米非司酮对孕7～9周人胎盘绒毛核因子-κB及环加氧酶的影响

米非司酮对孕7～9周人胎盘绒毛核因子-κB及环加氧酶的影响 米非司酮对孕7,9周人胎盘绒毛核因子-κ B及环加氧酶的影响 manendometrialandovariancycles.EurBiol,2003,111(2):109— 121. 4ChakrabortiS,MandalM,DasS,eta1.Regulationofmatrixmetallo? pmteinases:alloverview.MolCellBiochem,2003,253(1—2):269— 285. 5傅晓敏,黄丽丽.药物流产后子宫异常出血的机理及非手术疗法的 研究进展.中华妇产科杂志,2006,41(5):359—360. 6TrundleyA,MoffettA.Humanuterineleukocytesandpregnancy.Tis? sueAntigens,2004,63(1):1—12. 7Do~ouC,GiudiceLC.Naturalkillercellsinpregnancyandrecurrent 中国生育学杂志2010年第7期总第178期 pregnancyloss:endocrineandimmunologicperspectives.EndoerRev, 2005,26(1):44—62. 8Szekeres—BarthoJ,ParG,DombayGY.Theantiabortiveeffectof progesterone—-inducedblockingfactorinmiceismanifestedbymodula- tingNKactivity.CellImmunoI,1997,177(1):194—199. 9HeringtonJL.BanyBM.Effectoftheconceptusonuterinenaturalkil- lercellnumbersandfunctioninthemouseuterusduringdecidualiza- tion.BiolReprod,2007,76(4):579—588. [责任编辑:董琳] 米非司酮对孕7,9周人胎盘绒毛 核因子一KB及环加氧酶的影响 唐薇王自能黄健玲赵影庭 摘要目的:观察米非司酮对妊娠7—9周人胎盘绒毛中核因子(NF)一zB及环加氧 酶COX表达的影响,探讨其药 物流产机理.方法:采用免疫组化法NF—KB,COX一1及COX一2在米非司 酮药物流产组与负压吸宫对照组(均 孕7—9周各12例)胎盘绒毛中的表达.结果:NF—KB和COX一2在药物流产组 滋养细胞中阳性表达均较对照组强 (均P<0.01);COX一1在两组表达无明显差别(P>0.05).结论:米非司酮用于人 孕7,9周药物流产时,可通过激 活核转录因子NF—KB使COX一2表达增多,进而可能通过影响前列腺素的合成 等作用产生不利于妊娠的结果. 关键词米非司酮胎盘绒毛核因子一KB环加氧酶 doi:10.3969/j.issn.1004—8189.2010.07. Effectofmifepristoneonexpressionofnuclearfactor--gBandeyclooxygenaseinplacentalvilliofwomenwith7—-9 weeksgestationWei,WangZineng,HuangJianling,eta1.DepartmentofGynecology,GuangdongProvinceHospital ofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120 AbstractObjective:Toexplorethemechanismofmedicalabortionwithmifepristonebyobservingtheeffectofmifepristone ontheexpressionofnuclearfactorkappaB(NF— KB)andcyclooxygenase(cox)intheplacentalvilliofwomenwith7—9 weeksgestation.Methods:AimmunohistochemicalanalysiswasusedforevaluatingtheexpressionsofNF—KB,COX一1and COX一2intheplacentalviHiofthewomenwith7— 9weeksgestationseekingformedicalabortion(medicalabortiongroup, n=12)andvacuumaspirationabortion(vacuumaspirationabortiongroup,n=12).Results:Inthemedicalabortiongroup, theexpressionsofNF—KBandCOX一 2introphoblastweresignificantlyhigher(P<0.O1).TheexpressionofCOX一1was nostatisticallysignificantdifferencebetweenthetwogroups(P>0.05).Conclusion:Whenusedforterminationofearly pregnancyin7—9weeksgestation,mffepristonecanincreasetheexpressionofNF— KBandCOX一2inplacentalvilli,resul? tingintheunfavorableeffectsonmaintenanceofpregnancybyincreasingtheprostaglandinss ynthesis. Keywords:Mifepristone;Placentalvffii;NuclearfactorkappaB;Cyclooxygenase 米非司酮配伍米索前列醇终止早期妊娠具有显着的临床 效果,成为很多医院终止早期妊娠的首选方法,其优点在于避 免手术的并发症,有较高的流产成功率,即使药物流产失败后 也可再行清官术,手术容易进行且减少创伤机会.但米非 司酮的合理用药剂量,时间及给药途径仍在探索之中.本研 收稿日期:2009—12—26 修回日期:2010—03—24 作者:唐薇广东省中医院(广州,510120) 王自能暨南大学 黄健玲广东省中医院 赵影庭广东省佛山市妇幼保健院 ? 408? 究从核因子一KB(NF—KB)和环氧合酶(COX)两方面对米非 司酮在药物流产中的作用机理进行探讨,为米非司酮合理应 用于临床提供依据. 对象与方法 一 ,试剂与仪器 兔抗人/鼠NF—zB/P65多克隆抗体(工作液3ml,克隆系 BA0610)购自武汉博士德生物技术有限公司;鼠抗人COX—l 单克隆抗体(工作液3ml,克隆系COX111)购自中杉金桥生物 技术有限公司;兔抗人COX一2单克隆抗体(工作液3ml,克隆 中国计划生育学杂志2010年第7期总第178期 系SP21),SP鼠免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自福 州迈新生物技术开发公司;轮转式切片机及Q550IW显微镜 计算机图像分析系统购自Leica公司. 二,研究对象 选取2007年8月1日一2008年3月31日在暨南大学第 一 附属医院妇科要求终止妊娠的早孕妇女.纳入标准:?停 经7—9周,经双合诊,妊娠试验,B超确诊为宫内早孕;?平 时月经规则,经量正常;?半年内未服用激素类药物及抗前列 腺素药物;?无生殖系统炎症及肿瘤;?未放置宫内节育器. 三,分组与用药 在研究对象知情同意下收集符合上述条件者并随机分成 2组:对照组12例,年龄19—34岁,孕50—56d8例,孕57— 63d4例,行常规负压吸引人工流产,收集绒毛.药流组12 例,年龄20—4o岁,孕50,56d5例,孕57—63d7例,顿服米 非司酮150mg,24—48h内常规负压吸引人工流产,收集绒毛. 四,实验方法 1.样本处理绒毛组织常规固定石蜡包埋后制成组l织切 片,HE染色,光镜下观察组织学形态. 2.免疫组化检测NF—KB,COX一1及COX一2采用免 疫组化链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶染色法(sP)进行 三种物质的检测.组织切片常规脱蜡后,根据每一种抗体的 要求,对组织抗原进行相应的修复.鼠抗人COX一1单克隆 抗体不需抗原修复;兔抗人COX一2单克隆抗体相应组织抗 原采用乙二胺四乙酸(EDTA)微波修复;兔抗人NF—KEVP65 多克隆抗体采用磷酸盐缓冲液(PBS)微波修复.实验设阴性 对照(PBS代替一抗)以排除非特异性染色干扰. 3.图像分析光镜下观察参照HE对照,阴性对照,以胞 浆内呈现棕黄色颗粒为阳性染色,无棕黄色颗粒为阴性染色. 采用Q550IW图像分析系统,应用申洪等提出的阳性单位 (PU)概念定量表达免疫组化阳性反应程度.PU概念指将排 除了切片本底因素后的纯免疫组化反应程度按灰度图像分为 0,100个等级,每个等级定义为1个PU,PU值与阳性反应程 度成正比.计算公式:PU=[(G.一GB)/Gmax]X100,(G, G分别为待测结构和背景的平均灰度,G=256).每个标 本随机测试20个视野中绒毛中间间质的灰度值(记为G), 以每个绒毛结构中间分别取横轴,纵轴,45度斜轴与外周表 达阳性的滋养细胞交点处测定灰度值(记为G,每个绒毛测 得8个G值),利用上述公式计算. 五,统计学分析 采用SPSS13.0医学统计软件行数据分析.分析结果采 用t检验,滋养细胞中NF—KB,COX一1及COX一2含量用PU 均值?标准差(?s)表示. 结果 一 ,各组样本光镜下组织形态学 参照HE对照(图1)对免疫组化阳性染色的出现部位作 出判断和分析.药流组与对照组均可见完整的孕早期绒毛结 构,绒毛数量少,体积大,表面有两层形态不同的滋养细胞,形 态结构均正常.NF—KB主要强表达于绒毛表面的合体滋养 细胞胞浆中,细胞滋养细胞胞浆表达稍弱,药流组阳性染色较 对照组强(图2).COX一2主要强表达于绒毛表面的合体滋 养细胞胞浆中,细胞滋养细胞胞浆弱表达,血管内皮细胞和间 质略有着色,药流组阳性染色较对照组强(图3).COX一1强 表达于上述两组合体及细胞滋养细胞胞浆,血管内皮细胞和 间质略有着色.两组间表达无差别(图4). 二,免疫组化图像分析 表1COX一1,COX一2,NF—KB在两组胎盘 绒毛中的表达(PU,?s) 两组比较P<0.0l 绒毛体积大,外层为合体滋养细胞(A),内层为细胞滋养细胞(B),间 质疏松,可见小血管(C) 图1光镜下两组妇女胎盘绒毛结构(HEX200) 图2NF—KB免疫组化染色结果(SPX200) ? 409? 中国计划生育学杂志2010年第7期总第178期 图3COX-2免疫组化染色结果fSPx200) C为阴性对照 图4COX一1免疫组化染色结果(SP×200) 讨论 NF—KB是1986年Sen和Baltimore首先从B淋巴细胞核 抽提物中检出的,可与免疫球蛋白的轻链基因增强子KB序列 (GGGACTrTCC)特异结合的一种核转录因子,被认为是氧化 应激的感受器,参与启动并调节机体免疫和炎性反应,凋亡及 细胞的增殖分化等相关基因的转录-6].COX具有环氧合酶 和过氧化物合成酶的双重功能,细胞膜的磷脂在磷脂酶的作 用下水解出花生四烯酸(AA),AA经过COX的作用转变为前 列腺素(PC,s),发挥多种生物学作用.COX是PGs合成的 重要限速酶.COX一1和COX一2具有共同的基本结构和催 化特性,由独立的基因编码,因此具有不同的细胞特异性表 达,分布和功能.COX一1为结构型酶,属"管家基因",促进 生理性PGs的合成,参与维持机体正常的生理功能,保持内环 境稳定.COX一2为诱导型酶,属"诱导基因",当细胞受到各 种刺激时可迅速合成,参与细胞增殖,分化,与炎症,疼痛,肿 瘤,心血管等疾病的发生发展密切相关. NF—KB调节COX一2的活性,在低含氧量条件下能观察 到在血管内皮细胞内经NF—zB核转录因子作用可使诱导型 COX一2的基因表达增多.Asfle等发现NF—ttB和孕激素 受体(PR)相互之间有负向作用,人类分娩发动与羊膜NF— KB的激活有关,NF—zB激活使COX一2表达增加,抑制PR 活性而引起"功能性的孕酮撤退".妊娠的成功与否与应激 作用于胚胎时NF—KB对凋亡过程的控制密切相关J.正常 妊娠时外周血单核细胞中NF—zB处于抑制状态,使胎儿免 受排斥. 本研究结果表明:米非司酮可明显增强孕7—9周人胎盘 绒毛中NF—KB和COX一2的表达,而对COX一1的影响不明 ? 410? 显.由此推断可能与以下机制有关:?由于NF—KB和PR之 间有相互负向作用,米非司酮作为抗孕激素,可激活NF—KB; ?由于COX一1是活性稳定的结构型酶,因此米非司酮对其 影响不明显;?由于COX一2及PGs与NF—KB偶连,米非 司酮可能通过NF—s:B使COX一2基因表达增多及PGs合成 增加,而影响妊娠的结局;?由于NF—KB对凋亡过程的调控 与妊娠的结局密切相关,NF—KB的激活会使母胎之间的排斥 反应加剧,从而不利于妊娠的维持. 参考文献 1曹丽锦.大月份药物流产临床应用.现代医药卫生,2008,24(11): 1683. 2项璐璐.米非司酮配伍米索前列醇终止孕9周内妊娠.右江医学, 2007,35(5):565. 3申洪.免疫组织化学染色定量方法研究(?).中国组织化学与细 胞化学杂志,1995,4(1):89—92. 4KusunokiT,SugmM.GondaH,eta1.CpGinhibitsIgEclassswitchre? combinationthroughsuppressionofNFkappaBactivity,butnotthrough Id2orBcl6.BiophysResCommun,2005,328(2):499—506. 5KarinM.NF—kappaBandcancer:mechanismsandt~gem.MolCar- cinog,2006,45:355—361. 6AranhaMM,BorralhoPM,RavascoP,eta1.NF—kappaBandapop— tosisincolorectaltumourigcnesis.EurJClinInvest,2007,37(5): 416—424. 7EmmetH,MareiG,YanaF,eta1.Placentalexpressionofenzymes regulatingprostaglandinsynthesisanddegradation.AmJObstetand 1843. 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