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家畜繁殖学.doc 湖南农业大学课程 学 院:动科院 班 级:09畜牧 姓 名:梁海玉 学 号:200940511202 课程论文题目:关于精液稀释保存效果的研究 课程名称:家畜繁殖学 评阅成绩: 评阅意见: 成绩评定教师签名: 日期: 年 月 日 1 关于精液稀释保存效果的研究 学 生:梁海玉 (动科院 09畜牧 学号200940511202) 摘 要:随着经济的腾飞，我国的养殖业不断地朝集约化、规模化发展，而其中公畜的数量及质量严重制约了养殖业的发展。经过不断地探索研究，人工授精应运而生。人工授精有效地改变了家畜的配置过程，提高了优良公畜的配种效率和利用价值，而且，人工授精的发展可减少公畜的饲养头数，降低生产费用，提高生产效益。其中，精子的保存期间精子的活力保持和保持时间对优良公畜精子的利用效率影响极大。对于精子的活力保持所需要的条件，本实验进行了浅显的研究，主要进行的是精子的常温保存。 关键词: 精子活力;常温保存。 精液的保存的目的是延长精子的存活时间及维持精子的受精能力，便于长途运输，扩大精液的使用范围，增加受配母畜头数，提高种公畜的配种效能。常用的保存方法有液态保存和冷冻保存，而液态保存又可以分为常温保存和低温保存，由于条件所限，本实验采取常温保存的方法来完成精子活力的测定。一般要求常温保存精子活率要超过0.6，冷冻保存解冻后精子活率超过0.3，说明精子保存良好。 1保存原理 常温保存主要是利用一定范围的酸性环境抑制精子的活动，或用冻胶环境来阻止精子运动，以减少其能量消耗，使精子保持在可逆性的静止状态而不丧失受精能力。常温有利于微生物生长，因此，还要用抗菌物质抑制微生物对精子的有害影响。加入必要的营养和保护物质，隔绝空气，也会有良好作用。 精子在弱酸性环境中，活力受到抑制，能量消耗降低，pH一旦恢复到中性，精子即可复苏。因此，在精液稀释液中加入弱酸性物质，调整精子的酸性环境，从而抑制精子的活动，达到精子保存的目的。 精子在一定的pH范围内，处于可逆性抑制。但常温保存也有利于微生物的生长繁殖，加入一定的抗生素，可以降低微生物及其产生的代谢产物对精液品质的影响。 精液的保存一般包括精液、营养剂、保护剂三部分，根据这一原理，采用不同的配方，配置不同的浓度比例恒温保存在16?，配置好后，每隔5小时(夜晚不检测)检查一次精子活力并计算精子的存活率。 精子活率,(呈直线前进运动精子数/总精子数)*100, 2影响精液保存效果的因素 随着人工授精技术的日益发展与提高，人们对影响精液保存效果的诸多因素进行了广泛而深入的研究。 2.1温度的影响 2 在影响精子存活的外界环境因素中，保存温度至关重要。猪精子对低温很敏感，只能耐受15?以上温度，这涉及到膜对温度的敏感性。 2.2 PH值及其缓冲体系 当精液的pH值降低时，精子的代谢和活动力都减弱。在附睾内，精子的生存环境为弱酸性，精子呈休眠状态。因此可利用酸性环境抑制精子的活动。为使精液能在室温环境保存多日，精液可用二氧化碳饱和，或使pH降到6(35，这相当于使精子处于附睾内状态，也和低温抑制其活动相似。 2.3 抗菌素的研究 在稀释液中加入抗菌素是精液保存成败的关键，抗生素可以抑制细菌对精液的污染，是保障精液品质的重要成分。常用的抗菌物质有青霉素、链霉素、氨苯磺胺等。 2.4 渗透压与精子膜结构 渗透压对精子的影响与pH有相等的重要性，二者的相互关系尤为密切，渗透压过高过低都不利于精液储存。黄建国等通过添加葡萄糖的用量来调节渗透压，对用不同渗透压的稀释液稀释猪精液后的保存时间进行了比较，表明猪精液稀释液的渗透压指标，即冰点下降度在与猪精液的冰点下降度接近时，保存效果较好。 2.5其他 为了更进一步的研究精子在体外保存中的变化，人们在有关精子结构的方面也作了大量的研究工作。研究指出，精子细胞维持膜的渗透性是精子存活的一个基本条件。同其他种类的细胞相比，精子细胞膜在受到损害后自我修复的能力较低。精细胞膜具备较好的渗透性能保证精子维持必须的膜内外离子强度和渗透压。细胞膜在储存过程中的变化引起了人们的关注。其中脂类过氧化反应与膜结构的改变密切相关。精子细胞膜磷脂中含量相对较多的不饱和脂肪酸在有氧条件下极易产生脂类的过氧化反应，从而破坏膜的脂质状态。精液长时间贮存而引起脂类过氧化反应将对精细胞膜造成伤害。因此，提供一个能防止形成脂类过氧化物的环境，可能是稀释液对维持精子在体外保存期中活力方面所起的关键因素之一。在保存精液时，保持厌氧环境，有利于防止精液中过氧化物的形成。在大多数精液稀释液中都包含有助于将脂类过氧化作用降低到最低限度的成分。 3实验测定 实验组1 稀释比例 1比3 1比1 日期 观察时间 密度 活率 密度 活率 11:00 稀 0.7 中 0.4 11月16日 15:00 稀 0.5 稀 0.3 3 20:00 稀 0.5 稀 0.4 9:00 稀 0.4 稀 0.4 11月17日 14:30 稀 0.3 稀 0.2 20:20 稀 0.3 稀 0.1 9:00 稀 0.1 稀 0.1 15:00 稀 0.1 稀 0(废弃) 11月18日 20:00 稀 0.05 稀释液配方 葡萄糖 5.0g 柠檬酸三钠 0.3g EDTA(二乙胺四乙酸二钠) 0.1g 卵黄 10ml 青霉素 10万单位 链霉素 10万单位 蒸馏水 100ml 本组实验较详细，相比较而言精子的活力较好，保存时间也较长 实验组2 稀释比例 1比3 1比1 日期 观察时间 密度 活率 密度 活率 11:00 稀 0.8 中 0.9 11月16日 15:00 稀 0.2 中 0.7 20:00 稀 0 稀 0.4 9:00 稀 0 稀 0.2 11月17日 14:30 稀 0 稀 0 20:20 稀 0 稀 0.1 每天用不同瓶子的精液，17日晚换了一瓶未检测过的，所以有活力 稀释液配方 葡萄糖 6.0g 柠檬酸三钠 0.35g 0.1g 碳酸氢钠 EDTA(二乙胺四乙酸二钠) 0.37g 卵黄 10ml 青霉素 10万单位 链霉素 3万单位 蒸馏水 100ml 从本组实验数据可以看出，精子在短时间内存活率较高，但是存活时间较短。 4 实验组3 稀释比例 1比3 1比1 日期 观察时间 密度 活率 密度 活率 11:00 稀 0.8 中 0.9 11月16日 15:00 稀 0.2 中 0.7 20:00 稀 0 稀 0.4 稀释液配方 葡萄糖 6.0g 柠檬酸三钠 0.3g EDTA(二乙胺四乙酸二钠) 0.37g 青霉素 5万单位 链霉素 5万单位 蒸馏水 100ml 从实验数据可以看出，精子存活时间短，但在1:1比例稀释条件下，精子的活力较高。 实验组4 稀释比例 1比3 1比1 日期 观察时间 密度 活率 密度 活率 11:00 稀 0.6 中 0.9 15:00 稀 0.5 中 0.6 11月16日 20:00 稀 0.3 稀 0.4 9:00 稀 0.3 稀 0.3 11月17日 14:30 稀 0.1 稀 0.1 20:20 稀 0.1 稀 0.05 11月18日 9:00 稀 0 稀 0.05 稀释液配方 葡萄糖 5.0g 柠檬酸三钠 0.3g EDTA(二乙胺四乙酸二钠) 0.1g 卵黄 10ml 青霉素 5万单位 链霉素 5万单位 蒸馏水 100ml 与实验组1有一定的相似，但存活时间缩短。 实验组5 稀释比例 1比3 1比1 日期 观察时间 密度 活率 密度 活率 11:00 稀 0.8 稀 0.2 11月16日 15:00 稀 0.2 稀 0 20:00 稀 0 稀 0 稀释液配方 5 葡萄糖 6.0g 柠檬酸钠 0.35g 碳酸氢钠 0.12g EDTA(二乙胺四乙酸二钠) 0.37g 青霉素 3万单位 链霉素 10万单位 蒸馏水 100ml 由实验结果可以看出，第5组的配方与其他四组相比，缺陷较大，存活时间最短，在相应的时间内精子的存活率也较低。 4实验结果分析 猪精液常温保存稀释液:公猪全份精液在15—20?下保存效果最适宜，由于保存时间不同，稀释液可分不同种类。采精后立即输精的，可不稀释;1天内输精的，可用实验组2、3、4的1:1或者实验组1的1:3比例稀释的精液，也可以用实验组。需要保存1—2天的，适宜使用实验组1、2或者4，如果需要保存3天以上的，适宜使用实验组1。如果需要保存时间更久，则需要进一步优化精液稀释配方。 (1)首先第一组与第四组比较，二者的配方比较接近。其实二者都更加适用于精液的低温保存，但这里同样保存在恒温16?，利用葡萄糖提供能量，EDTA和柠檬酸钠充当酸碱缓冲剂，提供一个碱性环境，卵黄为防冻剂，青霉素和链霉素起杀菌作用。分析比较第四组的精子存活时间较第一组短，而且比例稀释所得精子的存活率正好相反，而二者的差别主要是抗生素的含量不同。分析其原因，其一也许是二者受微生物感染程度不同，第四组的抗生素含量略低，导致精子后期受微生物及其代谢产物污染比较严重，而第一组的抗生素含量略多，导致精子的存活率从开始就低于第四组。其二也许是观察者使用显微镜观察计数出现偏差，导致实验结果相差较远。 实验还存在一点不足之处，实验者本意是为精液提供一个酸性的保存环境，但其提供的盐类其水解的产物却是偏碱性，这也会造成精子代谢加快，其保存时间就相应的减短了。 (2)第一组和第二组相比，除抗生素有差别以外，第二组还多加了一个碳酸氢钠，而且第二组中抗生素含量也较少，理论推断第二组精子的存活率和存活时间都应强于第一组，但实际恰好相反。分析其原因，也许是在精子由恒温箱中取出解冻时，由于操作不当，造成精子迅速死亡，精液放于载玻片上后，没有保温或保温没有及时观察，造成精子迅速死亡，使本来的实验结果出现错误。 实验同样存在与上诉相同的不足之处，实验者本意是为精液提供一个酸性的保存环境，但其提供的盐类其水解的产物却是偏碱性，这也会造成精子代谢加快，其保存时间就相应的减短了。 (3)第三组实验配方与其他三组相比，看起来是最简单的。但其同样提供了精子存活所需要的必须元素。存活时间最短，但其短期之内存活率是最高的，相比较而言，如果精子短期使用或者进行短途运输后即使用，实验组三是一个比较好的选择。分析其存活较短的原因，可能是碱性环境下精子代谢旺盛，能量利用出现枯竭现象。 综合分析，实验配方简陋，是同学初步了解了精液保存原理和方法后进行的尝试，存在很大的不足，精液保存应该是一个稍微高渗的溶液，较高的渗透压可以减弱精子的代谢活力，减少能量消耗，延长精子的存活时间。而试验中配置的稀释液都渗透压较低，而且是弱碱性环境，所以使精子维持一个较高水平的代谢活动，结果加速了精子的死亡速度。在实验过程中，出现了畸形精子，都按直线运动计算了，所以实验结果存在很大的误差。 6 5结束语 到目前为止，将猪精液常温保存3 d以上而保持良好受精率的稀释液配方尚未取得令人满意的结果，但却有所进步。由于不同个体公猪的精液在液态保存期间保持受精力的差异极大，再加上季节、环境等诸多因素的影响，就使得我们难于在实际生产条件下获得有关精液贮存期间在受精力方面的统一可靠的数据。并且，对于经过保存的精液受精力高低的评价是将输精剂量和输精次数排除在外的。考虑到影响精液质量的诸多因素，在现有使用效果较好的稀释液配方的基础之上，我们可以通过对pH、温度、渗透压的控制来寻找适合本地生产条件的稀释液配方，这就涉及到对稀释液成分的选择和量的选择。对出现的一些使用效果较好的特殊添加物，可以通过对比试验验证其在精液保存中能否起到积极作用。 精液的保存是人工受精中极为关键的一部分，人工受精可以提高优良公畜的利用率，加快品种改良，扩大基因的交流范围，避免疾病的传播，提高经济效益，被越来越多的养殖户利用。所以值得我们不断地探索研究，而我们这个实验只是简单的借鉴了前辈的经验，这个领域也不是完全完善，其也可以成为我们后来的一个研究方向，这就要求我们有更大的知识来支撑，所以我们要更加的努力，吸收前辈们的经验，并且更进一步。 7