器与试药:艺流程工艺考察??.. .水提工艺?一 .醇沉工艺小结与讨论? .小结?. .讨论?. 第二章黄芪颗粒的质量标准提升 第一部分测定黄芪颗粒中五种化合物的含量方法研究. 仪器与试药? 方法与结果?. .对照品溶液的制各. .供试品溶液的制备. .色谱条件?. .供试品溶液的测定. .方法学考察? .样品测定?. 小结与讨论? .小结?. .讨论?. 第二部分黄芪颗粒中总黄酮的含量测定 仪器与试药?. 方法与结果? .对照品溶液的制备. .标准曲线的制备?. .供试品溶液的制各. .精密度试验. .稳定性试验. .重复性试验. .准确度试验. .供试品含量测定?. 小结与讨论? .小结?. .讨论?. 第三章黄芪颗粒质量标准草案? 结论与展望 结论与创新点贵阳中医学院硕士学位论文 存在的不足?.. 展望??. 参考文献??一 附录一综述?一 药理研究 临床研究提取工艺质量控制??. 附录二个人简介? 贵阳中医学院硕士学位论文 中文摘要 黄芪颗粒是以黄芪全成分提取物为主要成分所制成的内科中成药,具有补气 固表,利尿,托毒排脓,生肌等功效。用于气短心悸,虚脱,自汗,体虚浮肿, 慢性肾炎,久泻,脱肛,疮口久不愈合。黄芪颗粒现收载于《中华人民共和国卫 生部药品标准?中药成方制剂第册》年,第页,标准编号: ..?】见附录二。 黄芪颗粒作为贵州汉方制药有限公司的“拳头”品种之一,有着其广阔的市 场需求。在《中华人民共和国卫生部药品标准?中药成方制剂第册》中对 其提取工艺及质量控制方法作了一定的限定,该标准在当时的情况下具有一定的 先进性和合理性。但是,随着科技的不断发展,人们健康安全意识不断提高,目 前黄芪颗粒的提取技术及质量控制水平已经不能满足时代发展的需求。特别是黄 芪颗粒产品的质量控制水平落后,这一关键问已经阻碍了黄芪颗粒的进一步发 展及做大做强。因此,迫切需要利用现有先进技术,对黄芪颗粒这一名优品种进 行提取工艺的优化和质量标准提升研究。本文在不进行提取工艺本质改变的情况 下,促进工艺合理化,参数可控化,确保生产出来的产品质量稳定可控,增强该 产品的市场占有率,以满足社会经济发展的需求。并对其主要有效成分的含量进 行测定,以达到从直观上控制黄芪颗粒的质量。实验结果表明:黄芪颗粒提取工 艺参数合理、可行:质量控制测定方法操作简单,检测结果快速、准确,可用于 黄芪颗粒的质量控制。本课题主要研究包括以下三部分: 第一章:黄芪颗粒提取工艺参数的优化 以黄芪甲苷的含量及得膏率的综合评分值,采用单因素考察,并在单因素考 察的基础上进行了正交试验,优选出黄芪颗粒的最佳提取工艺,并验证。 水提部分:分别考察了药材粉碎粒度、提取温度、溶剂用量、提取次数、提 取时问对提取效果的影响。 醇沉部分:分别考察了相对密度、含醇量、醇沉时间对纯化效果的影响。 第二章:黄芪颗粒的质量标准提升 第一部分:黄芪颗粒中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、 芒柄花素的含量测定方法研究贵阳中医学院硕士学位论文 建立了以二极管阵列检测器和蒸发光散射检测器联合检 测,利用测定黄芪颗粒中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪甲 苷、芒柄花素的含量测定方法。在上检测黄芪甲苷的含量,得黄芪甲苷回 归方程为黄蓖甲苷..,.,线性范围为../.。 在上检测毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素等的含量,四 种化合物的回归方程及线性范围分别为毛蕊异黄酮昔. . .,线性范围为..;芒柄花苷..,., 线性范围为.~./;毛蕊异黄酮..,.,线性范围 为../;芒辆花素. 一..,线性范围为 ../。五种化合物回收率均在.%~.%之问。同时用建立 好的含量测定方法对不同批次批黄芪颗粒中五种化合物的含量进行测定,其 中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素的含量分别在 ..驾~,../.驾~,./驾~,.../.屯~, ..‖?’之间。并以批黄芪颗粒中五种化合物的含量为变量,进行 聚类分析。该含量测定方法旨为黄芪颗粒的质量控制提供参考依 据。 第二部分:黄芪颗粒中总黄酮的含量测定方法研究 以芦丁为对照,建立了紫外分光光度法测定黄芪颗粒中总黄酮的 含量测定方 法。实验显示芦丁的回归方程为.?..,线性范围为 .~.‖?~。平均回收率为.%,.%。同时用该方法测定了 不同批次批黄芪颗粒,发现总黄酮的含量在.~. ?。之问。实验表 明,该紫外分光光度法测定黄芪颗粒中总黄酮的含量方法简便, 快捷,准确,可 用做黄芪颗粒的质量控制依据。 【关键词】黄芪颗粒;提取工艺;质量控制;?;.; 贵阳中医学院硕士学位论文 , ,:.一.,,, , ,. , , . , . , 。 , ’ ., . .,’ 【. , , . ’ .,. ; . : : 贵阳中医学院硕士学位论文,. ., ,, , .. :? 、? 、? ?. .., . ‰ 一一??,, ../。, . . ., ., ...。.. . ., ./,.. .., ., , . 一.,., .,.‖, .%. .% .. .. 舶. 一一??,,, .~.‖。‘, ?~,.. ?岔, ..‖?~,.~.?~,.~. . .. 贵阳中医学院硕士学位论文‘ 、历. . 一.,, ., .~.。~. .%. . , ,.;; ; ;; ; 贵阳中医学院硕士学位论文 月舌 中国是一个具有悠久历史的文明古国,应用中药进行治疗、保健、 预防、康 复己有数千年的历史。在数千年的历史进程中,中医药积累和沉 淀了丰富的理论 知识,为中华民族的繁衍生息做出了巨大的贡献,是构成中国传统文化的重要内 容之一。目前我国药用资源种类己达种,其中药用植物种,药用动 物种,药用矿物种【】。中医药是中华民族的瑰宝,古往今来为人类的生 存与健康做出了不可替代的贡献。但中医药基础研究薄弱、制剂工艺和剂型落后、 质量控制不够严密、疗效评估和作用不够明确等问题,严重制约了中药事业的进 一步发展,阻挡了中药走向世界的进程。 国外对中药研究的共同特点在于重视基础研究,特别是提取工艺研究方面, 注重药材提取及浓缩干燥的工艺研究。如:水提取物固液分离工序在实践 中多采用分离能力较好,并可根据生药对象进行调节的离心法进行固液分离。不 同水提取物不同处方方剂经小样测试后制定不同的离心法数据,如生药粒子 的大小、离心速度的快慢、离心力的大小、旋转时间的长短等;提取液浓缩干燥 颗粒剂最为适宜,它比粉剂及湿式粒剂在生产过程中的损失小, 稳定性强,吸潮 率低,崩解度高,易于调剂:制成提取液浓缩粉末的生产技术工艺采用喷雾干燥 法。计算机的引入提高了中药制剂等行业的自动化程度,而且提高了药材利用率。 同时,国外还非常重视中药产品质量,采用薄层鉴别进行产品性状鉴别;采 用色谱、光谱等方法对产品中种或多种药效成分或指标性成分进行含量测 定及指纹图谱或特征图谱的建立。保证产品从原料、中间体以及成品制剂质量稳 定可控、安全有效。 然而,由于我国目前中医药基础研究薄弱,没有建立适合中药特点的质量标 准体系,国家药典及行业标准目前尚不完善。许多中成药指标成分检验标准过于 单一,使企业容易忽视其它指标成分,造成各指标成分问的比例失调,影响中药 制剂的疗效。对质量标准认识的模糊性,直接导致了生产厂家对生产工艺缺乏筛 选优化方面的研究。而工艺的不同极大地影响着产品的质量。例如,大豆提取物 中的有效成分为大豆异黄酮,国际通行标准规定总异黄酮含量为%,主要由大 豆苷、大豆苷元等个成分组成。由于产品在提取过程中原材料的处理和提取工贝阳甲医子阢似士学位论文 艺不同,造成不同厂家产品个功效成分的含量比例明显不同,且溶解性也有差 异。 因此在中医药理论为指导下,融合现代科学技术,对中药制剂进行现代化研 究是中医药工作者迫在眉睫的任务,同时疗效确切的中药制剂水平的提高,有着 重要的经济意义和深远的社会意义。 黄芪颗粒,内科中成药,主要成分是黄芪全成分提取物,棕黄色颗粒,有补 气固表,利尿,托毒排脓,生肌等功效,用于气短心悸,虚脱,自汗,体虚浮肿, 慢性肾炎,久泻,脱肛,疮口久不愈合。黄芪颗粒收载于《中华人民共和国卫生 部药品标准?中药成方制剂第册》,标准编号:...。 该标准中为黄芪颗粒的提取工艺及质量控制方法作了一定的限定,具体情况 如下: 【制法】 取黄芪 ,加水煎煮二次,第一次小时,第二次小时,合并煎液, 滤过,滤液浓缩至相对密度约为.,加乙醇使含乙醇量为%,搅匀,静置, 取上清液回收乙醇,浓缩成相对密度为.?的清膏,加辅料适量,制成 颗粒,低温干燥,制成 ,即得。 【鉴别】 ,浸渍过夜,滤过,取滤液 ,加.%茚三 取本品 ,加水 酮溶液滴,在沸水浴中加热分钟,显紫色。 取本品 ,加甲醇,置水浴上加热回流小时,滤过,滤液置于 经处理的中性氧化铝柱~曰, 上,用%甲醇 ,内径 洗脱,收集洗脱液,置水浴上蒸干,残渣加水 使溶解,用水饱和的正 丁醇提取次,每次 ,合并正丁醇液,用水洗涤次,每次 ,弃去 水液,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇. 使溶解,作为供试品溶液。 另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每 含 的溶液,作为对照品溶液。 照薄层色谱法附录?试验,吸取上述两种溶液各?,分别点于同一硅胶 薄层板上,以氯仿一甲醇一水::的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾 干,喷以%硫酸乙醇溶液,在?烘约 。供试品色谱中,在与对照品 色谱相对应的位置上,显相同的棕褐色斑点。 贵阳中医学院硕士学位论文 该标准在当时的情况下具有一定的先进性和合理性。但是,随着科技的不断 发展,人们健康安全意识不断提高,目前黄芪颗粒的提取技术及质量控制水平已 经不能满足时代发展的需求。特别是该产品仅仅采用薄层鉴别来控制产品质量的 问题,这一关键问题已经阻碍了黄芪颗粒的进一步发展及做大做强。因此,迫切 需要利用现有先进技术,对黄芪颗粒这一名优品种进行提取工艺优化和质量标准 提升研究。在不改变提取工艺本质的情况下,促进工艺合理化,参数可控化,确 保生产出来的产品质量稳定可控,保证该产品疗效,为广大用药患者的康复提供 保障,给社会经济带来巨大的效益。贵阳中医学院硕士学位论文 第一章黄芪颗粒提取工艺优化研究 黄芪颗粒为《中华人民共和国卫生部药品标准?中药成方制剂第册》 收载品种。在该标准中提取工艺为:‘取黄芪 ,加水煎煮二次,第一次 小时,第二次小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度约为.,加乙醇 使含乙醇量为%,搅匀,静置,取上清液回收乙醇,浓缩成相对密度为. ?的清膏,加辅料适量,制成颗粒,低温干燥,制成 ,即得。由此可见, 现有提取工艺中并未对提取过程中的一些影响提取效果的因素做出具体限定,不 利于工业化大生产及其质量的稳定。 《中药新药研究》指出“在研究提取工艺中对提取效果的评价,不宜单 纯用得膏率作为评价指标,因总得膏率的高低并不代表提取效果的优劣”。但是 在提取工艺研究中也还是需要以得膏率作为评价指标之一。它在制剂过程中起到 重要作用,具体如下:?选择剂型的参考指标;?丁艺水平的评价 指标:一般 中药材,尤其来源于植物、动物的药材,其有效成分含量都不高,而水提浸膏收 率很高,主要是提取工艺条件和除杂工艺不够完善所致;?在固体制剂日服量、 单服剂量及包装规格确定的依据:如某处方一日剂量用药材共 ,制成胶囊剂, 其提取物得膏率为%,则日服量为 ,若日服次,每次 ,若装成. ?粒 ’硬胶囊,每次服粒,一日服粒,则包装可为每板粒。所以一般情况, 不论单因素筛选或正交试验,都应将得膏率列入,以防漏测。研究表明黄芪甲苷 可改善心肺功能,加强心脏收缩力,扩张血管,降低血压,改善皮肤血液循环和 营养状况:并能保护肝脏,防止肝糖元减少,对慢性活动性肝炎,有良好作用, 是黄芪及黄芪颗粒中主要有效成分兼指标成分,可用于评价提取效果的优劣。因 此,为进一步确定工艺参数,本研究以提取物中黄芪甲苷的含量和得膏率为指标 优选黄芪颗粒的提取工艺。采用单因素考察及正交试验结合综合 评分法,对其提 取参数进行优化。优选出最佳提取工艺参数,为工业大生产提供条件。本工艺利 用最短的时间,最低的成本,生产出质量稳定的产品,并获得最高的社会经济效 益。 目前检测黄芪甲苷的方法有薄层扫描法、高效液相色谱肿法等,本 试验考虑操作的简便性及数据的稳定性,及结合黄芪甲苷的性质在下为末贵阳中医学院硕士学位论文 端吸收,选择采用?法对提取物中黄芪甲苷的含量进行测定。 仪器与试药 高效液相色谱仪; 一;检测器; 色谱数据工作站:万分之一 硒够检测器; 分析天平;十万分之一.分析天平; , ?以:电 超声仪; 摇摆式高速万能粉碎机 热套;冷凝管;一真空干燥箱:低速多管加自动平衡离心机。 黄芪药材贵州汉方制药有限公司提供;黄芪甲苷对照品批号: ?,贵州迪达生物科技有限公司;医用脱脂棉;色谱纯乙腈 ,;纯净水乐百氏;其余试剂均为分析纯。 工艺流程 图提取工艺流程图.如上图工艺流程所示,取黄芪药材,精密称定,置于装有回流装置的圆底烧 瓶中,加热回流提取,合并提取液,滤过,滤液浓缩,加乙醇使含醇量达到一定 浓度,搅匀,静置,取上清液回收乙醇,浓缩得清膏,即得见图。贵阳中医学院硕士学位论文 工艺考察 原工艺为水提醇沉,包含了水提工艺和醇沉工艺两个独立的工艺,故本试验 将其分开考察。在提取工艺中以黄芪甲苷的含量及得膏率进行综合评分,对影响 提取效果的各因素分别进行单因素考察。水提工艺中主要考察了药材粉碎度、溶 剂用量、提取温度、提取次数、提取时间。在单因素考察的基础上采用正交试验, 考察各因素之间的交互作用,优选出最佳提取工艺。在确定水提工艺的基础上以 黄芪甲苷的含量及得膏率进行综合评分,考察醇沉工艺中相对密度、含醇量、醇 沉时间,最后得出黄芪颗粒的最佳提取工艺。 .水提工艺 ..对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品置 的容量瓶中,加甲醇 配制成每 含. 黄芪甲苷对照品溶液。将制备好的对照品溶液储存在 ?的冰箱中,备用。 ..线性关系的考察 取“..”项下黄芪甲苷对照品溶液,放至室温,精密吸取黄芪甲苷对照品 溶液.、.、.、、/,进样,参照版《中国药典》一部中“黄芪” 项下黄芪甲苷含量测定方法中的色谱条件进行含量测定见图。以对照品峰 面积的自然对数值为纵坐标,以进样量‖的自然对数值为横坐标, 得黄芪甲苷回归方程为黄芪甲苷. 一..线性范围为 .~.‖见图。 九。八”八 。、一‘??????。一 图黄芪甲苷的高效液相色谱图黄芪甲苷对照溶液;供试品溶液.. ;贵阳中医学院硕士学位论文 【 厂、 峰 面 积 一一 一? 互也? 一?? 一?? ~?一? . . . . . 堇 进样量/ 图黄芪甲苷的线性关系图 . ..黄芪甲苷含量、得膏率的测定及综合评分计算 ...黄芪甲苷的含量测定 取黄芪粗粉 ,精密称定,置于装有回流装置的圆底烧瓶中,加水,回流 ,混匀, 提取,提取次,趁热用脱脂棉滤过,合并滤液,滤液定容至 离心 转速 ?。,取上清液作为母液。 蒸馏水转移至分液漏斗中,用水 精密量取/倍母液,挥干溶剂,用 饱和的正丁醇萃取次,每次 。合并正丁醇液,加氨水洗涤次,每次 。正丁醇部分挥干溶剂,加甲醇溶解,转移至 容量瓶中,甲醇定 容, .伽微孔滤膜滤过,得供试品溶液。 精密吸取供试品溶液‖,注入高效液相色谱仪,参照版《中国药 典》一部中“黄芪”项下黄芪甲苷含量测定方法中的色谱条件进行含量测定见 图,记录黄芪甲苷峰面积,并计算含量。 计算公式: ,黄芪甲苷.一. % 黄芪甲苷含量%:兰冬鐾 注:】,黄芪苷为黄芪甲苷峰面积的自然对数 为黄芪甲苷含量的自然对数 称样量代表称样质量 为返回的?次方 ...得膏率测定贵阳中医学院硕士学位论文 精密量取/倍“...”项下所得母液,置已称定重量的干燥蒸发皿中, 挥干溶剂,蒸发皿置减压干燥箱中干燥 至恒重,取出,称重。按照以下公式 计算得膏率。 得膏率%:鳖×?矗 专×.珏鹭鹾置 注:浸膏代表浸膏质量 称样量代表称样质量 ...综合评分 在查阅大量相关文献的基础上,结合制剂工艺要求选定综合评分 系数。公式 如下: 综合评分罴.?;喜;器×。.×,。。 ..粉碎粒度考查 取不同粉碎粒度的黄芪药材 ,精密称定,置于装有回流装置的圆底烧瓶 中,加倍量水,用电热套煎煮次,第一次小时,第二次小时,趁热用 试, 脱脂棉滤过,合并滤液,混匀,滤液定容至 ,离心 转速 取上清液作为母液。按“..”项下方法测定黄芪甲苷含量及得膏 率见表, 并对所得结果进行综合评分及方差分析见图,表。 表粉碎粒度考杏结果 .贵阳中医学院硕士学位论文 . . . 综. 合. 评. 分. 值. . . .。?????????????????????????????????????????。???????????????????????一?? 饮片 粗粉 中粉 细粉 图粉碎粒度的综合评分 . 表粉碎粒度方差分析表 .以黄芪甲苷含量和得膏率的综合评分值为指标比较黄芪饮片、粗粉、中粉、 细粉等种粉碎粒度对提取效果的影响。由综合评分趋势图可见,黄芪细粉的综 合评分值最高,其次是粗粉。且由方差分析表证明,种粉碎粒度存在显著差异。 本研究考虑到工业生产中的可操作性及提取过程中的能耗问题,选择黄芪粗粉作 为本研究的最终粉碎粒度。 ..提取温度考察 取黄芪粗粉 ,精密称定,置于装有回流装置的圆底烧瓶中,加倍的水, 分别在?、?、?、?,煎煮等不同温度下加热回流提取次,第一 次小时,第二次小时,趁热脱脂棉滤过,合并滤液,滤液定容至 , 混匀,离心 转速 ?,取上清液作为母液。按“..”项下方 法测定黄芪甲苷含量及得膏率见表,并对所得结果进行综合评分 及方差分 析见图,表。 贵阳中医学院硕士学位论文 ? 煎煮 图提取温度的综合评分 .表提取温度方差分析表 . 由趋势图可见,随着温度的升高综合评分值先降低后升高,当为 煎煮时综合 评分值明显高于其它个不同温度。经方差分析证明,不同温度下 提取效果存在 显著差异,所以最终选择以煎煮法进行提取。 ..溶剂用量考察 取黄芪粗粉 ,精密称定,置于装有回流装置的圆底烧瓶中,分别加、 、、、倍水,煎煮次,第一次小时,第二次小时,趁热用脱脂 棉滤过,合并滤液,混匀,滤液定容至 ,离心 转速 ?, 取上清液作为母液。按“..”项下方法测定黄芪甲苷含量及得膏率见表,贵阳中医学院硕士学位论文 并对所得结果进行综合评分及方差分析见图,表。 表溶剂用量对提取率的影响 .;霉,。 / 藤/?一 / . 由趋势图可见,随着溶剂用量的增加,综合评分值增加,但当溶剂用量达到 倍之后,综合评分值增加不大,可视为无变化。经方差分析可见不同溶剂用 量对提取效果存在显著差异。因此从节约用水、节约用能、降低成本等方面考虑, 选择用倍水。 ..煎煮时间 取黄芪粗粉 ,精密称定,置于装有回流装置的圆底烧瓶中,加倍量水, 、. 、 、. 、 用电热套煎煮,分别煎煮 。趁热脱脂棉滤过,合并滤 贵阳中医学院硕士学位论文 液,混匀,滤液定容至 ,离心 转速 ?,取上清液作 为母液。按“..”项下方法测定黄芪甲苷含量及得膏率见表,并 对所得 结果进行综合评分及方差分析见图,表。 表煎煮时间对提取率的影响 . 综合评分值 ?%弘:;龉踮泓观?. 图煎煮时间对提取率的影响. 表煎煮时间方差分析表 . 由趋势图可见,在~. 期间,综合评分值随煎煮时间的延长而增大,但 当时间达到 时黄芪甲苷的含量明显降低。经方差分析可见,不同提取时间的 。 提取效率有差异。通过综合评分结果,最终选择煎煮时间为. ..煎煮次数 取黄芪粗粉 ,精密称定,置于装有回流装置的圆底烧瓶中,加倍量水,贵阳中 医学院硕士学位论文 分别用电热套煎煮、、次,每次. ,趁热脱脂棉滤过,合并滤液,混 匀, 滤液定容至 ,离心 转速 ?,取上清液作为母液。按 “..”项下方法测定黄芪甲苷含量及得膏率见表,并对所得结果 进行综 合评分及方差分析见图,表。 表煎煮次数对提取率的影响 .?一王?????????王 一 . 。 工??????一。 . 综. 『 合. 评. 分. 【值. . . 。 . 次 次 次 图煎煮次数的综合评分. 表煎煮次数方差分析表 . 由趋势图可见,当煎煮次数增加时,黄芪甲苷含量和得膏率的综合评分值略 有增加,但不明显。经方差分析可见,提取次数不同,提取效果有差异但不显著。 在综合提取效率及节能等方面的考虑,最终选择煎煮次。 ..正交试验设计及结果 ...因素与水平 通过单因素考察,确定了药材的粉碎粒度,在考察提取温度时,发现煎煮明贵阳中医学院硕士学位论文 显优于其它温度下热回流提取,故提取方式定为煎煮。考虑到各因素之间可能存 在交互作用影响,采用正交试验对溶剂用量、煎煮时间、煎煮次数的水平 参数进行优选。 表 正交试验因素水平表 . 水平 整型旦量垫挝查 夔耋堕阊鱼 夔耋达堑达 窒自 : : . ;型 三 三 ...实验方法 称取黄芪颗粒 ,按正交试验表见表进行试验每号试验平行份。 提取液按“..”项下方法测定黄芪甲苷含量及得膏率,并对所得结果进行综合 评分。 ...正交实验结果分析 由正交试验结果见表及方差分析结果见表可见,煎煮时问与 煎煮次数对综合评分值无显著性差异,而溶剂用量对综合评分值有显著性差异。 从直观分析可看出,综合评分值在溶剂用量,煎煮. ,煎煮三次时最 高。但由于方差分析中煎煮次数对综合评分值无显著性差异,故考虑节能,节省 成本,将煎煮次数改为次。因此最佳提取工艺即为倍水,煎煮两 。 次,第一次.,第二次贵阳中医学院硕士学位论文 .。?表示有明显的显著性表示有显著性 ..水提参数的确定 经以上单因素考察及正交试验,得出最佳水提工艺参数为:黄芪 粗粉 , 精密称定,置于装有回流装置的圆底烧瓶中,加倍量水,煎煮次, 第一次 .小时,第二次小时,合并滤液,即得水提部分。 ..验证实验 按照“..”项下水提条件,并将称样量放大到 ,提取份黄芪粗粉贵阳中医学院硕士学位论文 样品,对优化出来的提取方法进行验证。结果见表在“..”项条 件下, 黄芪粗粉平均得膏率是.%,黄芪甲苷的平均含量是.%。 ‘ 表水提工艺验证实验 . .醇沉工艺 以优化出来的水提工艺条件,提取黄芪粗粉. ,得水提液,浓缩至相对 密度为.的浸膏。将浸膏贮存在?冰箱中,备用。 ..相对密度的考察 取水提浸膏. 的离心管中,分别加蒸馏水稀释至相对密度为 ,置 ..、..、..、.~.、.~.,加%乙醇使含醇量 为%,搅匀,静置 ,取上清液,挥至无醇味,加水定容到 ,得母 液。分别参考“..”项下方法检测黄芪甲苷的含量及得膏率见表,并对 所得结果进行综合评分及方差分析见图,表。贵阳中医学院硕士学位论文 . . . 综. 合. 评. 分. 值. . . 图相对密度的综合评分 。 表相对密度方差分析表 .由趋势图可见,当初浸膏的相对密度在.~.时综合评分值最高,且经 方差分析显示,不同相对密度对醇沉工艺影响存在显著差异。故将醇沉前初膏的 相对密度定为.~.。 ..含醇量 取水提浸膏. 的离心管中,分别加蒸馏水稀释至相对密度为 ,置 .~.,缓慢加入%乙醇使含醇量分别为%、%、%、%、%, 搅匀,静置 ,取上清液,挥至无醇味,加水定容到 ,得母液。分别参 照“..”项下方法检测得膏率及黄芪甲苷的含量见表,并对所得 结果进贵阳中医学院硕士学位论文 行综合评分及方差分析见图,表。 表含醇量对提取率的影响 . 一 百蠹圳 图含醇量的综合评分. 表含醇量方差分析表 . 观察趋势图及方差分析结果,发现不同含醇量对提取工艺的影响 存在显著差 异,随着含醇量增加,综合评分值增大。当含醇量达到%时综合评 分值最高, 再增加含醇量,影响不大,故从节约溶剂用量既节约成本方面考 虑,将含醇量最 终定为%。 ..醇沉时间 取水提浸膏. 的离心管中,分别加蒸馏水稀释至相对密度为 ,置 、 、 、 、 .~.,加%乙醇使含醇量为%,搅匀,分别静置贵阳中医学院硕士学 位论文 ,取上清液,挥至无醇味,加水定容到 ,得母液。分别参考“..” 项下方法检测得膏率及黄芪甲苷的含量见表,并对所得结果进行 综合评分 及方差分析见图,表。 表醇沉时间对提取率的影响 .. 一 一 一 综 一 评 ~ 分 值 一 ?盯%?虬?盯 图醇沉时间的综合评分 . 表醇沉时间方差分析表 . 趋势图上可见,随着醇沉时间增长,综合评分值先增加,后降低。 并且经 方差分析结果可见,不同醇沉时间对综合评分值的影响存在显著 差异。因此结合 。 工业生产,从节约时间方面考虑,醇沉时间定为 ..醇沉参数的确定 经以上单因素考察结合综合评分法,得出最佳醇沉工艺参数为: 取水提浸膏 贵阳中医学院硕士学位论文 . 的离心管中,分别加蒸馏水稀释至相应的相对密度为.~., ,置 加%乙醇使含醇量为%,搅匀,静置 取上清液,挥干溶剂得清膏。.. 验证实验 按照“..”项下醇沉条件,并将称样量放大到 ,分别纯化份水提 浸膏,对该纯化方法验证。 表醇沉工艺的验证实验 .由上表可见在“..”项醇沉条件下,纯化黄芪水提物,结果显示平均得膏 率是.%,黄芪甲苷平均含量是.%见表。 小结与讨论 .小结 在不改变原工艺的基础上,以黄芪甲苷含量及得膏率的综合评分值为指标, 通过单因素考察及正交试验对工艺中的参数进行优化,并验证。采用优化出来的 最佳提取工艺提取,所得清膏中黄芪甲苷的含量高达.%。最终确定黄芪颗 粒的最佳提取工艺为: 黄芪粗粉,加倍量水,煎煮次,第一次.小时,第二次小时,合 并滤液,滤液浓缩至相对密度为.~.?,加%乙醇使含乙醇量为 %,搅匀,静置 ,取上清液,浓缩得清膏。贵阳中医学院硕士学位论文 .讨论 本章节对原提取工艺参数进行了优化,对于其中一些不确定因素进行了考 察,对参数作了进一步的确定,优选出其最佳工艺参数。 .. 与的区别 在考察提取工艺之前应选定检测方法,现有色谱检测器两种:及 。为浓度型检测器,用于紫外有吸收的化合物的分析,有着精密度、 重现性、稳定性好等优势。但黄芪甲苷在检测器中为末端吸收,干扰大, 基线漂移严重,不便于含量测定。是一种新型的质量型检测器,在用于无 紫外吸收的化合物的分析中具有相当的优势。其检测原理是把从色谱柱分离的组 分雾化为小颗粒,在其穿过光束时导致光散射而被检测。故的响应不依赖 样品的化学性质,任何挥发性低于流动相的样品均能被检测,且响应因子一致。 用钡定不仅灵敏度得到很大提高,而且应用梯度洗脱时基线平稳。本实验 考虑到黄芪甲苷为皂苷类成分,采用来进行含量测定。 ..粉碎粒度 从理论上说,药材粉碎得越细,与提取溶剂的接触面积越大,提取效果越好。 但粉碎得过细的植物药材粉末不适宜提取,因为:?过细的粉末在提取时虽能提 高提取效果,但吸附作用也增加。?粉碎过细,药材组织中大量细胞破裂,致使 细胞内大量不溶物及较多的树脂、粘液质等无效成分溶出,使溶出杂质增加,粘 度增大,使得滤过困难,产品混浊。?过细的粉术,给粉碎操作带来困难。通过 本实验证明不同的粉碎粒度对提取效果影响差异较大,且在实验中发现提取效果 依次为细粉粗粉饮片中粉,综合考虑选择粗粉作为最终粉碎粒度。 ..溶剂用量 溶剂用量直接影响药液的质量。药多水少,会造成“煮不透,煎不尽”。有 效成分提取不完全,稍一蒸发药汁即干涸,药物有效成分可因局部高热而被破坏; 药少水多,虽然增加有效成分的溶出量,但药液量也增大,不利于后期制备,且 加水量大时,煎煮时耗能也会增多。本实验发现随着溶剂用量的 加大,提取效果 增强,但当达到倍用量之后几乎不变。所以最终溶剂用量定为倍。 ..煎煮时问及次数 煎煮过程中发现煎煮 时黄芪甲苷的含量较. 低。考虑黄芪甲苷的量贵阳中医学院硕士学位论文 对综合评分贡献较大,推测可能是长时间加热使黄芪甲苷水解,使检测到的黄芪 甲苷含量降低,因此,选择煎煮. 。由于第一次煎煮,已经将黄芪药材中的 化学成分基本提取完全,因此煎煮时间最终定为:第一次. ,第二次 。较 原始工艺缩短了. 的煎煮时间,这在工业生产上极大的节约了能源和生产成 本。 ..醇沉前相对密度 醇沉前相对密度对醇沉过程中各化合物的含量影响相对较大。如果醇沉前的 相对密度较大,达到一定醇沉时需要的乙醇量较少,但是醇沉时有效成分会包裹 在沉淀内,损失较大。另外,提取液的浓度较大,黏度较大,也会影响醇沉效果: 如果醇沉前的相对密度较小,醇沉效果好,有效成分损失较少,但 是需要的乙醇 量较大,乙醇回收和再利用困难,生产成本相应增加。故本实验对醇沉前相对密 度进行考察,在原工艺的基础上进一步优化参数。最后将原工艺中相对密度约 .优化为相对密度为.~.,更加便于工业生产中的控制。 . ..乙醇浓度 在中药生产过程中,乙醇沉淀法是常用于中药水提取液的纯化精制方法。醇 沉液中含醇量的高低与药物有效成分的溶解有着密切的关系,通常当含醇量为 ~%时可除去淀粉等杂质:含醇量达%时,无机盐开始沉淀;含醇量达 %以上时,可除去蛋白质等杂质,当含醇量达%时,几乎可除去全部淀粉、 多糖、蛋白质、无机盐类杂质。本研究以黄芪甲苷的含量及得膏率为指标评价醇 沉效果。最终发现随着乙醇浓度的增加,醇沉效果增强,但当乙醇浓度达到% 时,增加趋势减缓直至不再增加。因此从醇沉完全及节约成本方面考虑,本文乙 醇浓度最终定为%。 研究中考虑最终乙醇浓度为%,故选用%的乙醇进行醇沉。此时所耗 乙醇体积较少,回收蒸馏要较容易,乙醇消耗和能源消耗亦低,因此本文选用 %的乙醇来进行醇沉。 ..醇沉时间 醇沉时间与醇沉效果有密切关系,一般醇沉时间越长,沉淀物析出越多,但 醇沉时问过长会导致指标性化合物减少可能被沉淀包裹。本实验在考察醇沉时间 的时候发现,当醇沉 时,杂质基本沉淀,再增加醇沉时间,指标性成分的贵阳中医学院硕士学位论文 含量反而减少。因此最终醇沉时间定为 。 ..实验中遇到的困难 在优化该工艺的过程中遇到不少困难,其中黄芪中主要化学成分为黄酮类, 皂苷类‘以及多糖类。而黄芪中的皂苷类以及多糖类,使得提取过程中操作难度 加大。首先,由于皂苷类成分的存在使得水溶液的表面张力降低,在煎煮过程中 容易产生泡沫,易导致样品随泡沫喷出。作者采用前期用高温加热,待到样品基 本浮于液面上时,将电热套调至低温,用余热使溶液沸腾,有时沸腾的太过厉害, 则需把圆底烧瓶拿出冷却一段时问,待到不沸或是稍沸的时候再将其放入,继续 加热,使溶液保持微沸状态。其次,由于以水作为提取溶剂,并且通过煎煮,提 取温度较高,而多糖在水中的溶解度很大,导致提取液中多糖的含量太多,使得 水的粘度增加,从而增大了滤过难度。实验过程中,作者分别比较常压滤过,抽 滤,脱脂棉滤过等方式。结果常压滤过时基本行不通。后改用抽滤,基本可以滤 过提取液。但在操作过程中需更换张滤纸,这样不仅样品损失量大,使测定 结果不准确,且操作起来比较复杂,并且浪费材料。此后,考察了用脱脂棉粗滤, 粗滤液再离心,发现能基本解决滤过难的问题。 此外,版《中国药典》附录中对相对密度的测定有规定,液体药 品的相对密度用比重瓶来测定,但由于本实验提取的量较少,用比重瓶测定并不 方便。考虑到相对密度的计算公式: 帑寝 确一等 格液 表示溶液的质量 注:相对密度表示溶液的相对密度 表示水的密度 溶液表示溶液的体积水 本实验将常温下水的密度视为一个不变的值术。此时相对密度计 算公式 可改为: ‰度等 由此公式可见,可通过改变溶液质量和体积比值来调节溶液的相 对密度。这 样可以简化操作,并且降低了成本。厘 莒 器 二 蟪 墨 链 怯 一 寸 划 口 黼 一 一 靛 罂 蜜 二 工 一 《 懿 拣 籁 抵 憨 上 趔 工 叼厦 《 ? 茁 框 馨丑桐警裂惶柱暮 梃 拣 拣 壶至。卫;譬.甍。勺臀?暑三誉亘 摧 仪秘迥扑.千器堡扑盥导墨根 皿唧 己 器 逛 震 詈 暑葛。一苗 ? 缝 恃 一 .时卜 划 黧 器 蛩 墨 鑫 鑫 悻 彝 焖 :罄 三 鼍 釜 裂 贵阳中医学院硕士学位论文 第二章黄芪颗粒的质量标准提升 第一部分测定黄芪颗粒中五种化合物的含量方法研究 黄芪颗粒是由黄芪全成分提取物为主要成分的内科中成药。现收载于《中华 人民共和国卫生部药品标准?中药成方制剂第册》年,第页,标 准编号:...?。作为中药成方制剂,保证其质量的稳定和可控是非 常重要的。而在《中华人民共和国卫生部药品标准?中药成方制剂第册》 中黄芪颗粒在质量控制方面,仅采用薄层色谱法对黄芪甲苷进行定性鉴别试验, 该鉴别方法操作复杂,可重复性差,并且没有对黄芪甲苷的含量进行测定。随着 社会的发展,科学技术的进步,仅以薄层色谱作为质量控制已远远达不到人们的 需求。所以为了确保不同批次黄芪颗粒质量的稳定、可控,建立新的质量标准迫 在眉睫。黄芪中含有多种化学成分,如皂苷类、黄酮类、木脂素类、氨基酸类、 多糖类及多种微量元素等【。皂苷类和黄酮类是黄芪的主要活性 成分,据报道黄 芪皂苷具有抗氧化,增强免疫等作用,另也有药理研究表明黄芪中黄酮类成分能 抗氧化【抗肿瘤,抗辐射‘等。通过离体大鼠主动脉实验发现毛蕊异黄酮具有 改善血管弹性的作用。故本章结合黄芪颗粒中化学成分及其可能的有效物质, 以联合为检测器,建立了黄芪颗粒中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊 异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素等五种化合物的含量测定方法,并测定了不 同批次批黄芪颗粒中五种化合物的含量,并对含量测定结果进行聚类分析。 仪器与试药 一 百高效液相色谱仪; 检测器; 检测器;色谱数据工作站;万分之一 分析天平;十万分之一?分析天平: , ?。, 超声仪; 摇摆式高速万能粉碎机 .真空干燥箱。 黄芪甲苷对照品批号:?,贵州迪达生物科技有限公司、毛蕊 异黄酮苷对照品批号:..,成都瑞芬思生物科技有限公司、毛蕊 异黄酮对照品批号:.?,成都瑞芬思生物科技有限公司、芒柄花 贵阳中医学院硕士学位论文 苷对照品批号:一.,成都瑞芬思生物科技有限公司、芒柄花素对 照品批号:一?,成都瑞芬思生物科技有限公司见图。 图五种化合物的结构图 毛蕊异黄酮苷;芒柄花苷;毛蕊异黄酮;黄芪甲苷;芒柄花素 . . ; ; 节; ; 黄芪颗粒贵州汉方制药有限公司提供,批号分别为.、.、 .、.、.、.、.、.、 .、.、.、.、.、.、 .、.、.、.、.、.、 .、.、.、.、.、.、 .、.、.、.。 色谱纯乙腈 ,;纯净水乐百氏:其余试剂均为分 析纯。 贵阳中医学院硕士学位论文 方法与结果 .对照品溶液的制各 分别精密称取减压干燥至恒重的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄 芪甲苷、芒柄花素对照品于 的容量瓶中,加甲醇分别配制成每 含 . 毛蕊异黄酮苷、. 芒柄花苷、. 毛蕊异黄酮、. 黄芪甲苷、. 芒柄花素的对照品溶液。其中毛蕊异黄酮对照品溶液再稀释 倍配成每 含. 毛蕊异黄酮的对照品溶液,芒柄花素对照品再稀 释倍配成每 含. 芒柄花素的对照品溶液。将配制好的对照品溶 液储存在?的冰箱中,备用。 .供试品溶液的制备 黄芪颗粒粉碎过筛目,精密称取黄芪颗粒粉末. ,置?溶量 瓶中,加%甲醇溶解,超声 ,冷却,加甲醇至刻度线,滤过,取续滤液, 过./微孔滤膜滤过,得供试品溶液。将配制好的供试品溶液储存在? 的冰箱中,备用。 .色谱条件 色谱柱: 柱/×.× ;流动相:乙腈一水 梯度洗脱条件见表;流速: ?~;柱温:?;检测波长: ;漂移管温度:?;氮气压力:. 。混合对照、样品、空白对照 的高效液相色谱图见图。 表梯度洗脱条件. .;:』二;‘兰 ?????一??。??????????。“?一一 一 里 ”口?目???? ?:百?神耳’, 懈 九 : 。 蛳 : :;:二二:二二::::?:; .:.:;::;:;:::::: 卜??。日日口?口口靠??日”?‰ 广??????????????????????????。 耳?????一。一~?? ? ” “ :::::::::;:;::;::;::;::;::;::;:;::;:::::;::;::;:::::::: ::;::;::;::;::一 。。 图五种化合物的高效液相色谱图 混合对照在检测器中,,,号化合物的色谱图;混合对照在检测 器中号化合物的色谱图;样品. 在检测器中,,,号化合物 的色谱图:样品在检测器中号化合物的色谱图;空白对照检测器 中色 谱图;空白对照检测器中色谱图 毛蕊异黄酮苷; 芒柄花苷; 毛蕊异黄酮;黄芪甲苷; 芒柄花素 . ..,,, ; . . ; .; . .. . ; ; 一?印; ; ; 贵阳中医学院硕士学位论文 .供试品溶液的测定 精密吸取供试品溶液肚注入高效液相色谱仪,在“.”项下方法测 定, 并以外标两点法计算黄芪颗粒中五种化合物的含量。 .方法学考察 ..线性关系 取“.”项下对照品储备液,放至室温,分别精密吸取毛蕊异黄酮苷、毛 蕊异黄酮、芒柄花苷、黄芪甲苷、芒柄花素对照品,利用仪器设置混合进样程序, 分别精密吸取各对照品溶液.、.、.、.、.,混合次后进样,进样 量分别为.、.、.、、/,按照“.”项下方法测定。在检测 器上测定黄芪甲苷的含量,以对照品峰面积的自然对数值为纵坐标,,以进样 量的自然对数值为横坐标,得黄芪甲苷回归方程为黄芪甲苷. ..线性范围为.~. 。在检测器上测定毛蕊 异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素等含量,以对照品峰面积为纵坐标 】,,以进样量为横坐标,得毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、 芒柄花素回归方程分别为毛蕊异黄酮苷..,.,线性范围为 ..,.,线性范围为 .~./;芒柄花苷. .~.;毛蕊异黄甯..,.,线性范围为 一..,线性范围为 ../;芒柄花素. ..‖见图。 峰面积 图五种化合物线性关系 .