山梨酸钾清除超氧阴离子自由基的作用

山梨酸钾清除超氧阴离子自由基的作用 ( ) 1998 自然科学版内蒙古大学学报M ay 1998 年 5 月 第2 9 卷第3 期 A c ta Sc ien t ia rum N a tu ra lium U n ive r sita t is N e iM o ngo l V o l. 29 N o. 3 Ξ 山梨酸钾清除超氧阴离子自由基的作用 1 1 2 2 2杨性愉, 王艳荣, 陈京珍, 王玉昌, 黄永明 (1. 内蒙古大学物理学系, 010021, 呼和浩特; )2. 内蒙古大学实验测试中心, 010021, 呼和浩特 ? ( 利用检测超氧阴离子自由基的化学发光体系 二甲基亚砜2氢氧化钠2 摘要 O 2 ) 氧2鲁米诺, 在体系 值为 8. 6 的最佳发光条件下, 用化学发光法来检测超氧阴 pH ?? 离子自由基, 发现山梨酸钾具有清除超氧阴离子自由基的作用. 结果明, O 2 O 2 随着山梨酸钾浓度的增加, 清除作用也逐渐增强, 给出了定量的清除率. 关键词 山梨酸钾 超氧阴离子自由基 二甲基亚砜2氢氧化钠2氧2鲁米诺化学 发光体系 中图资料分类号 O 644. 17 引 言 () 山梨酸钾的化学名称为己二烯酸钾, 分子式为 结构式为 , P ota ss ium sorba teC 6H 7O 2 K CH 3CH = - , 分子量为 150. 22, 呈白色或淡黄色鳞片状结晶, 成品为粉末, 极易溶于水. 山 CH CH CH COO K 梨酸钾是国际公认的高效、安全、无毒的食品防腐剂, 对真菌有较强的抑制和杀灭作用, 防腐效果明 显优于苯钾酸钠. 山梨酸钾作为食品添加剂可正常参与机体内的新陈代谢, 产生二氧化碳和水, 可 看作是食品的成分之一. 山梨酸钾用途极为广泛, 可用于各种食品、调味品、肉类、蔬菜等的防腐、保 鲜, 亦可用于医药、农药等行业. 我们在实验研究中发现, 山梨酸钾除了具有防腐作用外还兼有清除 ? 超氧阴离子自由基的作用. O 2 ?生物体内的非酶反应和酶反应均可产生超氧阴离子自由基 . O 在非酶反应中, 如果 能从 2 O 2 ?( 还原剂接受一个电子, 就可以转变为 , 例如: 某些生物分子 甘油醛、还原性核黄素、肾上腺素 2 O ?? ) 等氧化时可产生. 在氧的代谢反应中常有酶促氧化与还原, 表明有些酶促反应可能有的产 O 2 O 2 ( ) 生, 例如: 在黄嘌呤氧化酶的催化下, 黄嘌呤 或次黄嘌呤氧化为尿酸, 在此过程中, 大部分得 O 2 ?? 到二个电子, 但有少量可得到一个电子而成为2 . 生物体内的超氧阴离子自由基2 的氧化能 O 2 O O ? 力很强, 大量的研究表明, 可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类发生氧化, 与机体的许多功 2 O 〔1, 3〕() 能障碍和疾病的发生 如: 吞噬、解毒、炎症、衰老、肿瘤、辐射损伤等有着密切的关系. () 我们用二甲基亚砜2氢氧化钠2氧2鲁米诺 DM SO 2N aO H 2O 2 2L um ino l化学发光体系产生超氧 4〕〔?阴离子自由基, 在体系 值为 8. 6 的最佳发光条件下, 用化学发光法来检测超氧阴离子自 O 2 pH ?? 由基, 发现山梨酸钾还具有清除超氧阴离子自由基的作用, 随着山梨酸钾浓度的增加, 清除 O 2 O 2 作用也逐渐增强, 给出了定量的清除率. 1 222化学发光体系 DM SO N aO H O 2 L um ino l ?() 二甲基亚砜 和氢氧化钠在有氧条件下发生反应, 产生超氧阴离子自由基 , 反应方 2 DM SO O 程式为 - r) ( ) ( 2 CH SO + 2O H + 3O 2CH SOO H + CH + 2O 1 3 2 2 2 3 3 ? 如果体系中有化学发光剂鲁米诺, 超氧阴离子自由基就会激发鲁米诺, 使其由基态 跃迁至 O E 1 2 激发态 , 当其由激发态自动返回基态时, 就产生自发辐射, 形成化学发光 如图 1 所示. , E 2 C E ? 如果体系中的鲁米诺过量, 可以认为化学发光强度正比于2 的数量, 因此可通过检测化学发 O ? ? 光值的大小来判别体系中所产生的的多少. 可以用此化学发光体系来研究山梨酸钾对的 2 2 O O ?清除作用, 如果山梨酸钾能清除, 即可抑制鲁米诺的化学发光, 根据化学发光强度的变化可定 O 2 ? 量测出山梨酸钾对超氧阴离子自由基的清除率. 2 O 2 反应体系最佳 值的确定 p H 测量仪器为美国 公司的液闪分析谱仪 2000, 采用单光子计数方式. P ack a rd CA ( ) 实验表明, 本反应体系的 值对化学发光强度有明显的影响. 由化学反应方程式 1可知,pH () 和反应量 摩尔数的比值是 1?1. 因此, 在保持和反应量为 1?1 的 DM SO N aO H DM SO N aO H 情况下, 通过改变反应体系的 值, 可测出化学发光强度与体系 值之间的关系曲线, 如图 2 所 pH pH 示. ? 超氧阴离子自由基激发鲁米诺产生化学 图 1O 2 发光 图 2 体系 值对化学发光强度的影响 pH . 2 1 F igInf luence o f pH va lue o n ch em ilum ine scence C h em ilum ine scence o f L um ino l exc ited by F ig. ? 2 O 从图中可以看出, 值在 6. 0, 10. 0 之间变动时, 发光强度有明显的变化, 发光强度在 值 pH pH 为 8. 6 时取极大值. 根据这一结果, 本实验采用 值为 8. 6 的硼砂2盐酸缓冲液. pH 3 试剂的配制 3. 1 硼砂2盐酸缓冲液 4. 7 硼砂, 1. 12 盐酸, 用三蒸水稀释至 1 000 , 即得 值为 8. 6 的硼砂2盐酸缓冲液.g m l m lpH 3. 2 二甲基亚砜溶液 取 14 的二甲基亚砜溶液 10 , 用三蒸水稀释至 100 , 即得 1. 4 的二甲基亚ƒƒm o lL m lm lm o lL 砜溶液. 3. 3 氢氧化钠溶液 用三蒸水将配制成 0. 1 ƒ的溶液.N aO H m o lL 3. 4 鲁米诺溶液 - 2 将 0. 17 的鲁米诺溶于 0. 1 ƒ的溶液 100 中, 制成 1×10ƒ的鲁米诺溶 g m o lL N aO H m l m o lL - 4 液. 检测前用 值为 8. 6 的硼砂2盐酸缓冲液将其稀释为 4×10ƒ.pH m o lL 3. 5 山梨酸钾 () 山梨酸钾选用杭州三和食品助剂厂市售的成品 含量 98% , 质量 分别称 13736- 92, GB 取 0. 05, 0. 1, 0. 4, 0. 6 , 其在 12 体系溶液中的浓度分别为 4. 08, 8. 17, 32. 7, 49 ƒ.g m l m g mL 4 实验方法和结果 ) ) ((由于 1?1 摩尔数的和的完全反应需要有 1. 5?1 摩尔数的参与, 因此发 DM SO N aO H O 2 光体系产生的化学发光强度将随时间缓慢增加, 大约 30 之后发光曲线才开始逐渐趋向饱和. m in 为了缩短测量时间, 在检测前 30 , 在闪烁瓶中将 0. 1 的溶液 2 和 1. 4 ƒƒm in m o lL N aO H m l m o lL - 4 的二甲基亚砜溶液 14. 2 预先混合. 检测时, 再加入预先配置好的 4×10的鲁米诺溶液ƒΛl m o lL ) (( 10 用值为 8. 6 的硼砂2盐酸缓冲液稀释, 启动化学发光, 将瓶盖从紧固位置放松一圈 使空m l pH ) ) ( 气容易进入, 立即将闪烁瓶放入液闪分析谱仪检测, 发光值以 每分钟计数表示, 测量间隔C PM 0. 1 . 在动态发光曲线进入平坦的饱和区后, 连续检测 5 次, 取其平均值作为超氧阴离子自由基m in ? 激发鲁米诺发光的基底值 . 由于鲁米诺是按过量配制的, 可以认为体系的发光值正比于超氧 O 2 I 0 ? 阴离子自由基的数量. 2 O ? 测出超氧阴离子自由基激发鲁米诺发光 2 O 的基底值 之后, 立即在闪烁瓶中加入预先称好 I 0 的山梨酸钾, 快速摇动使其溶解, 马上用液闪分析 谱仪测量计数, 在动态发光曲线降至平缓区域后, 连续检测 5 次, 取其平均值作为山梨酸钾清除超 ? 氧阴离子自由基后体系的发光值 . 2 i O I ( 在 我们选用的发光体系中 1.ƒ的 4 L m o l 2 , 值 m lpH 14. 2 ƒ的, 0. 1 DM SO Λlm o lL N aO H- 4 ) 为 8. 6 的 4×10的鲁米诺 10 , 山梨 ƒm o lL m l ? 酸钾对超氧阴离子自由基的清除率 2 可通过O S 体系发光值的变化求出, 表示为 ? ) ()( S = I - I ƒI 2 0 i 0 图 3 对的清除率与山梨酸钾浓度的关系曲线 2 O ?由此得出的该体系中山梨酸钾对超氧阴离子自由 . 2 . 3v sco ncen t ra2T h e cu rve o f inh ib it io n o n O F ig ? 基的清除率与山梨酸钾浓度的关系曲线如图 2 O t io n s o f po ta ssium so rba te 3 所示. ? 可以看出, 山梨酸钾对超氧阴离子自由基有显著的清除作用, 在我们选用的体系中, 当山 2 O 梨酸钾的浓度为 4. 08 ƒ时, 清除率可达 12. 8% , 当山梨酸钾的浓度为 49 ƒ时, 清除率 m gmL m gm l 高达 77. 7% , 清除率随山梨酸钾浓度的增加而增加. 5 讨论 山梨酸钾作为一种高效、无毒的食品防腐剂, 在抑制和杀灭真菌方面有独特的功效, 但对其具有清除超氧阴离子自由基作用的研究尚未见到报道. 本文揭示了山梨酸钾具有清除超氧阴离子自 由基的作用, 并给出了一些定量的实验结果. 山梨酸钾对其它活性氧或自由基的作用以及作用机理 尚需进一步深入研究. 由于山梨酸钾正在逐步取代苯甲酸钠而广泛用于食品防腐、保鲜, 因此它对人体可能产生的作 用正成为人们日益关注的问题. 既然山梨酸钾具有清除超氧阴离子自由基的作用, 也许它在涉及到 〔5, 6〕自由基的疾病防治方面会有有益之处, 这一课题的进一步深入研究有一定的应用前景. 张子阳、孙宏振同志参加了部分实验工作. 6 参考文献 1 , 1987, 235, 520. . M a rx J LO xygen f ree rad ica ls link ed to m any d isea seS c ience 胡天喜. 发光分析与医学. 华东师范大学出版社, 1990. 51, 62 2 ( ) 胡天喜, 陈季武, 许建营等. 云芝糖肽和灵芝多糖清除活性氧的作用. 生物化学与生物物理学报, 1992, 24 5: 3 465 () 赵琢道, 黎鳌, 杨宗城等. 一种测定 活力的新方法. 生物化学与生物物理进展, 1987, 14 6: 55SOD 4 房克忠, 吴元德. 超氧阴离子自由基对细胞的转化作用. 见: 第四届全国自由基生物学与自由基医学学 N IH 3 T 3 5 术会议论文集. 海口: 中国生物物理学会, 1994. 236 刘珊林, 李莉, 廖贤平等. 体内抗氧自由基的代偿效应. 见: 第四届全国自由基生物学与自由基医学学术会议论 6 文集. 海口: 中国生物物理学会, 1994. 272 E ffec t s o f Po ta s s ium So rb a te ? o n Scaven g in g O 2 F ree R ad ica l 1 1 2 2 2,, ,, Y an g X in gyuW an g Y an ro n gC h en J in gzh en W an g Y u ch an gH u an g Yo n gm in g (1. , , 010021, , ;D ep a rtm en t of P hy s icsN e iM on g ol U n iv e rs ity H oh h otP R C )2. , , 010021, , T es t in g C en te rN e iM on g ol U n iv e rs ity H oh h otP R C () U sin g ch em ilum in e scen ce sy stem DM SO 2N aO H 2O 2 2L um ino l , u n de r th e op t im um lum i2 ? = 8. 6, . 2 n an ce co n d it io n s o f pH th e O f ree rad ica l is m ea su redT h e effec t o f po ta ssiumso rb a te o n ? . 2 2 th a t a lo n g w ith th e in c rea se o f co n cen t rascaven g in g O f ree rad ica l is fo u n dT h e re su lt s show ? , . 2 t io n s o f po ta ssium so rb a teth e effec t o n scaven g in g O a lso g radu a lly in c rea se sT h e qu an t ita t ivein h ib it io n is g iven. ? ?222 2 ch em ilum iKey word s po ta ssium so rb a te O 2 f reerad ica l DM SO N aO H O 2 L um ino l n e scen ce sy stem