[doc] 类植物乳杆菌抑菌物质的性质及其在猪肉保鲜中的作用

[doc] 类植物乳杆菌抑菌物质的性质及其在猪肉保鲜中的作用 类植物乳杆菌抑菌物质的性质及其在猪肉 保鲜中的作用 --==l52 .. 308食品研究与开发第卷第期民盯1耵不及食品保鲜 类植物乳杆菌抑菌物质的性质 及其在猪肉保鲜中的作用 刘长建.权春善.范圣第.王军华 (大连民族学院生物技术与资源利用国家民委一教育部重点实验室.辽宁大连116600) 摘要:类植物乳杆菌?32能够抑制沙门氏茵等革兰氏阴性腐败茵和其它细茵的生长.其茵液的正丁醇萃取液,通 过阳离子交换层析,凝胶过滤,反相高效液相层析等分离纯化,获得纯度较高的抑茵物质.该物质耐热性强,耐酸,但 在碱性条件下不稳定,对蛋白酶不敏感.初步研究明,该茵的发酵液能抑制冷却猪肉中腐败茵的生长,延长冷却猪 肉的货架期,而且对猪肉的品质没有不良影响. 关键词i类植物乳杆茵发酵液;分离纯化;性质;猪肉保鲜 PROPERnESOFANANnMICROBIALSUBSrANCEFROM厶4CC见L【删?蚴 ANDAPPUCATIONOFTHEFERMENTEDSOLUTION0NPORKPRE SERVATION shan,FANSheng-di,WANGJun-hua LIUChang-jian,QUANChun— 作者简介:刘长建(1975--),男(汉),师,硕士,研究方向:应用微生物. 从图4可以看出.茶多酚的沉积量与添加量没有 直接的剂量关系.各处理组茶多酚的沉积量有一个先 下降后上升的过程,说明茶多酚添加到鸡肉中后,可能 存在一个先结合再释放的过程;各处理组都在第6天 和第8天出现增加高峰,且以800mg/kg和1000mg/kg 的释放量最大,这与前文的护色效果,MDA和一AOC变 化规律是一致的. 3讨论与结论 3.1关于肉的色泽 肉的颜色是评定肉质量变化的重要指标之一.肌 肉颜色变化主要由肌肉中肌红蛋白受空气中氧的作 用,生成氧化肌红蛋白的程度不同而形成的,当肌肉中 的肌红蛋白和氧结合形成氧合肌红蛋白时,肉呈亮红 色;随着贮藏时间的延长,氧合肌红蛋白进一步氧化为 高铁肌红蛋白,肉呈棕褐色【句.本研究表明,向鸡肉中 添加茶多酚可明显改善肉的色泽,其可能的原因是:茶 多酚是抗氧化剂,能减少机体内过氧化物,自由基的生 成.而过氧化物,自由基等物质都是诱发紫红色的亚铁 肌红蛋白氧化为棕褐色的高铁肌红蛋白的主要物质. 3.2关于MDA 自由基作用于脂质发生过氧化反应,氧化终产物 为丙二醛(MDA),其含量可以反应机体脂质过氧化 程度.是了解自由基导致机体组织细胞损伤的重要 指标f71.本研究中添加茶多酚的处理组可明显降低其 MDA.表明茶多酚可增强鸡肉的抗氧化作用. 3_3关于茶多酚的沉积 本研究表明,茶多酚添加到鸡肉中后,其沉积量 会随着贮藏时间的变化而变化,其可能的原因是:茶多 酚添加到鸡肉中后.先与鸡肉中的蛋白质发生可逆性 结合,随着贮藏时间的延长又被释放出来发挥其抗氧 化作用.有关此方面的机理有待进一步探讨. 参考文献: 【1】吴信法.肉品科学及肉品卫生检验【M】.北京:中国商业出版社, 1985:56—57 【2】杜荣茂,刘梅森,何唯平.天然功能性食品添加剂茶多酚们.中 国食品添加剂,2004(2):56—6o 【3】杨贤强,王岳飞,陈留记.茶多酚化学【M】.上海:上海科学技术出 版社,2003:228-229 【4]张格,张玲玲,吴华,等.采用超高技术从茶叶中提取茶多酚啊. 茶叶科学.2006,26(4):291—294 【5】黄春辉.灰黄霉素色泽的色差法测定叨.中国医药工业杂志, 2001,32(4):169-172 【6】闵连吉.肉类食品工艺学【M】.北京:中国商业出版社,1991:79-80 【7】杨旭辉,马建慧,章乐,等.烟酰水杨酸抗心肌缺血家兔氧自由基 和脂质过氧化作用叨.中国药理学通报,2006,22(9):1058-1061 收稿日期:2008—06—12 食品保鲜食品研究与开发2009年8月第30卷第8期153===一 (DalianNationalitiesUniversity,KeyLabofBiotechnologyandBioresourcesUtilization,SEAC—ME, Dalian116600,Liaoning,China) Abstract:StrainI132exhibitedpowerfulinhibitoryactivityagainstnotonlyGram-positivebacteriabutalso Gram—negativebacteria,suchasSalmonellasp.TheinhibitorysubstanceproducedbystrainII32waspudfied throughn—butylalcoholextraction,cation—exchangechromatography,ge lfiltrationandreverse—phaseHPLC. Theantimierobialsubstancewasheat—-stableandonlypartlyinactivatedaft ertreatmentat121%for15min. Theantimicrobialsubstancewasalsostabletoproteolyticenzymestreatment(proteaseK,pepsin,papain).The fermentedsolutioncangreadyinhibitthegrowthofSalmonellasp.inthechille dpork,andextenditsshelflife. ThesensorypropertyofchilledporktreatedWasnotadverselyaffected.There sultsshowthatstrain?32will haveagoodpotentialapplicationinfoodpreservation. Keywords:L.parap/antarumfermentedsolution;purification;property;fres hkeepingofpork 猪肉在屠宰和分割等过程中易被微生物污染而加 速猪肉的腐败,大大缩短猪肉的货架期.采取适当的保 鲜处理十分重要,其中应用较多的是化学防腐剂,但这 存在许多安全隐患;即使许多传统的保存方法如干制, 盐腌,加热,罐藏等也存在猪肉的风味,质地甚至整个 特性发生变化等问题:而冷冻干燥,气调贮藏,辐射保 藏,微波杀菌等食品保存技术又有耗能大的缺点Ill.所 以人们把注意力集中在天然防腐剂的开发利用上,乳 酸菌在食品保藏方面有着悠久的应用历史.作为公认 安全的食品级微生物.乳酸菌在生长过程中产生多种 抗菌物质,如乳酸菌素,双乙酰,过氧化氢,有机酸等阳. 然而由于乳酸菌素只能抑制革兰氏阳性致病菌,且抗菌 谱较窄,这限制了其在食品领域更广泛地应用嘲.因此 从乳酸菌中分离能抑制革兰氏阴性致病菌的活性物 质.并能应用到食品保鲜领域具有重要的研究意义.本 研究从发酵食品中分离出一株抗沙门氏菌等革兰氏阴 性细菌的乳酸菌—类植物乳杆菌,从其发酵液中分离 纯化出一种活性物质.对其生物学特性进行了研究,并 对其在猪肉保鲜中的效果进行了初步研究. 1材料与方法 1.I菌株和培养条件 类植物乳杆菌发酵液:类植物乳杆菌?32由本实 验室分离鉴定的,MRS培养基(Merck,德国),30C静置 培养18htz;指示菌:沙门氏菌,由本实验室保存;NB培 养基(Oxoid,英国),35?振荡培养18h. 1.2原料,试剂 购自超市的新鲜猪肉:蛋白酶K(Sigma),木瓜蛋 白酶(Sigma),胃蛋白酶(Sigma),乙腈:天津科密欧; TFA:Sigma其他试剂均为纯. 1.3仪器 旋转蒸发仪(R一200/B--490):瑞士BIJBCHI冷冻干 燥机(Freezone4.51:美国Labconco;层析系统(AKTA explorerl0):瑞典Pharmacia;高效液相系统(LC一6AD): 日本Shimadzu;超低温冰箱(MDF一383E):日本Sanyo; 色差仪(CR400/410):日本KonicaMinolta,等. 1.4方法 1.4.1抑菌物质的分离纯化 提纯步骤:发酵液一离心一正丁醇萃取一旋转蒸 发仪浓缩一琼脂糖交换层析—凝胶过滤层析一反相高 效液相层析一得到纯品[o3.检测波长215nm,点滴法测 各组分的活性并收集. 1.4.2稳定性的测定 已纯化的样品(0.3mg/mL)通过6个方面对其稳 定性进行测定.温度:分别在40,6O,80,100,120,150oC 加热15min;pH值:样品调pH至2.0—11.0;加入各种金 属离子及表面活性剂使其浓度达到5mmol/L:加入蛋 白酶K,木瓜蛋白酶,胃蛋白酶,在37?反应2h之后, 放人80?的水浴中20min停止反应;与有机溶剂 等体积混合,充分混匀静置3h,旋转蒸发除掉有机 溶剂【61.以上几项测试均以未经处理的样品作为对 照,点滴法检测活性用. 1.4.3肉样处理 将鲜猪肉切分成面积10cmz厚约0.5cm的50g 肉块,分别浸入95%的乙醇中2S,取出后点燃灭菌19]. 肉样分别在沙门氏菌液(105cfu/mL)中浸20s接种, 25?静置培养15min,备用. 1.4.4细菌计数方法 取肉样10g浸入90mL0.1%的无菌蛋白胨溶液 中,充分搅匀,用无菌的蛋白胨溶液以l0倍级数连续 稀释,平板菌落计数. 1.4.5菌液对猪肉品质的影响 取6组肉样,分别用1,2.4,6,8倍不同稀释浓度 的发酵液喷洒在肉样表面,未处理肉样为对照.置4? .==l54 .. 30鬻8食品研究与开发第卷第期艮叩耵司不援食品保鲜 恒温冰箱贮藏15d.分别在第O,3,7,10,l3,15天抽样 测定指标:用pH计穿刺电极直接插入肉中测定pH 值;采用色差计检测肉样的亮度和色泽变化,以及根据 色泽,组织状态,黏度和气味等指标进行综合评定. 1.4.6菌液对猪肉中致病菌的抑制作用 取肉样2组,稀释2倍的菌液喷洒在表面.4?冰 箱保存20d,分别在0,3,7,10,l3,15d抽样对沙门氏 菌计数;常温保存3d,分别在0,1,2,3d抽样对沙门 氏菌计数. 2结果和分析 2.1抑菌物质的分离纯化 试验发现用正丁醇提取的效果最好,等体积的有 机溶剂与菌液充分混匀静置3h后,混合溶液会形成 三层:上层为有机相,中层为絮状的蛋白沉淀,下层为 水相.分别取上下两层溶液,旋转蒸发除掉有机溶剂, 用磷酸缓冲液(pH6.0)溶解;中层絮状沉淀用同样的 缓冲液溶解,使用牛津杯定量扩散法检测活性.上层 有明显的活性.而下层的水相和絮状沉淀都没有检测 到明显的活性. SPSepharoseXL阳离子交换柱:在NaC1浓度 大约在0.4mol/L时有一个活性峰,最高活性值达 到3000U/mL:Superdex75Pg层析:洗脱体积大约 在20mL时活性物质被洗脱下来(见图1);样品最 后经反相高效液相层析柱可除去大部分杂质,而活性 物质并没有吸附到柱上.推测此抑菌物质可能极性很 强,不具有或含有少量疏水基团.用ShodexODP2506D 高效液相柱进行纯度检测其纯度达到95%以上. Antimicrobialactivity/mL 图1样品的凝胶过滤层析 FigaGelffltTafionchromatographyofsample 2.2抑菌物质生化性质的研究 2.2.1温度,pH值和蛋白酶对抑菌物质的影响 抑菌物质的热稳定性较高,100c【=加热15min 仍具有活性,120oC加热15min部分失活,150oC加 热15min时完全失活.抑菌物质对环境pH值的要求 比较苛刻,pH>6.0时完全失活;随着pH的降低,活性 逐渐增大;pH3.0时活性最强.木瓜蛋白酶,蛋白酶K, 胃蛋白酶对抑茵物质的活性没有影响.说明抑菌物质 可能不是蛋白质,而可能是抗生素或者是一种不具有 某些酶切特异位点的小肽. 2.2.2金属离子和一些化合物对抑菌物质的影响 Ni2+,Fe能够促进活性物质的抑菌活性,Na+,K, Li,Mg,Cu,(二硫苏糖醇)DTr,(乙二胺四乙酸) EDTA对其活性没有明显的影响,而C,Mn2%-j”活性 物质有抑制作用.而表面活性剂(十二烷基苯磺酸钠) SDS和巯基乙醇对抑菌物质的活性有明显的抑制,吐 温一80,DTI”对抑菌物质活性的影响不大.由于抑菌物质 的极性很强,能溶解于有机溶剂甲醇,乙醇,正丁醇,异 戊醇,三氯甲烷,丙酮,乙酸乙酯,且对其活Jl生没有影响. 2.3发酵液在冷却猪肉保鲜的初步试验 2.3.1发酵液对猪肉表面pH的影响 发酵液对猪肉表面pH的影响,见图2. 6 毛5 4 食品保鲜食品研究与开发2009年8月第30卷第8期 表1发酵液对猪肉感官质量的影响 Table1E船ectoffermentedsolutiononsensoryquailty i55==I 注:1.度(与白色校正值相比较);一色泽(1表示灰白,10表示深红);2.A 为一级鲜度;B为二级鲜度;c为轻度变质;D为变质. 2.3.3发酵液对猪肉中腐败菌的抑制作用 综合不同浓度的类植物乳杆菌发酵液对肉样的 pH值,感官质量等影响,确定类植物乳杆菌发酵液稀 释两倍时为适宜的添加稀释度.经发酵液处理的肉样 和对照组的肉样随贮藏时间的延长,经处理肉样的菌 落总数下降幅度更大,20d时菌落数少于10cfu/g,而 对照组为l05cfu/g.这说明发酵液对肉样中的沙门氏 菌有很好的抑制效果. 在常温时,经发酵液处理的肉样在第3天时菌落 总数大幅度下降.从初始的105cfu/g降为10cfu/g.而 对照组肉样的菌落总数大幅度提高.超过10cfu/g.通 过两组试验的对照,说明发酵液能够有效抑制肉样中 腐败菌的生长,只是在低温时抑制稍差一些. 3结论与讨论 目前.乳酸菌所产的活性物质,对革兰氏阴性致 病菌没有很好的抑菌活性,这限制了乳酸菌在食品中 的应用,本研究所分离的活性物质对多种典型的革兰 氏阴性食品腐败菌有良好的抑菌效果阎,弥补了乳酸 菌在这一方面的缺陷.提高了乳酸菌在食品领域中的 应用价值.经分离纯化,得到在酸性条件下有良好的 抑菌性,带有正电荷的活性物质.这种物质在木瓜蛋 白酶,蛋白酶K,胃蛋白酶作用下没有影响.可能是一 种抗生素或小肽.这种抑菌活性物质的热稳定性较高, 150?加热15min时才完全失活.这在实际应用中有 很重要的意义,在食品保鲜过程中都需要对食品进行 加热处理,活性物质的热稳定性有利于将其应用到食 品保鲜中.加人低浓度的Ni,Fez+能够促进活性物质 的活性,而其它金属离子,有机溶剂对其活性无太大影 响.试验表明类植物乳酸菌?32能抑制鲜肉中腐败菌 的生长,很大程度上延长冷却鲜猪肉的货架期,如2倍 稀释的发酵液使处理肉样延长6d的保鲜期.而且对 猪肉的品质无不良影响.乳酸菌在生长过程中还能够 产生双乙酰,过氧化氢,有机酸等,乳酸的酸味柔和,在 最适浓度范围内既防止微生物污染又能提高猪肉的 风味.类植物乳酸菌?32也能产生大量乳酸嘲,低温保 存时其生长代谢被抑制.但一旦到了常温乳酸菌的生 长将起到更好的保鲜作用.希望在以后的试验中能通 过进一步的研究.完全了解这种活性物质的结构及作 用机理,使其能广泛的应用于食品,医药等领域. 参考文献: 【1】张子平.冷却肉的加工技术及质量控制【J】.食品科学,2001,22(1): 83—89 【2]VanReenenC,ChikindasM,VanZylW’eta1.Dicks.Characterization andheterologousexpressionofaclassIiabacteriocin,plantariein423 fromLactobaciUusplantarum423,inSaccharomycescerev~iae. 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