DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤

DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方 法步骤 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,具亲水性,但不带电荷,是一种很好的电泳支持物。DNA 在碱性条件下(pH8 0的缓冲液)带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正极移动,不同DNA分子片段由于分子和构型不同,在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可分出不同的区带,达到分离、鉴定分子量,筛选重组子的目的。… 一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,具亲水性,但不带电荷,是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下(pH8.0的缓冲液)带负电荷,在电场中通过凝胶介质向正极移动,不同DNA分子片段由于分子和构型不同,在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物,经紫外线照射后,可分出不同的区带,达到分离、鉴定分子量,筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品, 四、器具及药品 电泳仪,电泳槽,紫外透射反射仪,恒温水浴锅,微波炉,微量进样器,三羟甲基氨基甲烷,盐酸,醋酸钠,EDTA,琼脂糖,溴酚蓝,溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净,晾干,用胶带将两端的开口封好,放在水平的工作台上,插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,(按0.3-1.5%的琼脂糖含量,1-25kb大小的DNA用1%的凝胶,20-100kb的DNA用0.5%的凝胶,200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶)置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液(loading buffer)按4:1混匀后,用微量移液器将混合液加到 样品槽中,每槽加10-20μl,样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至3-5V/cm,电泳1-3hr,当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时,停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶,放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min,即可在254nm的紫外灯下观察,有橙红色荧光条带的位置,即为DNA条带,或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂,操作时要小心,必须戴手套。 附: ⑴5×TBE(tris-硼酸及EDTA)缓冲液的配制(1000ml): Tris 54g,硼酸27.5g,0.5mol/L EDTA 20ml,将pH调到8.0,定容至1000ml,4℃冰箱保存,用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制: 0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液,4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制: 称取0.1g溴化乙锭,溶于10ml水,配成终浓度为10mg/ml的母液,4℃冰箱保存。染色时,吸取12.5μl的母液,加入250ml的水中,使其终浓度为0.5μg/ml,混合均匀。 ⑷100倍TE缓冲液的配制: 1mol/L Tris-HCl(pH8.0),100mmol/LEDTA 称取Tris121.1g,EDTA-Na237.23g,先用800ml双蒸水,加热搅拌溶解后,再用盐酸调pH 至8.0(大约加入盐酸20ml),然后定容至1000ml。 ⑸100倍电泳缓冲液的配制: 4mol/LTris-HCl(pH8..0),2mol/L醋酸钠,200mmol/L EDTA 称取Tris242.2g,无水乙酸钠82.03g,EDTA-Na237.23g,先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后,再用冰乙酸调pH至8.0(大约加入冰乙酸50ml),然后定容至500ml。用时稀释100倍。