12种小分子肽对大鼠离体黄体细胞孕酮生成的影响

12种小分子肽对大鼠离体黄体细胞孕酮生成的影响 12种小分子肽对大鼠离体黄体细胞孕酮生 成的影响 生矗与矗~(1992)12卷1期19~23责 Reprodu,ctlon&Contraception(1992)12(1):19,船 一 z, 12种小分子肽对大鼠离体黄体 细胞孕酮生成的影响? 赵玉莲倪江王晓宁程治平.??. (啥尔演医科大学生殖_内分泌研究室) 王德心鲁桂琛王遣功刘文关慕贞艮7?/ (中国医学科学院药物研究所? 用放射免疫分析法测定大鼠离体黄俸细胞孕酮含量,观察了人工合成的l2升小分子 肤对大最黄体细胞的影响.结果表明,Gly-Tyr-NI-I和Gly—Scr-Lys有抑制黄体细胞基 础孕酮分泌作用,迁抑+,FI~CG诱导的孕酮分泌;Lys-Tyr-NHz,Thr-S~r-Lys,Gly—Tyr “Lys抑制hCG诱导的孕酮分泌;(OITyf)?:Lys则增强基础器hCG诱导的亲用分泌I 其余6种小分子肤(Gly—Gly,Gly-D-Tyr.Tyr-D-Tyr,Thr-Ser-Tyr,Thr-Asn-Tyr- Thr~NH=,Tyr—Tyr-His-Lys-Ser),对大鼠黄体细胞孕矾分泌没有影响同盱讨论了其 构鼓关系及可能的作用机辛4..-? 关键词苎幽,塑,尘缀锰 酪氨酸具有抗hCG诱导孕酮分泌的作用 已经为很多实验所证实】.进一步的实验证 明在体内21种氨基酸中,除酪氧酸以外,墼 氨酸和苏氪酸也具有酪氯酸样的作用【5】.说明 氨基酸影响hCG致孕酮生成作用有一定选择 性.有趣的是,近年很多报道,在激素跨膜信 息传递过程中,蛋白质的磷酸化就发生在这三 种氪基酸残基上}另外,在筛选十几种酪氨酸 类似物时发现,甘氨酰一酪氯酸(Gly—Tyr)二肽 和酪胺酰胼的抗hCG致孕酮生成作用强于酪 氨酸l,这些都为探讨酪,丝,苏三种氨基酸 的作用机制以及考虑合成和筛选作用更强而又 无毒性的类似物开阏了思路本实验观察了以 酪氨酸,丝氧酸,苏氨酸为主体的人工合成,j, 分子肽对大鼠离体黄体细胞孕酮生成的影响. 材料与方法 一一 ,实骚动物一? 取未成年(25~28日龄)健康雌性Wistat大 鼠5O只,皮下注射孕马血清促性腺激素 (pI~sG)65:u/只,促使卵泡成熟发育.65h以. 后再皮下注射人绒毛膜促性腺激素(hCG) 35lu/只诱发超排卵.注hCG后7天断头处死 大鼠,取出双侧卵巢,此时卵巢内充满黄俸. =,细胞培养 . 黄体细胞悬浮液的制备参照以前的方 法”】.培养液为O.1牛血清白蛋白-Krebs— Eingex碳酸缓冲液~ICJEBGAL).培养的细胞数 ?本研究为国家科委七五重点科技攻关项目, 并受嗣家计生委基金资助 为L.5×10/rnl.在37?恒温水浴振荡器内 温育1h,使细胞功能达到稳定以后,向培 养管内分别加入实验试剂:1.对照组加等量 KRBGAL.2.酪氨酸Vyr(英国BDH公司产 品)0.2mM.3.hCG(Calbiochcm—Behring公 司产品)0.LIu.4.小分子肽(中国医学科学 院药物研究所合成)0.2mM.5.hCG0.rIU十 Tyr0.2mM或小分子肽0.2mM.6.hCG 0.1Iu,再分剐加不弱剂量的三种小分子肽, 终体积为lml.在上述培养条件下温育90. rain,取出后置A一25?冰箱终止反应留作测 定孕酮含量. 三,孕酮洲定l 用放射免疫测定法(RIA)坝i定样品中孕酮 含量.H一孕酮测定试剂盒哥卫生部上海告物, 制研壳所产品H一季酮放射活硅测走用 Beckman9800液体闪烁计数仪. 结果的统计学处理用t捡验. ,实验结果 一 ,12种人工合成小分子肤的简化结构 实验用12种人工合成小分子肽,其中有5 种二肽,4种三肽,1种四肽,2种五肽,它 们的简化结构如图L所示(只列出基本氨基酸 顺序厦功能基团).这些小肽的化学合成方面的 工作另有报道 :,l2种小分于肤对太鼠离体黄体细胞基 础孕萌分泌的影响 …..……一?.f…? .rht_t—t……ThrSLysMTvr- Se.巾vtThrSet:Tyr , 一……”??I1I…”„„幽…?粥鳓j l一,t……,GlyTyrLys…Tyr,l|j卜TyrHisLysSet ,u,一一.,”„翳?搠 „r~r-NHj…rAshTyr劝n—踟哪 2 N——1一=一L;=.()0伽啦 . 一曲,一 图1Tyr及小分子肽的结构 F_堰1Thestructureoftyro血lc d锄直?p印ti阳 初筛小分子肽对基础孕酮分泌的影响.结果见 表l.在合成的12种小分子肽中,二肽Gly— Ty.r-NH2和三肽G1y—Ser-Lys能够抑制黄体细 胞的基础孕酮生成.抑制率分别是33.4%和 19.8.而五肽(Gly—Tyr)Lys则提高基础 孕酮产生(22.3).其余小分子肽对基础孕酮 生成投有影响. 三,不同荆量的3种小分子肽对hCG致 孕酮生成作甩的影响 已知有3种小分子肽影响黄体细胞基础孕 酮分泌(表1),实验欲进一步了解小分子肽对 hCG致孕酮分泌的影响.首先选择了0.2mM 左右的4种剂量,随意在3种小肽中初试其对 hCG致孕酮生成作用的影响(图2).Thr—&r_ 寰1Tyr爰12种小分子肽对太?寓 体黄体细膪基磷孕一生成的彩? Table1EliotofTytand12newly synthesizedsmallpeptidesonbustl proKesteroneproductionbyrat Corpuslutealcells NotelP<0.5,?P<o.01vscontrol (三次实验结果) (Res~fltsfromthreeexperlments) ?21? Tyr和Tyr-Tyr-His—Lys-Ser2种小肤的剂量 反应曲线显示出剂量依赖趋势,至大剂量(1 raM)时才表现有统计学意义(P<O.O5)的影响. 三肽Thr—Ser—Lys在0.2mM时即表现出踞显 抑制hCG致孕酮生成的作用,且比0.5和lmM 对作用更强.综合孝虑酪氨酸的有效剂量及小 肽影响基础孕酮分泌的剂量,以后筛选小分子 肽生物活性实验中,均采用0.2m_M浓度t control0.02 , ThStTyrxTh~Ser-Lys口Tyr- Tyx-Hit-Lvs-.~t 图2三种小分子酞影响hOG致 孕酮生成作用的剂量反应曲线 Fig2Dose—re印?seeucof3smallp?d 013.hCG-induccdprogestm~neproductionbyCL cellsofrat. (三次实验结果) (Resul~fromthreeexperiments) ; 珥,l2种小分子肽对走鼠离体黄体?咆 hCG致乎酮生成作用的影响 如表2所示,在l2种小分子肽中,有5种 具有拇制hCG致孕酮生成作用的生物学活性. 其中Gly~er-Lys和Gty-Tyr-NH}2种小肽 的作用比酪氨酸还分别强25.和11.2.而 五肚(o】y一yr)=Lys增强hCG致孕酮生成 作用(t8.3). 讨论 近年陆续发现体内一些肽类物质参与多种 生理机能的调节.由2,3个氨基酸组成的小 分子肽直接调节生理功能也有报道.例如, Or嘧从牛松果腺提取出三肽scI, ?苫.8:.誊暮蛋:亘} 毯 ?22- 囊2Tyr麓12种小分子胩对太鼠离体黄体 细胞hCG致孕甯生成作用的影响 Table2EfleetofTyTand12new]y syntheslz酣sma]lpeptidesOI1hCG— inducedprogesteroneproduction byratCorpusluteelceils (2×10.?tool/L)M~SE(%ofhCG)changes() n0tc:1.hCG=0.1IU2.<0.05,”P~-.01, …P<0.O01vs.hCGgroup. (三次实验结果) (Resultsfromthreeexperiments) 现此三肽有抗促性腺激素及抗生育作用,曹泳 清等?报道着床前兔胚泡液中有几种特异的 小分子肽,在妊娠的免疫保护,稳定胚泡正常发 育,加强子宫功能分化等过程中有促进作用.更 有趣的报道是,猪卵巢中特另『J是妊娠时富含肽 链端解酶——三肽端解酶和二肽端解酶,水解 胶原蛋白N末端三肽或二肽,释放下来的三肽 或二肽还可以被进一步降解[1”.这些实验都说 明体内存在一些小分子肽物质,并且与调节机 体机能活动有关系.本实验以酪氧酸,丝氨酸, 苏氨酸的抗hCG致孕酮生成作用为线索,观察 人工合成的小分子肽对大鼠卵巢黄体细胞孕酮 分泌的影响.结果发现,在筛选的l2种小分子 肽中,有2种既抑制黄体细胞基础孕酮分泌, 又抑制hCG诱导的孕酮分l泌,3种只抑制hCG 诱导的孕酮分泌,而另外1种是增强基础及 hCG诱导的孕酮分泌,其余6种小分子肽对 大鼠黄体细胞孕酮分泌没有影响(表l表2?. 这些小分子肽作用的区别显然在于其化学组成 和空间构象的差异.初步舟析小分子肽的鲭构 与功能的关系(图1),发现z 1.除氨基末端和羧基末端以外,6种有效 小肽的共同特点是都具有一个氨基(-NH2)和 一 个羟基(---OH)基团,提示这两个功能基团是 生物活性的基本条件.在很多天然氨基酸和肽 中,其羧基末端或氨基末端被其它基团所取代, 这些取代基团都是生物活性所必需的?】.有报 道--COO?一一NH:形成的离子键对于一些肽类 激素作用于靶细胞的受l体部位起重要作用【I”. Gly-Tyr-NI~和Lys-Tyr-NH2的末端羧基被 一 NH:所取代以及其它有敢小放的碱性基团所 起的作用可能属于这种情况.., 同样具有0H和一NH|基团帕分枝状五肽 (Gly-Tyr)2=Lys的作用与其它5种小肽的作 用相反,提示此分枝状的立体结构在空间构幕 上形成不同于其它5种小肽的有效构型,反转 了抑制性作用. L_酪氨酸本身和Gly-Tyr具有抗 hCG致孕酮生成作用,而Gly—D_1?yr和Tyr- D-Tyr失去L一酪氨酸样的作用,说明酪氨酸 的绝对构型与其生物学活性关系密切,D型酪 氨酸没有生物学活妊. 3.虽然一OH是发挥生物学活性所必需的 功能基团,但增加-JOH的数量如Tyr,Set, Thr组合的三肽并无助于增加其活性,而是失 去了这几种氨基酸各自的作用.可能由于经肽 键结合作用以后,其邻近的—0H基团形成较弱 的氢键,相互缔合,破坏了话性基团的作用. 至于几种有效小肽对基础孕酮分泌~]hCG 致孕酮分泌的抑制性影响有所不同,提示其作 用机理不同.除了他们都依赖hCG发挥作 用以外,影响基础分泌的几种小肽可能还有其 自身途径.(Gly-Tyr);=Lys的作用似乎不依 赖于hCO. 小分子肽影响大鼠黄体细胞孕酮分泌的机 理还不清楚.下一步的工作准备从小分子肽对 第二信使,蛋白质合成,孕酮代谢酶等的影响 探讨其可能的作用途径. 参考文献 [1]赵白鸽等;酪氨酸对大鼠离体卵泡细胞孕 酮,雌激素和cAMP生成的影响.生殖与 避孕2(1):23,1982 [2]马青年等:小鼠卵巢对酪氨酸的摄取与酪 氨酸抗b.CG致孕酮生成作用.动物学报50 (2):126,1984 [8]姜良等:酪氨酸对兔眼前房移植卵巢beg 谤发孕酮分泌的影响.生殖与避孕B(11): 33,1986 [1]王启发等;酪氨酸对hCG诱导兔离体卵抱 蛋白质及RNA合成的影响.动物学报52 (2):106,1986 [5]张持等:二十一种氨基酸对hCG致大鼠 黄体细胞孕酮生成作用的影响.生理学报 40(3):299,1988. [6]WangXiao-ningetal:Effectsoftyro- ?23? sineanditsanaloguesonhCG—induced progesteroneprodue~onbyratCOrp~ISIU- 岫mvitro.ChinMedJ,100(11):859: lg87 C7]赵玉莲等:表皮生长因子,肾上腺素及前 列腺素对大鼠离体黄体细胞孕酮分泌的 影响.生理科学,9(5):281,1989 [8]Orts:Peptidecompoundsandeomposi- dons.UnitedStatesPatent[1g]4.163. 011.Ju】.31,1979 [9]曹弥清等兔胚泡小分子肽的生物功能研 究.中国科学,B辑9:928,1989 [10]McDonaldJK:Partialpurificationand characterizationofanovariantripepti- dylpeptidase:alysosomalexopeptidIse thatsequentUyreleasescollagen-re- lated(Gly-Pro-X)triplets.Bioehem BiophysResCommun.126(1):68.1985 [11”/KisllukRL:Aminoacids,peptldes,and proteins.?mprincipIcofMedicalChemis- tryedbyFoyeWo.2nd司,P618. Hez~ryKimptonLondon,1981 (109o年8月9日收稿) EffectofSyntheticSmallPeptidesonProgesteroneProduction byRatCorpusLutealCells ZhaoYu-lian,eta1. . (De珊时m删loIReprod|?c”0,landEmloer~nology,HarbtnMedicatUniversity) WangDe-xin,eta1. (Instituteo,MateriaMedicaJcJ.Aeede~yMedicalSeneca) Theeffectsof12synthetic.smalltoeptidesonprogesterone(P)productionincorpuslu? tealeelIswP-J~investigatedbyRIA.TlresultsshowedthatOly-Tyr-NH2and Oly-Ser-LysinhibitedbothbasalandhCO—induced(P)production,Ly吕_Ty卜N.Thr-Ser LysandGly—Ty卜Ly目decreasedonlyhCO-induced(P)productiont(Oly_1r)t=Lysenhan- cedbasa1aswellashCG—induced(P)production,andtheOtheI*S(Oly--Gly,,Gly-I~Tyr, Thr-Ser-Tyr,Thr-Asn-Tyr-Thr—NH2,Tyr=Tyr~His--Lys~-Ser)exhibitedlidsignificant influenceoH(P)productionbyratlutealcell=.Thestructure-bioactivityrelationship wasalsodiscussed. Keyword.,CorpmL咖ICeil=.PrqIeltM..Smtil~idc=