中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响（可编辑）

中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响（可编辑） 中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响 ? 世界华人消化杂志 2007年10月28日; 1530: 3159-3162wcjd@wjgnet ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R BASIC RESEARCH 基础研究 中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响 宋晓冬刘孟安孙丰润刘颖张丽霞牛新华闫苗苗王晓江 宋晓冬张丽霞牛新华闫苗苗王晓江 滨州医学院基础 ? RESULTS: After exposure to Weichangshu for 背景资料 学院山东省滨州市 胃肠运动障碍型 24 hours, the change in ATP content was more 刘孟安孙丰润刘颖 滨州医学院临床学院山东省滨州市 疾病是临床多发 significant P 0.05 and the intensity of R-123 病 , 其主要病理 宋晓冬复旦大学硕士副教授主要从事中药机制研究 fluorescence in gastrointestinal smooth muscle 生理基础为胃排 国家自然科学基金资助项目 空延迟及小肠传 cells was significantly increased compared with 通讯作者 宋晓冬山东省滨州市滨州医学院基础学 输功能障碍 , 现 院 those in the control and cisapride groups. As the 临床最常用的促 电话 Weichangshu concentration increased, so did 胃肠动力药促进 收稿日期修回日期 the content of ATP and mitochondrial potential胃肠蠕动虽然有 较好疗效 , 但其 副作用如药理作 CONCLUSION: Weichangshu may change the Effect of traditional Chinese 用受限、催乳素 kinetic energy of gastrointestinal smooth muscle 增加、焦虑、激 medicine Weichangshu on ATP cells, leading to an improvement in gastrointes- 动 、运动性不 in gastrointestinal smooth 安、共济失调、 tinal motilitymuscle cells 腹泻和腹痛等不 可忽视. 目前胃肠 Key Words: Traditional Chinese medicine; 运动障碍型疾病 Xiao-Dong Song, Meng-An Liu, Feng-Run Sun, Weichangshu; ATP; Mitochondrial potential; 由于发病机制尚 Ying Liu, Li-Xia Zhang, Xin-Hua Niu, Miao-Miao Yan, Celltiter-GloTM method; Rhodamine fluorescence 不清楚, 其药物的 Xiao-Jiang Wang technique 研发受到限制, 因 此研究该类疾病 Xiao-Dong Song, Li-Xia Zhang, Xin-Hua Niu, Miao-Miao 的调控机制, 为 开 Song XD, Liu MA, Sun FR, Liu Y, Zhang LX, Niu XH, the Basic School of Binzhou Med- Yan, Xiao-Jiang Wang, 发新药提供科学 Yan MM, Wang XJ. Effect of traditional Chinese medicine ical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China 的数据是非常重 Weichangshu on ATP in gastrointestinal smooth muscle Meng-An Liu, Feng-Run Sun, Ying Liu, Clinical School 要的. cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 1530: 3159-3162 of Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30672680 摘要 Xiao-Dong Song, Department of Correspondence to: 目的: 研究胃肠舒对胃肠平滑肌细胞动能的 Biology, Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shan- dong Province, China. songxd71@//0>. 影响. 2007-05-29 2007-09-29 Received: Revised: : 胃肠平滑肌细胞离体培养, 分为5组: 空白对照组、西沙必利组0.51 g/L、胃肠 Abstract 舒?组25 g/L、胃肠舒?组50 g/L、胃 AIM: To study the effect of Weichangshu on the 肠舒?组75 g/L, 采用Celltiter-GloTM法和 kinetic energy of gastrointestinal smooth muscle Rhodamine fluorescence法分别胃肠舒对 cells胃肠平滑肌细胞ATP和线粒体跨膜电位的的 METHODS: Gastrointestinal smooth muscle 影响 cells were divided into five groups: control, cultured in normal medium; cisapride, cultured 结果: 胃肠舒作用24 h后与对照组和西沙必利 in normal medium with 0.51 g/L cisapride; 组相比能显著增高平滑肌细胞ATP的含量. 随 Weichangshu ?, cultured in normal medium 着胃肠舒用药浓度的增加改变ATP的含量也 with 25 g/L Weichangshu; Weichangshu 加大P 0.05. 流式细胞仪结果明, 胃肠舒 ?, cultured in normal medium with 50 g/L 明显加大了胃肠平滑肌细胞的线粒体跨膜电 Weichangshu; and Weichangshu ?, cultured 位, 并且随着胃肠舒用药浓度的增加, 跨膜电 in normal medium with 75 g/L Weichangshu位的增加也越大. Celltiter-Glo was used to detect ATP. The rela- tive changes in mitochondrial potential were 结论: 胃肠舒可能通过改变胃肠平滑肌细胞 tested with the rhodamine fluorescence R-123 technique的动能促进胃肠运动. //.3160 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志年月日第卷第 期 ? 创新盘点 关键词中药胃肠舒线粒体跨膜电位 2-3次. 将盛有组织碎片的容器置于冰上, 去除 本文的前期预实 法法 残留的上清液, 加入2.5 g/L胰蛋白酶, 在4?孵 验结果显示胃肠 运动障碍型疾病 育6-18 h. 移弃组织碎片中的胰蛋白酶, 在37? 模型鼠与正常鼠 宋晓冬刘孟安孙丰润刘颖张丽霞牛新华闫苗苗王晓江 孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20-30 min比较其平滑肌细 中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞生成的影响 世界华人消化 胞跨膜电位和 待小块组织完全消化溶解后, 过200目网, 1000 杂志 ATP有明显的变 ////. r/min离心7 min. 弃上清液, 向细胞沉淀中加入新 化, Ach的表达也 相应发生变化 , 鲜配制的200 mL/L胎牛血清DMEM培养液, 轻 在大量前期预实 4 轻吹打, 后按每瓶25 mL3×10 活细胞接种在 验的结果上推测 0 引言 2 + C a 信号传导途 培养瓶里, 放入37?孵箱里静置培养待测, CK× 胃肠运动障碍型疾病是临床常见病, 据国内统 径在其中可能起 到很重要的调控 41倒置相差显微镜观察. 将处理好的盖玻片, 放 计约占胃肠专科门诊患者1/3以上, 西方国家患 2+ 作用, 而对于Ca 入6孔板使之与孔底贴和紧密, 进行细胞培养信号传导途径在 病率高达 20%-40%. 现临床最常用的促胃肠动 胃肠运动障碍型 细胞生长5 d后吸去培养液, 先用PBS洗涤已贴 力药有胃复安、吗丁啉、西沙必利等化学药疾病中的作用及 壁盖玻片2-3次. 950 mL/L乙醇室温固定20 min, 其调控国内外尚 化学药促进胃肠蠕动虽然有较好疗效, 但其副 未见相关报道, 本 PBS洗2-3次. 1 mL/L TritonX-100室温孵育20-30 作用如药理作用受限、催乳素增加、焦虑、激 项目的完成将填 min增强细胞通透性. 正常羊血清于37?封闭 补胃肠运动障碍 动、运动性不安、共济失调、腹泻、腹痛等不 2 + 型疾病中 C a 信 [1-2] 20 min. 滴加一抗兔抗鼠α-actin mAb1?200, 购 可忽视 , 且易于复发. 而中药制剂具有治疗与 号传导途径的调 自Sigma公司室温过夜, 滴加二抗羊抗兔FITC- 控作用的研究空 调理双层作用, 受到广大胃病患者的欢迎. 但目 白. IgG1?100, 37?孵育2 h, 倒置荧光显微镜波 前国内外有关中药胃肠动力药的研究少见报道, [3] 长500 nm观察. 因此开发中药治疗该类疾病具有重要意义纯 1.2 方法 实验分为5组, 分别为空白对照组、胃 中药制剂胃肠舒是根据《伤寒论》大承气汤、 肠舒小剂量组?组25 g/L、胃肠舒中剂量组 小承气汤、调胃承气汤三方化裁, 取大黄、枳 ?组50 g/L、胃肠舒大剂量组?组75 g/L、 壳、甘草组方, 经临床反复药物筛选研制而成, [4-7] 西沙必利组0.51 g/L. 每组6个复孔, 各组药物 具有完全知识产权. 预实验 显示, 胃肠舒对胃 TM 作用24 h, Celltiter-Glo 试剂盒A液和B液混 轻瘫综合征的疗效优于吗丁啉, 对小鼠子宫切 合, 室温下静置1 h. 向96孔板的各孔细胞中每 除术后肠道推进作用优于西沙必利, 能显著加 TM 孔加入100 L Celltiter-Glo 混合液, 5 min后 μ 快小鼠胃肠推进运动, 兴奋兔离体肠平滑肌, 并 酶标仪波长562 nm检测胃肠平滑肌细胞ATP含 且无明显副作用, 比单味中药更切合临床实际, 量. 另将待测胃肠平滑肌细胞离心1000 r/min收 比汤剂更方便. 因此我们在离体胃肠平滑肌细 集, PBS清洗2次, 加入1 mL的终浓度为1 mg/L 胞模型上进一步探讨胃肠舒的促胃肠动力的作 的Rhodamine123, 放入37?孵箱里静置培养45 用及其机制. min. PBS清洗2次, 倾去原有液体, 250 L PBS重 μ 1 材料和方法 悬, 缓慢加入-20?乙醇750 μL, 流式细胞仪激发 1.1 材料 胃肠舒由滨州医学院附属医院制剂 波长488 nm、发射波长525 nm检测胃肠平滑肌 室提供, 西沙必利浙江京新药业股份有限公 细胞线粒体跨膜电位司生产, S D大白鼠由烟台绿叶实验动物 统计学处理 组间比较用方差检验, P 0.05 为差异有统计学意义 中心提供, DMEM培养基购自GiBco公司, 胎 牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司, TM Rhodamine123购自Sigma公司, CellTiter-Glo 2 结果 试剂盒购自Promega公司, Labsystems Multiskan 倒置显微镜下观察可见细胞形状椭圆形, 束状 MS酶标仪和HERA CO 培养箱及CK×41倒置显 排列, 密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状. 峰 2 微镜购自Olympus, EPICS XL流式细胞仪购自美 处为多层细胞, 谷处为单层或双层细胞, 培养4 d 国贝克曼库尔特公司, IX71荧光倒置显微镜购 后细胞铺满培养瓶瓶底. 为确定胃肠平滑肌细 自日本奥雷帕斯公司胞离体分离培养成功, 用兔抗鼠 α-actin mAb进 选择标准SD大白鼠, 体质量为180-200 g, 雌 行鉴定, 细胞经漂洗后置于荧光显微镜下观察雄各半, 乙醚麻醉, 剖腹后迅速剪取胃体、空肠 负载了FITC的细胞经500 nm的波长激发下产生 组织, PBS清洗后剪碎, 去除上清液, 重复清洗 荧光, 可见95%以上的细胞显示阳性荧光标记, //.宋晓冬等中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞生成的影响 3161 18 图 1 胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞ATP的影响 ? 应用要点 肠平滑肌细胞 本文拟以乙酰胆 16 胃平滑肌细胞 碱和一氧化氮为 主要研究出发点, 14 建立胃肠功能障 12 碍动物实验模型 和细胞实验模型, 10 深入研究胃肠舒 8 片的作用及其作 用机制, 为胃肠舒 6 片的推广应用奠 定坚实的实验理 4 论基础, 提供科学 2 的实验数据. 0 对照组西沙比利胃肠舒?胃肠舒?胃肠舒? A A' B B' 1024 1024 1024 1024 Gm: 1.90 Gm: 1.76 Gm: 1.52 Gm: 2.08 CV: 133.33 CV: 131.94 CV: 144.99 CV: 125.67 [0-1023]190 278100.0% [0-1023]197 015100.0% [0-1023]202 947100.0% [0-1023]158 906100.0% 0 0 0 0 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 RH123 RH123 RH123 RH123 C C' D D' 1024 1024 1024 1024 Gm: 2.26 Gm: 2.48 Gm: 2.71 Gm: 3.14 CV: 129.46 CV: 120.71 CV: 124.94 CV: 117.41 [0-1023]152 768100.0% [0-1023]179 366100.0% [0-1023]211 420100.0% [0-1023]190 278100.0% 0 0 0 0 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 RH123 RH123 RH123 RH123 E E' 1024 1024 Gm: 3.58 Gm: 2.67 CV: 120.66 CV: 129.93 [0-1023]245 520100.0% [0-1023]114 576100.0% 0 0 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 RH123 RH123 图 2 胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响. 胃空白对照组肠 空白对照组胃西沙必利组肠西 沙必利组胃胃肠舒?组肠胃肠舒?组胃胃肠舒?组肠胃肠舒?组胃胃肠舒 ?组肠胃肠舒?组 说明离体培养的平滑肌细胞成功. 验组明显比空白对照组增大线粒体的跨 膜电位, 2.1 胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP的影响 胃肠 比西沙必利组改变线粒体跨膜电位的幅度也大, 舒片作用24 h后能显著增高平滑肌细胞ATP的 并且随着胃肠舒用药浓度的增加, 胃肠平滑肌 含量. 随着胃肠舒用药浓度的增加改变ATP的含 细胞线粒体跨膜电位随之增加图2. 量也加大, ATP的改变量与正常对照组和西沙比 利组进行t检验P 0.05图1. 3 讨论 2.2 胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电 从中医学观点看, 胃肠运动障碍型疾病多由于 位的影响 胃肠舒组细胞荧光图与对照组 脾胃功能失调, 升降失司, 气机不畅所致. 治疗 相比右移, 表示线粒体跨膜电位上升. 胃肠舒实 重在调理脾胃功能, 协调升降, 舒畅气机. 本研 //. Counts Counts Counts 水平 μ蛋白 Counts Counts Counts Counts Counts Counts Counts